山西醫(yī)藥雜志2012年7月幕41卷A Shanxi Med J. July 2012. vol 41. No. 7 the Second667著乙醇對(duì)腸黏膜屏障功能的影響及作用機(jī)制中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(11000)終靜王穎王炳元【摘要】目的探討乙醇對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障功能的影響及作用機(jī)制。方法將不同濃度的乙醇與腸上皮細(xì)胞株Caco2細(xì)胞共培養(yǎng)4h,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法及乳酸脫氫酶法(LDH)檢測(cè)細(xì)胞存活率。應(yīng)用Caco2細(xì)胞建立腸上皮細(xì)胞屏障模型,不同濃度乙醇溶液處理后,測(cè)定其跨上皮細(xì)胞電阻值(TEER)及熒光黃透過率的變化。應(yīng)用蛋白印跡法及免疫熒光染色法檢測(cè)緊密連接蛋白 occludin的表達(dá)和分布。結(jié)果乙醇濃度≤5%時(shí),不影響Caco2細(xì)胞的生存率。乙醇誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加,呈濃度時(shí)間依賴性;乙醇作用后,細(xì)胞膜上 occludin表達(dá)逐漸降低,60min時(shí)達(dá)最低值,細(xì)胞膜上呈點(diǎn)狀分布,此后部分可逐漸恢復(fù),趨勢(shì)與TEER值及熒光黃透過率一致。結(jié)論乙醇可破壞細(xì)胞間緊密連接蛋白,進(jìn)而誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加【關(guān)鍵詞】乙醇;跨上皮細(xì)胞電阻;緊密連接;Caco2細(xì)胞目前研究中關(guān)于乙醇致腸道通透性改變的病理培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24b后換上含不同濃度乙醇的培養(yǎng)液(1%機(jī)制很多,均認(rèn)為腸道通透性改變的根本原因在于25%5%7.5%、10%),每種濃度設(shè)6孔重復(fù),以不含乙腸道黏膜的損傷。完整的腸黏膜是防止細(xì)菌移位醇的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照,分組繼續(xù)培養(yǎng)4h后,每孔加人的基礎(chǔ)及主要屏障。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在給予添加乙醇飲MTT20μ(5g/L),溫浴4b,棄上清液,每孔加入DM食的大鼠中有腸道上皮細(xì)胞緊密連接的破壞,提0150L,室溫避光播床上充分振蕩10mi,混勻后以空示在乙醇誘導(dǎo)的腸道通透性改變中,腸黏膜上皮屏白孔調(diào)零,在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490mm波長(zhǎng)吸光度(A)值障遭到的破壞是可能的機(jī)制之一。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.3乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)法:本實(shí)驗(yàn)采用LDH試劑材料和方法盒檢測(cè)Caco2細(xì)胞經(jīng)不同乙醇濃度(1%、2.5%、5%1.1材料7.5%10%)作用4h后,細(xì)胞溶質(zhì)中LDH的釋放進(jìn)面評(píng)Caco2細(xì)胞株購自南京凱基生物有限公司,達(dá)氏修正估細(xì)胞的生存率依氏培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Hy1.2.4腸上皮細(xì)胞屏障通透性的檢測(cè):Caco2細(xì)胞形成單clone公司,四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國 Sigma公層上皮細(xì)胞屏障后,在 Transwell 2基底側(cè)加入不同濃度的乙甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司醇(1%2.5%5%),孵育不同時(shí)間(0、15、30、60、120、180occludin抗體購自北京博奧森公司、美國 Santa Cruz公司240min),觀察加人乙醇前后Caco2細(xì)胞TEER的變化情熒光黃購自美國 Sigma公司況,并測(cè)定加入乙醇后Caco2細(xì)胞對(duì)熒光黃透過率的改1.2方法變。每種實(shí)驗(yàn)均選取4組非同代細(xì)胞進(jìn)行。①TEER的測(cè)1.2.1體外腸上皮細(xì)胞屏障模型的建立:分化良好的Caco2細(xì)胞接種于 Trans-well板上(孔徑3pm,有效膜面積定:應(yīng)用細(xì)胞電阻儀(EVOM)測(cè)定加入乙醇前后Caco2細(xì)胞的TEER測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[1],為保證數(shù)值的準(zhǔn)確1.12cm2),接種密度為1×105/cm2,隔天換液( Transwell上層加入600L培養(yǎng)液下層加入1800μL培養(yǎng)液),倒置性,整個(gè)過程在恒定溫度下(37℃)進(jìn)行,每個(gè) Transwell均顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,同時(shí)測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻取不同方向的3個(gè)點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3次。②熒光黃透過率的(TEER)。約21~24d細(xì)胞形成緊密單層TEER明顯升檢測(cè):應(yīng)用熒光黃作為標(biāo)記物檢測(cè)乙醇對(duì)Caco2細(xì)胞細(xì)高,證明腸上皮細(xì)胞屏障形成胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。細(xì)胞用Hank平衡鹽溶液(HBSs)(pH1.22MTT比色實(shí)驗(yàn):將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用7.4)小心沖洗3次,37℃孵育30min,吸凈孔內(nèi)的HBSS以25%胰蛋白酶消化后以每孔1×10加入96孔培養(yǎng)板防止干擾;在 Transwell頂端加入408/mL熒光黃,37℃中,每孔體積10,置于37℃,體積分?jǐn)?shù)為5%C02的朝育1b后收集基底側(cè)液體,熒光分光度計(jì)下測(cè)定吸光度(激發(fā)波長(zhǎng)427nm,發(fā)射波長(zhǎng)536nm),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算熒光黃濃度基金項(xiàng)目:遼寧省科技廳高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目(2009A809)1.2.5蛋白印跡法檢測(cè)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá):當(dāng)Tran通信作者;王炳元,Email:wangby@medmail.com.cnswell小室的上室細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí),用含有0.1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液山西醫(yī)藥雜志2012年7月第41卷第7期下半月 Shanxi Med J,July2012,Vol.41,No.7 the second(PBS)沖洗,細(xì)胞鏟小心刮取細(xì)胞,倒人1mL裂解液A(2測(cè)結(jié)果提示(檢測(cè)時(shí)間4h),當(dāng)乙醇濃度≤5%時(shí),Caco2細(xì)mmo/ L EDTA,10mmol/L乙二醇雙醚四乙酸(EGTA),胞處理組生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.4%NaF,20mmol/ L Tis-Hcl,蛋白酶抑制劑混合物,苯0.05);當(dāng)乙醇濃度>5%時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨乙醇處理濃甲基磺酰氟(PMSF),1% Titon x100,pH7.5),4℃勻度升高而顯著升高,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<漿,離心,上清液為蛋白樣品液。加入抗 occludin抗體(1:0.05或P<0,01)。LDH試劑盒檢測(cè)結(jié)果提示(檢測(cè)時(shí)間4100),抗β肌動(dòng)蛋白抗體(1:5000,4℃孵育過夜,在羊h),當(dāng)乙醇濃度≤10%時(shí),Caco2細(xì)胞處理組生長(zhǎng)抑制率與抗兔辣根過氧化物標(biāo)記的IgG二抗中37℃孵育45min,化對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1學(xué)發(fā)光(ECL),X線片曝光、顯像,所得膠片用 Chemi Ima表1各組MTT比色法及LDH法檢測(cè)ger5500V3.0軟件掃描,通過 Fluor Chen2.0軟件進(jìn)行定細(xì)胞生存率(%)(x±s)量分析,測(cè)得A值組別醇MTT比色法LDH法1.2.6免疫熒光觀察緊密連接相關(guān)蛋白 occludin的表達(dá)照組00.0±1.0100.0±1,1和分布:依照不同的實(shí)驗(yàn)組,將生長(zhǎng)在蓋玻片上Caco2單1%乙醇組99.9士0.499.1±1.02.5%乙醇組9.9±0.9100.4±3.5層用4%的多聚甲醛固定30min,用0.5% Triton X-100透5%乙醇組99.5±4.299.2±1.9化5min,用5%牛血清白蛋白(BsA)封閉1h?？贵w稀釋7.5%乙醇組73.6±5.201,0士4.3度: occludin(1:60),陰性對(duì)照用0.01mol/LPBS代替一10%乙醇組48.3土3.498.6±士5.1抗,4℃孵育過夜。應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的熒2.2乙醇對(duì)Cac2細(xì)胞的屏障功能的作用:為了確定乙光二抗(1:100)孵育1h,避光操作甘油封片,熒光顯微鏡醇在不破壞Caco2細(xì)胞膜的情況下是否對(duì)細(xì)胞的屏障功觀察,采集圖像。能有直接的損傷作用,本實(shí)驗(yàn)觀察了乙醇對(duì)培養(yǎng)的Caco21.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理細(xì)胞緊密連接的作用。測(cè)定不同濃度乙醇對(duì)腸上皮細(xì)胞屏所有數(shù)據(jù)以王士s表示,2組間采用t檢驗(yàn),多組間比較障作用不同時(shí)間的TEER變化,見表2。檢測(cè)不同濃度乙采用重復(fù)測(cè)量的方差分析和 Bonferroni檢驗(yàn),P<0.05為醇作用不同時(shí)間的熒光黃透過率的變化,見表3,發(fā)現(xiàn)腸上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義皮屏障通透性增加,呈時(shí)間濃度依賴性,作用60min時(shí)2結(jié)果TEER值達(dá)最低值,熒光黃透過率達(dá)峰值,此后可逐漸恢2.1乙醇對(duì)Caco2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用:MTT比色法檢復(fù)2各組不同時(shí)間腸上皮細(xì)胞屏障通透性(TEER值)(x士s)n/cm215n1%乙醇組387.0±3.9372.7±3.4357.6±2.9348.7士4.0350.8士4.3361.2±4,8374,8±5.22.5%乙醇組3.9士4.8362.9士2.9348.13.3327.6士3.4346.5士5.23578士46372.7士4.45%乙醇組383.6士4.7348.9士2.9334.3±3.6311.9士5.6335.8±4.26.0±3.9370.2±4.4表3各組不同時(shí)間腸上皮細(xì)胞屏障通透性(熒光黃透過率)(%)(x±s)組別15 min30 min60 min20 min180 min240 min1%乙醇組0.99±0.258.00士1.0512.15±0.5214.50±0.3775士0.3710.75±0.328.50±0.472.5%乙醇組0.99±0.258.60士0.4914.20±0.3916.80±0.3614.30±0.4012.20±0.338.90士0.485%乙醇組0.99士0.259.00士0.3417.00士0.3719.80士0.4318.80士0.5114.90士0.369.30±0.282.3乙醇作用后腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白 occludin表蛋白的重分布:免疫熒光分析顯示,在未處理的細(xì)胞中,oc達(dá)水平顯著減低:通過前期研究,選擇不影響Caco2細(xì)胞 cludin位于細(xì)胞膜上,且呈連續(xù)性分布。乙醇處理60min生存率且明顯增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性為原則故選擇時(shí), occludin在細(xì)胞膜上表達(dá)水平降低,由細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)5%乙醇為作用濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,5%乙醇作內(nèi)轉(zhuǎn)移,部分?jǐn)嗔严?。乙醇處?80min時(shí),可見細(xì)胞膜用過程中, occludin表達(dá)水平逐漸降低,60min時(shí)達(dá)最低值,上 occludin蛋白表達(dá)部分恢復(fù)。此后逐漸恢復(fù).60min組 occludin 3白表達(dá)水平與其他各3討論組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1腸黏膜上皮屏障是構(gòu)成機(jī)體內(nèi)外環(huán)境之間的preludin一種機(jī)械保護(hù)作用的組織學(xué)屏障,在防止病原微生物從黏膜侵入方面有著非常重要的作用。腸黏膜12345678上皮屏障主要由兩部分組成,腸黏膜上皮細(xì)胞及其1:對(duì)照組;2:0min組;3:30min組;4:60min組;5:120min組;6:180min組;7:210min組;8:300min組周圍的緊密連接。緊密連接由相鄰細(xì)胞膜處各種圖1蛋白印跡法檢測(cè)各組 occludin蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的相互作用所構(gòu)成2,其中 occludin是最主2.4乙醇誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞屏障緊密連接相關(guān)蛋白 occludin要的跨膜蛋白。正常情況下,緊密連接通過調(diào)控作山西醫(yī)藥雜志2012年7月第41喜第7期下半月 Shanxi Med J,July2012.vol.41,No.7 the second·669用,選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)相應(yīng)物質(zhì)而有效地阻止腸腔內(nèi)峰值,此后逐漸恢復(fù)。通過蛋白印跡法及免疫熒光細(xì)菌、毒素及炎癥介質(zhì)等物質(zhì)的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)維持染色法檢測(cè)細(xì)胞間緊密連接蛋白 occludin表達(dá)水腸黏膜上皮屏障功能的完整平與TEER值及熒光黃透過率趨勢(shì)一致。FishSwanson等和Rao3報(bào)道乙醇可致腸上皮er證明了緊密連接與TEER直接相關(guān),更加支持屏障功能障礙,使小腸黏膜通透性增加。然而,腸我們的結(jié)論:乙醇可通過破壞Cac2細(xì)胞緊密連上皮屏障功能的改變是由于乙醇直接損傷腸黏膜接的完整性進(jìn)而增加腸上皮屏障通透性。細(xì)胞引起的還是損傷細(xì)胞間緊密連接所致有待進(jìn)綜上所述,乙醇濃度≤5%時(shí)可短暫性破壞細(xì)步詳細(xì)闡明。本實(shí)驗(yàn)首先通過MTT比色法及胞間緊密連接,導(dǎo)致腸黏膜屏障通透性增加;當(dāng)5%檢測(cè)LDH來評(píng)價(jià)乙醇對(duì)Caco2細(xì)胞生存率的影<乙醇濃度≤10%時(shí),可使腸上皮細(xì)胞發(fā)生脫落,響。MTT可被活細(xì)胞線粒體上琥珀酸脫氫酶轉(zhuǎn)化可能與細(xì)胞間緊密連接破壞程度較嚴(yán)重有關(guān)。上成藍(lán)紫色甲臢顆粒此顆粒被DMS溶解后用分光述具體機(jī)制很復(fù)雜,有待于進(jìn)一步研究。光度計(jì)測(cè)定出A值,A值的大小與活細(xì)胞數(shù)呈正參考文獻(xiàn)相關(guān)。我們?cè)贛TT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),乙醇濃度在不1] Schmitz H, Fromm M,Bnal,eta. Tumor necrosis fac-超過5%時(shí),與對(duì)照組相比細(xì)胞生存率影響差異無tor-alpha(TNF alpha) regulates the epithelial barrier in the統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),如超過5%時(shí),細(xì)胞首先human intestinal cell line HT-29/B6. J Cell Sci. 1991.12(P發(fā)生脫落,影響細(xì)胞生存率的檢測(cè)結(jié)果。而LDH[2] Anderson JM, van Itallie CM. Tight junctions and the mol試驗(yàn)是用紫外分光光度儀測(cè)定乳酸鹽的含量。因lar basis for regulation of paracellular permeability. Am J僅使用培養(yǎng)細(xì)胞的廢液來進(jìn)行,故不受細(xì)胞脫落、Physiol,1995,269:467-475漂浮等因素的影響。我們?cè)贚DH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),乙醇[3]鄒仲之,組織學(xué)與胚胎學(xué),6版北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:15-18濃度不超過10%與對(duì)照組相比細(xì)胞生存率影響差[4 Swanson G, Forsyth CB, Tang Y, et al. Role of intestinal ci異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。證實(shí)乙醇濃度≤5%dian genes in aleohohinduced gut leakiness, Alcohol Clin Exp時(shí)不影響細(xì)胞生存率;5%<乙醇濃度≤10%時(shí)Res2011,35(7);1305-1314Caco2細(xì)胞發(fā)生脫落而細(xì)胞未出現(xiàn)破裂而導(dǎo)致細(xì)5] Rao r. Endotoxemia and gut barrier dysfunction in alcoholic胞死亡,可能與細(xì)胞間緊密連接蛋白損傷嚴(yán)重程度liver disease. Hepatology, 2009, 50(2): 638-644較大有關(guān)。[6]成惠林,劉承基檢測(cè)細(xì)胞活性的MTT方法江蘇醫(yī)藥,1996,22(5):330-33通過前期試驗(yàn)乙醇濃度選擇5%,進(jìn)行后續(xù)實(shí)(7]Ftrs. Swaan PW, Eddington nd,el. The ethanol驗(yàn),檢測(cè)體外腸上皮屏障通透性。本實(shí)驗(yàn)中通過tabolite acetaldehyde increases para-cellular drug permeabilityTEER及熒光黃透過率來檢測(cè)腸上皮屏障通透性in vitro and oral bioavailability in vioo. J Pharmacol Exp TherTEER是檢測(cè)細(xì)胞屏障的指標(biāo),其值越大代表細(xì)2010,332(1):326333胞的屏障功能越好。而熒光黃透過率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腸(收稿日期:20120406)上皮屏障通透性,較TEER實(shí)驗(yàn)更準(zhǔn)確,不易受外作者簡(jiǎn)介:俸靜,女,1979年11月生,主治醫(yī)師,中國醫(yī)科大學(xué)附禹第一醫(yī)院,110001界因素影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙醇作用后,腸上皮屏障通透性增加,呈時(shí)間濃度依賴性,作用60mn時(shí)達(dá)