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Nat Commun|DIA 蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)常用軟件和分析工作流程的基準(zhǔn)測試

時(shí)間：2023-06-07 來源： 瀏覽：

Nat Commun|DIA 蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)常用軟件和分析工作流程的基準(zhǔn)測試

zhanghanqing 靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與藥物研發(fā)
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收錄于合集 #蛋白質(zhì)組學(xué) 15個(gè)
大家好，今天給大家分享一篇 202 3 年 1 月 發(fā)表在 Nature Communications 上題目 “Benchmarking commonly used software suites and analysis workflows for DIA proteomics and phosphoproteomics” 的研究論文。文章的通訊作者是來自 上海科技大學(xué) 的 水雯箐研究員 ， 水雯箐 課題組致力于運(yùn)用生物質(zhì)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等手段 進(jìn)行 新型配體發(fā)現(xiàn)與新藥物靶點(diǎn)的挖掘。
研究 概要 ：
研究人員建立了  DIA 基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集，模擬復(fù)雜背景下數(shù)千種蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)，在 Orbitrap 和 timsTOF 上 采集 。通過分析蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù) 以及 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，評估了四種常用的 DIA 軟件（ DIA-NN 、 Spectronaut 、 MaxDIA 和 Skyline ）。 研究結(jié)果提示  DIA-NN 和 Spectronaut 在分析 DIA 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)方面 具有 獨(dú)特優(yōu)勢。
研究結(jié)果一： DIA 基準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究人員 制備了小鼠腦膜蛋白，以規(guī)定的比例摻入酵母蛋白質(zhì)組背景中（圖 1a ）。每個(gè)基準(zhǔn)樣品都在五個(gè)過程重復(fù) 中 制備， DIA 模式下的 QE HF 和 diaPASEF 模式下的 timsTOF Pro （圖 1a ）。 同時(shí)， 構(gòu)建了三類庫以使用每種軟件工具進(jìn)行測試（圖 1b ）。使用 FragPipe 從原始 DDA 數(shù)據(jù)生成通用庫 。通過四種軟件工具對通用庫進(jìn)行的數(shù)據(jù)分析建立了相同的評估基線。 Spectronaut 、 MaxDIA 和 Skyline 允許使用集成搜索引擎處理 DDA 數(shù)據(jù)，以生成特定于軟件的 DDA 庫。總的來說，利用四個(gè)軟件與七個(gè)光譜庫（一個(gè)通用庫、三個(gè)特定軟件的 DDA 依賴庫和三個(gè) DDA 獨(dú)立庫）相結(jié)合，從而產(chǎn)生 10 種不同的數(shù)據(jù)分析工作流程（圖 1b ）。

Fig. 1 | Schematic of the benchmarking experiment and DIA data analysis
workflows.
研究結(jié)果 二 ： 蛋白質(zhì)組鑒定性能

使用  DIA-NN 、 Spectronaut 、 MaxDIA 和 Skyline （均為最新版本）來處理 HF 數(shù)據(jù)集。借助通用文庫， DIA-NN 、 Skyline 和 Spectronaut 產(chǎn)生了小鼠膜蛋白質(zhì)組（ 4919-5173 種蛋白質(zhì)），但 Skyline 的 FDR 控制不足。借助特定于軟件的 DDA 依賴庫， Spectronaut 報(bào)告 5354 種小鼠蛋白質(zhì)和 67,310 種肽獲得了最高的覆蓋率（圖 2a ）。當(dāng)使用計(jì)算機(jī)庫時(shí)， DIA-NN 通過報(bào)告 5186 種小鼠蛋白質(zhì)和 51,313 種肽實(shí)現(xiàn)了最佳識別性能（圖 2a ）。計(jì)算機(jī)庫的 DIA-NN 覆蓋了通用文庫本身鑒定的 94.3% 的蛋白質(zhì)。 DIA-NN 、 Spectronaut 和 MaxDIA 獲得了類似數(shù)量的每種蛋白質(zhì)的肽，但密度圖偏向 Skyline 的下端， Skyline 報(bào)告的肽鑒定最少（圖 2b ）。

研究結(jié)果 三： FDR 測試

研究人員 生成了一個(gè)預(yù)測的誘餌庫，該庫基于先前從擬南芥蛋白質(zhì)組中鑒定的肽 肽段 。將這個(gè)誘餌庫的增量部分（ 10% 、 20% 、 50% 和 100% ）附加到通用庫中以創(chuàng)建一系列目標(biāo)誘餌庫，不僅可以評估 FDR ，還可以評估假陰性率 (FNR) 蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。

計(jì)算了擬南芥蛋白質(zhì)或 肽段 在所有用目標(biāo)誘餌庫識別的蛋白質(zhì)或 肽段 中的百分比作為 FDR ，稱為錯(cuò)誤 ID 百分比。不控制蛋白質(zhì)水平的 FDR 。 DIA-NN 和 Spectronaut 在處理這兩個(gè)數(shù)據(jù)集時(shí)發(fā)揮了同樣充分的 FDR 控制（在蛋白質(zhì)和 肽段 水平上 <1.5% 和 0.32% ）， DIA-NN 適度地優(yōu)于 Spectronaut （圖 2g ）。當(dāng)通過添加誘餌庫的比例來擴(kuò)大搜索空間時(shí)， DIA-NN 始終如一地恢復(fù)了 >98.1% 的小鼠和酵母蛋白以及超過 96.4% 的 肽段 ，這些 肽段 最初僅通過通用庫從 HF 數(shù)據(jù)中識別出來（圖 2h ）。
 
Fig. 2 | Evaluation of proteome identification and FDR/FNR assessment.
研究結(jié)果 四： 生物環(huán)境中的 DIA 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

為了在細(xì)胞信號研究中評估 DIA-NN 和 Spectronaut ， 研究人員 進(jìn)行了 TNF-α 誘導(dǎo)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)，其中在不存在或存在 I-kappa-B 激酶抑制劑 TPCA 的情況下用 TNF-α 刺激 MCF-7 細(xì)胞 -1 （圖 5a ）。然后，在 QE HF-X 和 timsTOF Pro 儀器上獲取每個(gè)重復(fù)的 DIA 和 DDA 數(shù)據(jù)。 DIA 數(shù)據(jù)集由兩個(gè)軟件工具處理，使用項(xiàng)目特定的 DDA 庫或獨(dú)立于 DDA 的庫（圖 5a ）。

 

Fig. 5 | Comparison of DIA-NN and Spectronaut in TNF-α-induced phosphoproteomedata
analysis.
考慮到 TNF-α 誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后選擇了上調(diào)的磷酸化位點(diǎn)（ >1.5 倍變化， p < 0.05 ）來評估對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)獲得多少的生物學(xué)洞察力。在 HF-X 數(shù)據(jù)分析中，特定 DDA 庫的 DIA-NN 產(chǎn)生了最多數(shù)量的上調(diào)位點(diǎn)（ 183 個(gè)），而在 TIMS 數(shù)據(jù)分析中， Spectronaut 在 directDIA 庫產(chǎn)生了最多數(shù)量（ 254 個(gè)） 。基于 TNF-α 誘導(dǎo)位點(diǎn)的信號通路分析揭示了每個(gè)分析工作流程概括已知 TNF-α 信號網(wǎng)絡(luò)的能力 （圖 5c ） 。
總結(jié)：

研究人員對 DIA 系統(tǒng)全面性的評估提示在進(jìn)行 DIA 數(shù)據(jù)分析時(shí) DIA-NN 和 Spectronaut 表現(xiàn)尤為出色。 蛋白質(zhì)組學(xué)基準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析中， Spectronaut 使用通用或 DDA 依賴庫的蛋白質(zhì)鑒定略多，但 同樣  DIA-NN 使用 DDA 獨(dú)立庫產(chǎn)生了更高的蛋白質(zhì)組覆蓋率。此外， DIA-NN 在 FDR/FNR 控制、量化準(zhǔn)確性和精確度以及 DEP 檢測的靈敏度和特異性方面比 Spectronaut 表現(xiàn)更好。

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