第25卷第4期中南林學(xué)院學(xué)報(bào)Vol. 25 No. 42005年8月JOURNAL OF CENTRAL SOUTH FORESTRY UNIVERSITYAug. 2005[文章編號(hào)] 1000- 2502(2005)04-0046- 04李品種的RAPD分析.黃曙光'，烏云塔娜2*，譚曉風(fēng)2.3(1.吉首大學(xué)師范學(xué)院生物系,湖南吉首416000; 2.中南林學(xué)院經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙410004;3.中南林學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙410004)[摘要]從96條S系列RAPD引物中篩選出能穩(wěn)定擴(kuò)增并具有多態(tài)性的13條引物,對(duì)25個(gè)李品種進(jìn)行了RAPD分析.結(jié)果表明，只用S17、S459和S1169等3條引物就能鑒別出所供試的25個(gè)李品種.利用PopGene軟件中的UPGMA方法對(duì)供試25個(gè)李品種進(jìn)行分子聚類分析,取LD=0.45,可將這25個(gè)李品種分為8類.[關(guān)鍵詞]李; 品種; RAPD;分子鑒別;分子分類[中圖分類號(hào)] S662. 3;Q523[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] ARAPD Analysis of Plum CultivarsHUANG Shu-guang'，WUYUN Ta-na', TAN Xiao feng2(1. Dept. of Biology, School of Normal, Jishou University, Jishou 416000，Hunan, China;2. The Key Lab. of Non- wood Forest Product of Forestry Ministry of CSFU, Changsha 410004. Hunan, China;3. School of Resources and Environment, Central South Forestry University, Changsha 410004, Hunan, China)Abstract: In this research 13 primers were selected from 96 random ones which could be success flly used for amplifying the DNA of25 plum cultivars and showing polymorphism. We could identify each cultivar by DNA fingerprints and the characteristic bands.Among them，the above- mentioned cultivars could be distinguished only with S17, S459 and S1169. In the same time 25 cultivarswere taken for cluster analysis by using the way of UPGMA and PopGene software, and when LD was 0. 45, the cultivars could beclassified into 8 categories.Key words : plum; cultivars; RAPD; molecular identification ; molecular classification李是薔薇科李屬PrunusL..植物,該屬大約有30余種,分布于北半球氣候溫和的地帶，其中我國(guó)有8種和4個(gè)變種,中國(guó)是李屬植物的起源中心和分布中心之一.中國(guó)李原產(chǎn)于我國(guó)長(zhǎng)江流域及西北一帶,是我國(guó)栽培最早的果樹之一,迄今已有3000年以上的栽培歷史.目前,我國(guó)栽培的李屬果樹有8個(gè)種,800多個(gè)品種,其中,主要栽培的有中國(guó)李、日本李、杏李、櫻桃李、美洲李和歐洲李6個(gè)種,約100多個(gè)品種[1~5].我國(guó)李資源豐富,分布范圍很廣,在北緯21°00'~7220'之間李都能正常生長(zhǎng)發(fā)育.但過(guò)去李栽培一直不被重視，管理粗放,產(chǎn)量低,質(zhì)量差,經(jīng)濟(jì)效益遠(yuǎn)比不上蘋果梨等大宗水果.近年來(lái),隨著人民生活水平的提高,對(duì)水果的多樣化的需要,帶動(dòng)了小水果生產(chǎn),尤其是國(guó)外優(yōu)質(zhì)李在國(guó)內(nèi)水果市場(chǎng).上賣價(jià)比蘋果、梨高出數(shù)倍的比價(jià)效應(yīng),更是刺激果農(nóng)發(fā)展李的步伐.近幾年來(lái),國(guó)外優(yōu)良李品種大量引入國(guó)內(nèi),加上國(guó)內(nèi)原有的品種，為李的發(fā)展提供了豐富的種質(zhì)資源,但也由此帶來(lái)苗木市場(chǎng)上的良莠混雜和品種不清的問題,特別是在國(guó)外李的引種栽培中,品種的命名比較混亂,同物異名現(xiàn)象十分嚴(yán)重6°].區(qū)| 中國(guó)煤化工態(tài)學(xué)方法外,近年來(lái)分子生物學(xué)的發(fā)展,特別是RAPD技術(shù)在品種鑒別和分類中的YHCNMHG統(tǒng)發(fā)育及資源保存提供了更為科學(xué)的依據(jù)[7.8].[收稿日期] 2005-05-27[基金項(xiàng)骨數(shù)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)工作項(xiàng)目“林木種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化整理、整合及共享試點(diǎn)”(編號(hào):2004BKA30400).[作者簡(jiǎn)介]黃曙光(1960- -),男,湖南吉首人,講師,農(nóng)學(xué)士.主要從事植物學(xué)教學(xué)和分子生物學(xué)科研.第4期黃曙光等:李品種的RAPD分析471材料與方法1.1材料實(shí)驗(yàn)于2003年3月~11月在中南林學(xué)院經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行.供試的25個(gè)品種(見表1)采自吉首市無(wú)毒果樹苗圃和中南林學(xué)院苗圃.1.2方法表125 個(gè)參試?yán)钇贩N及代號(hào)Table 1 Codes for 25 plum cultivars葉片DNA的提取采用改良的CTAP編號(hào)品種來(lái)源I編號(hào)來(lái)源編號(hào)來(lái)源法'9進(jìn)行,提取的DNA樣品經(jīng)核酸蛋白檢奧得羅達(dá)A116樂樂香B19李王測(cè)儀檢測(cè)濃度和純度達(dá)到要求后,置于奧李14 A| 1:安哥諾A2(奈李?yuàn)W李71 A|1玫瑰皇后A21美國(guó)大李-20C下保存?zhèn)溆?PCR擴(kuò)增采用15 μL大石早生B2) || 1:黑寶石A22蓋縣大李的反應(yīng)體系,其中包括: Taq酶(5 U●大石中生F藍(lán)寶石23衡山白糖李C早美麗| 15紫(黑)琥珀A24半苦李μL-1) 0. 15 μlL, MgCl2(25 mmol●L-I)總統(tǒng)皇家寶石A2麥李1.5 uL,10XPCR緩沖液1.12 uL, dNTP蜜斯李秋姬(10 mmol●LI) 1 μL,引物(16.5 ng●蘋果李3)|1先鋒uL-I) 1.3μL,模板DNA (10ng●μL-I)1)A表示為布朗李(美國(guó)為主)品種;2)B表示為日本品種;3)C表示為中國(guó)品種.1 pL,加入ddH2O使至終體積為15 pL. PCR試劑均購(gòu)自上海生工. PCR反應(yīng)在德國(guó)產(chǎn)9600型PCR儀上進(jìn)行.反應(yīng)程序參照程中平[8等:94 C變性2 min,36 C退火1 min, 72 C延伸2 min,1次循環(huán);94 C變性1 min,36 C退火1 min, 72 C延伸2 min ,40次循環(huán);94 C變性1 min,36 C退火1 min, 72 C延伸10 min,1次循環(huán).擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.4%的瓊脂糖凝膠上電泳分離,經(jīng)EB染色后,在美國(guó)產(chǎn)BIORAD凝膠光密成像掃描儀上觀察、照相,以2DNA酶切片段標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記為參照,確定各分子標(biāo)記的分子量大小.擴(kuò)增譜帶按有(1)和無(wú)(0)記錄，計(jì)算任意兩個(gè)品種的相似系數(shù),使用軟件PopGene32中的二倍體分析程序,采用UPGMA方法,對(duì)25個(gè)李品種進(jìn)行聚類分析.表2篩選引物的序 列2結(jié)果與分析Table 2 Alignment of selected primers引物名稱序列2.1 RAPD-PCR 擴(kuò)增.S17AGGGAACGAGS1168ACCCCCACACS21CAGGCCCTTCS1169GTGGTCCAGA從96個(gè)S系列的隨機(jī)引物中篩選出13個(gè)S51AGCGCCATTGS1172GTCTTACCCC引物(見表2),對(duì)供試的25個(gè)李品種進(jìn)行PCRS65GATGACCGCCS1173TGAAGCCCCT擴(kuò)增.結(jié)果表明,選中的13條引物均可擴(kuò)增出S167CAGCGACAAGS1178GTCGTCGACAS459GGTGCACGTTS1363GGCTGTGTGG譜帶大小在200~2300 bp之間的片段,并在供S1161AACTGGCCCC試的25個(gè)李品種間存在高度多態(tài)性,圖1是引物S1169的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA指紋圖.2.2李品種的分子 鑒別.所篩選的13種引物,對(duì)參試品種進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增后,得到了13張DNA指紋圖譜和154個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出條帶,其中多態(tài)性位M123456 7 8 9 1011 1213141516 M17 18192021223 M 2425點(diǎn)138個(gè),多態(tài)性達(dá)89. 61%,每個(gè)引物擴(kuò)增位圖1 S1169中國(guó)煤化工故字對(duì)應(yīng)品種編號(hào)見表1.M .點(diǎn)平均位11.85個(gè).代表NMHCNMHG表3是利用13種引物對(duì)25個(gè)供試?yán)钇贩NFig. 1 Amplification results of primer S1169 to the 25 plumcultivars (Numbers refer to the cultivars listed in table 1)的鑒別結(jié)果.由表3可以看出,每種引物均可鑒別出11~H舍號(hào)種,13種引物對(duì)25個(gè)供試?yán)钇贩N的分子鑒別效率在44%~84%之間.由表3還可知,篩選出.的任何-種引物均不能全部鑒定出所有的品種.選擇不同的引物組合,可以鑒別出所有的供試品種,其中只用中南林學(xué)院學(xué)報(bào)第25卷引物組合S17、S459和S1169就可以鑒別出所有的供試品種,這說(shuō)明分子鑒別的高效性和可用性.表3篩選的引物對(duì)25個(gè)李品種的鑒定結(jié)果Table 3 Identification results for the 25 plum cultivars by the selected primers引物可以鑒定的不能鑒定的鑒別效率不能鑒定的鑒 別效率品種的編號(hào)/91,5,7,8,9,10,12,13,1.4,5.6.7.8,9,10,2,3,11,14.S6515.16.17,18.19,20.2.3,11.14.24 .7:S167218.20,2421 ,22.23.2519,21,22.23,25 .1.2,4.5,6,7.8,9,1.3.4.6.7.8,9.10.2.5,11,17.S117311.12.13.14.15.17.3.10,16.18.24.2576S116112.13.14.15.19.20.24，;819,20,21 ,22.23,16,21,22,23,251.2.3.5.8.9.10,11.1.3.4.5.6,7 ,8.10，2,9,11,S45912,14,15.17,18,19,4.6,7,13,16,8(S116812,14,16,17,18，13,15,20,2520,21,22.23,24.2519,21,22,23,241,2,6,7,10,11,12，1,2,3.4,5.6,7,8.9,S1713,14.15.16,17,18，3,4,5.8.9,19.2072S116911,12,14,15,16,17.10,13,20,2121.22.23,24.2518.19,22.23.24.251,4,5.6.7.8,9，4,6.7.8,10,11，S2110.12.13.15.17.18.2,3,11.14,16.20S511.2.3.5.9.12.13,15.16.17.18，4414.19.21.24.2519,21 ,22 ,23,24,2520，22,23,2.4.5.6.7.8.9.10,1.4.5.6.7.8.9.10,S1172 .1,3.1,15,19,247S1 36311,13.16. 18, 19,2,3.12.14.12,13,14 16,17 ;18，11+13.16.18.19，15,17,21,24,20,21.22,23.2520,22.23.251.4,5.6.7.8,9,3,11,14,S117810,12.13+15，16,20,22.617,18,19,21.2324,252.3 聚類分析根據(jù)DNA擴(kuò)增結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析,得到這25個(gè)品種間的遺傳距離和相似系數(shù),其中遺傳距離為0.2432~0.8398,而相似系數(shù)在0.4545~0.7500之間.用遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析,構(gòu)建了25個(gè)品種的遺傳關(guān)系圖(見圖2).在LD=0.45處劃等值線,可以將參試品種劃分為8類:①奧得羅達(dá)、早美麗、李王、樂樂香、總統(tǒng)、蜜斯李、大石早生和大石中生;②玫瑰皇后、黑寶石、藍(lán)寶石、紫(黑)琥珀;③秋姬、蘋果李、蓋縣大李、衡山白糖李、美國(guó)大李和麥李;④安哥諾;⑤先鋒;⑥奈李;⑦半苦李;⑧皇家寶石、澳李14和澳李71.0.80.60.40.223162420181125232221917 13151412548710196 1李晶種編號(hào)圖225個(gè)李品種的RAPD聚類分析樹狀圖Fig. 2 Tree diagram for 25 plum cultiv中國(guó)煤化工第①類雖都屬于布朗李系列品種,但都具有中國(guó)基因、如CNMH和大石中生屬日本李品種,日本李是從中國(guó)引入的;蜜斯李是中國(guó)李與櫻桃李在新西三雜父育成;奧侍歹達(dá)1是由中國(guó)李和北美其他李雜交育成;總統(tǒng)則還含有歐洲李的基因.第②類的黑寶石是由美洲李Nubiana與來(lái)源不詳?shù)腉uviota雜交育成的,Nubiana是由中國(guó)李和美洲李雜交后代育成的11;玫瑰皇后由安皇后與圣玫瑰雜交而來(lái).紫(黑)琥珀是由黑寶石務(wù)移嫂暑后雜交而成，從聚類來(lái)看藍(lán)寶石與黑寶石有較為緊密的親緣關(guān)系.第③類都屬中國(guó)李,但秋.姬是在日本育成的,美國(guó)大李是在美國(guó)育成的.第④類的安哥諾和第⑤類的先鋒來(lái)自美國(guó),其親本不詳.第⑥類第4期黃曙光等:李品種的RAPD分析19奈李是中國(guó)李的一個(gè)變種.第⑦類半苦李為中國(guó)李原生的比較古老的品種.第⑧類澳李14、澳李71和皇家寶石也屬布朗李品種，但澳李14和澳李71是在澳大利亞育成,由于其含有中國(guó)李基因,通常又被劃為中國(guó)李品種6.4~16];而皇家寶石原產(chǎn)美國(guó),是否也含有中國(guó)李基因,有待進(jìn)一步研究,從聚類可以看出它們似乎都含有相似的國(guó)外李基因.半苦李果小、味苦澀,沒有商品價(jià)值,在當(dāng)?shù)靥幱诎胍吧鸂顟B(tài);奈李又是中國(guó)李的一個(gè)變種,它們各自成-類,沒有與其他中國(guó)李聚在一起,是因?yàn)樗鼈兊倪z傳差距過(guò)大的緣故.李王、大石早生等日本品種是在日本育成的,澳李14和澳李71是在澳大利亞育成，由于親本的長(zhǎng)期隔離或栽培育種途徑不同,其遺傳基礎(chǔ)與中國(guó)李的鄉(xiāng)土品種比較已發(fā)生了很大變化;至于它們也不能聚為一類,很可能與其育種材料不同有關(guān).其余品種主要為在美國(guó)育成的布朗李系列品種.布朗李系國(guó)外李的統(tǒng)稱,但在分子分類中卻不能聚為一類,這與布朗李品種的親緣關(guān)系和來(lái)源復(fù)雜有關(guān).就其親緣關(guān)系來(lái)說(shuō),它融入了中國(guó)李、日本李、歐洲李、美洲李、杏李或櫻桃李等的基因,是通過(guò)上述物種的自然雜交或人工雜交選育而成的.從上可以看出,李品種尤其是國(guó)外李品種雜交的親本來(lái)源十分復(fù)雜,至今仍不清楚，有待深入研究;但從本研究來(lái)看,有不少布朗李品種含有中國(guó)李的基因,尤其是日本品種與中國(guó)品種之間的親緣關(guān)系很近.3結(jié).論(1)本實(shí)驗(yàn)從96種隨機(jī)引物中篩選出13種多態(tài)型引物,可用于李品種的多態(tài)性研究和分子鑒別.(2)對(duì)25個(gè)李品種的RAPD分析結(jié)果表明,李品種間的遺傳多態(tài)性很高,達(dá)89.61%;并建立了這25個(gè)品種的指紋圖譜,用不同的引物組合、結(jié)合品種特征帶可以鑒別所有的參試品種,為李品種的登錄、分子分類和分子鑒別提供了-定的科學(xué)依據(jù).(3)根據(jù)RAPD分析結(jié)果對(duì)參試的25個(gè)品種進(jìn)行的聚類分析,聚類結(jié)果基本符合各品種之間的親緣關(guān)系,為這些品種進(jìn)-步遺傳改良提供了選配育種親本的依據(jù).[參考文獻(xiàn)][1]俞德浚.中國(guó)果樹分類學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1979.[2] 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