江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2013年第41卷第1期245勉,翁海波,李萍萍,等.作物秸稈實(shí)驗(yàn)室條件發(fā)酵制乙醇研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(1):245-246作物秸稈實(shí)驗(yàn)室條件發(fā)酵制乙醇研究覃勉,翁海波,李萍萍,孫武舉,晉果果(鄭州大學(xué)生物工程系河南鄭州450001)摘要:利用具有高效產(chǎn)酶的菌株土曲霉M對(duì)作為底物的3種秸稈進(jìn)行固體發(fā)酵研究探討秸稈種類(lèi)顆粒度、濕度、生長(zhǎng)時(shí)間4個(gè)條件對(duì)產(chǎn)酶發(fā)酵過(guò)程的影響。結(jié)果表明,產(chǎn)酶發(fā)酵最適合的工藝是顆粒度為0.8mm的芝麻秸稈,濕度80%,產(chǎn)酶生產(chǎn)時(shí)間是7d,最適反應(yīng)條件下乙醇產(chǎn)量為23.56mg/g關(guān)鍵詞:秸稈;固體發(fā)酵;纖維素乙醇;土曲霉Ml1;工藝條件中圖分類(lèi)號(hào):TQ923文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1002-1302(2013)01-0245-02我國(guó)是個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó),農(nóng)作物資源十分豐富。作為糧食的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200g煮水,加入葡萄副產(chǎn)物,秸稈的處理方式通常是焚燒。每年處理秸稈時(shí)產(chǎn)生糖20.0g瓊脂15.0g,加水至1000mL混勻?；A(chǔ)鹽溶液的氣體,不僅污染了環(huán)境還對(duì)農(nóng)村生態(tài)環(huán)境造成了破壞。MO4·7H2O0.5g,CaCl20.5g,KH2PO43.0g,(NH)2SO秸稈的主要成分是纖維素。纖維素是植物通過(guò)光合作用轉(zhuǎn)化3.5gpH值3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液1000mL。糖化發(fā)能量的主要載體,是重要的生物能資源,也是地球上資源量最酵培養(yǎng)基:蛋白胨5.0g,NH4C12.0g,KH2PO41.0g,豐富的可再生資源。若僅將秸稈作為燃料,對(duì)其能源的利用MgSO4·7H2O,pH值4.8的檸檬酸鈉的緩沖溶液1000mL。率僅在10%左右近89%的能量被白白損失2。用秸稈生產(chǎn)酵母培養(yǎng)基:酵母膏10g,蛋白粉20g,葡萄糖20g,蒸餾水燃料乙醇可以大大提高其能源利用率,為解決能源危機(jī)提供90mL,瓊脂20g(固體)。所用培養(yǎng)基均在10Pa下滅菌了更為理想的方法。20 mi采用生物技術(shù)生產(chǎn)秸稈纖維素乙醇,首先是利用纖維素1.3儀器酶將秸稈中的纖維素降解成還原糖,然后進(jìn)行生物發(fā)酵生產(chǎn)烘箱,粉碎機(jī),血球計(jì)數(shù)板,超凈工作臺(tái),培養(yǎng)箱,恒溫?fù)u乙醇。用以處理秸稈的纖維素酶,也是廣泛應(yīng)用于食品、飼床,pH計(jì),722W微機(jī)型分光光度計(jì)料、造紙紡織工業(yè)的一種重要的生物制劑。纖維素酶的1.4方法生產(chǎn),是所有纖維原料生物轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是成本最高試驗(yàn)流程:秸稈處理粉碎→蒸煮殺菌→接種產(chǎn)酶及酶處的一個(gè)部分。研究表明,使用固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)纖維素酶,如理→乙醇發(fā)酵→燃料乙醇用秸稈等纖維原料直接生產(chǎn)纖維素酶,可以有效減少生產(chǎn)成1.4.1秸稈處理收集作物秸稈,沖洗,晾干,放入干燥箱中本。本研究采用筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定的土曲霉充分烘干,便于粉碎。使用農(nóng)業(yè)秸稈粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎轉(zhuǎn)速菌株M11,它具有高效降解纖維素的活性,在實(shí)驗(yàn)室條件下,1000m/min,粉碎的顆粒直徑分別為1.5、0.8、0.5mm。稱(chēng)使用固態(tài)發(fā)酵法,對(duì)同時(shí)作為產(chǎn)酶底物和纖維素原料的幾種取不同顆粒度秸稈原料,以20g為單位,加入基礎(chǔ)鹽溶液培秸稈原料進(jìn)行研究摸索新型的乙醇發(fā)酵方式旨在為利用秸養(yǎng)基,在10Pa壓力下高壓蒸汽滅菌。稈為原料工業(yè)化生產(chǎn)乙醇提供依據(jù)。將土曲霉Ml接種在PDA培養(yǎng)基上,45℃培養(yǎng)7d使之形1材料與方法成成熟孢子。用5m滅菌生理鹽水沖洗培養(yǎng)基收集孢子,并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)控制溶液中孢子含量為10-107個(gè)/m,1.1材料在鐵盤(pán)中裝入不同顆粒度的4種秸稈原料,每份25g。小麥秸稈和玉米秸稈采自河南省鄭州市溝趙鄉(xiāng)祥營(yíng)村,1.4.2產(chǎn)酶分解纖維素的正交試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)研究秸芝麻秸稈產(chǎn)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻試驗(yàn)基地。鄭州大學(xué)生稈種類(lèi)顆粒度、濕度、發(fā)酵時(shí)間等對(duì)纖維素分解成還原糖的物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取分離鑒定的土曲霉M1l菌影響,并選定最適宜因素組合。選擇上述不同因素的原因在株,具有耐高溫耐強(qiáng)酸的高效降解特性。酵母菌也是筆者所于:以秸稈為原材料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇的過(guò)程中接種在實(shí)驗(yàn)室分離的高效菌種。M11菌種須同步完成纖維素酶的生產(chǎn)和秸稈纖維素分解的1.2培養(yǎng)基過(guò)程。纖維素酶活性與土曲霉MIl菌種的生長(zhǎng)狀況直接相關(guān)。合適的濕度對(duì)于真菌生長(zhǎng)十分重要。不同顆粒度的秸稈收稿日期:2012-04-09底物,也會(huì)通過(guò)通氧量和含水量影響真菌的生長(zhǎng)狀況。為?；痦?xiàng)目:河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào):07210222000)。證土曲霉M1生長(zhǎng)良好,須選擇最適宜菌種生長(zhǎng)的底物種作者簡(jiǎn)介:覃勉(1987-),女,河南鄭州人,碩士研究生,從事微生類(lèi)、顆粒度、濕度。產(chǎn)酶處理時(shí)間的長(zhǎng)短也影響酶解纖維素生物與發(fā)酵研究。E-mail:qinnmian@126.com成還原糖的產(chǎn)量。還原糖的生成量將最終決定乙醇的產(chǎn)量通信作者:翁海波,博士副教授,從事微生物與發(fā)酵研究。E-ml:檢測(cè)還原糖量,也需研究菌種產(chǎn)酶發(fā)酵的最佳時(shí)間。正交試hbweng@gmail.com.驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。246江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2013年第41卷第1期1作物秸稈發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平表2作物秸稈發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析因素水平A:秸稈種類(lèi)B.顆粒度C:濕度D生長(zhǎng)時(shí)間試驗(yàn)號(hào)因素水平還原糖量A:秸稈種類(lèi)B:顆粒度C:濕度D:生長(zhǎng)時(shí)間(mg)玉米秸稈2小麥秸稈23218.8493芝麻秸稈1.4.3糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇試驗(yàn)正交試驗(yàn)完成后將培養(yǎng)基移23122331223114.4218.723人250mL三角瓶中,加入糖化培養(yǎng)基,在恒溫?fù)u床中以45℃13.674120r/min混合24h。對(duì)處理過(guò)的培養(yǎng)基進(jìn)行pH值測(cè)定將pH值調(diào)節(jié)為4.5,之后接種釀酒酵母發(fā)酵還原糖,密閉條件下37℃培養(yǎng)3d,測(cè)定乙醇產(chǎn)量。20.57916.54117.62016.17318.1231.4.4還原糖與乙醇測(cè)定使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與DNS溶15.60619.11719.95018.631液反應(yīng),540mm處檢測(cè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,繪出散k21.24316.65419.26716.點(diǎn)圖,擬合葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。正交試驗(yàn)結(jié)束后,各個(gè)樣品5.6372.4633.094995與糖化培養(yǎng)基混合24h,使用DNs法監(jiān)測(cè)各個(gè)試驗(yàn)樣品中的還原糖含量,并計(jì)算還原糖轉(zhuǎn)化率。取無(wú)水乙醇配制標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液,以不同濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液與重鉻酸鉀溶液反應(yīng),水08=00426x-01414浴后,測(cè)定600mm處吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值變化曲線,得出回歸方程。經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后,取上清液,測(cè)定在600mm處的吸光度,依照回歸方程計(jì)算樣品中乙醇的含量。2結(jié)果與分析2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線15葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。乙醇含量(%)圖2乙醉標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.074x+00883r=09926在此條件下,秸稈底物的纖維素酶解所得的還原糖濃度較高。目前,尚無(wú)對(duì)土曲霉作為產(chǎn)酶生產(chǎn)菌種底物的研究。相10比于小麥秸稈和玉米秸稈,以芝麻秸稈作為纖維素原料,可以產(chǎn)生較高濃度的還原糖,有進(jìn)行進(jìn)一步研究的價(jià)值250葡萄糖濃度(mg/m參考文獻(xiàn):圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[1]周肇秋,馬隆龍李海濱,等.中國(guó)稻殼資源狀況及其氣化/燃燒2.2正交試驗(yàn)結(jié)果發(fā)電前景[J].可再生能源,2004(6):7-9由表2可知影響還原糖產(chǎn)量的主次因素次序?yàn)榻斩挿N[2]黃琴賀稚非.纖維素類(lèi)物質(zhì)生產(chǎn)乙醇研究進(jìn)展[]糧食與類(lèi)>濕度>顆粒度>生長(zhǎng)時(shí)間。最佳工藝為A3B2C3D2,即采油脂,2008(5):8-10.用芝麻秸稈,顆粒度0.8mm,濕度80%,發(fā)酵時(shí)間為7d。土[3] Jung E d,LaoG, Inwin D,eta. DNA sequences and expression in曲霉MIl生長(zhǎng)的最佳濕度為80%,產(chǎn)酶發(fā)酵的最佳生長(zhǎng)時(shí)間Streptomyces lividans of an exoglucanase gene and an endoglucanase為7d,這與之前的研究結(jié)論相符合。采用最佳發(fā)酵條件對(duì)芝gene from Thermomonospora fusca[ J]. Appl Environ Microbiol麻秸稈進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵,獲得的還原糖量為29.08mg,還原糖93,59:3032-3043的產(chǎn)率約為0.291g/g[4]Bielefeld M, Hollenberg C P. Bacterial beta-lactamase is2.3乙醇含量測(cè)定creted in Saccharomyces cerevisiae under control of the invertase采用最佳發(fā)酵條件,對(duì)完成糖化發(fā)酵的芝麻樣品進(jìn)行乙signal sequenced[ J]. Curr Genet, 1992, 21: 365-268醇產(chǎn)量測(cè)定。使用重鉻酸鉀法測(cè)定乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如]劉淑華魯新潔張發(fā)群.固態(tài)纖維素酶曲的制備[打.微生物學(xué)通報(bào),1992,19(3):151-153圖2所示。對(duì)照?qǐng)D表,計(jì)算出芝麻秸稈轉(zhuǎn)化乙醇的產(chǎn)量為[6]Chahal P S, Chahal D S, Le G B B. Production of cellulase in23.56mg/gsolid-state fermentation with Trichoderma reesei MCG 80 on wheat3結(jié)論straw[J]. Appl Biochem Biotechnol, 1996, 57/58: 433-442[7 ]Sun T, Liu B H, Li Z H. Enhanced cellulase producton in fed-batch本研究結(jié)果表明,土曲霉M1l生產(chǎn)纖維素酶的最佳工藝solid state fermentation of Trichoderma viride SL-1[J]. Joumal of是芝麻秸稈,顆粒度08mm,濕度80%,最佳生長(zhǎng)時(shí)間為7d,Chemical Technology Biotechnology, 1997, 69: 429-432