第19卷第2期化學(xué)反應(yīng)工程與工藝Vol 19, No 22003年6月Chemical Reaction Engineering and TechnologyJun，2003文章編號(hào): 1001 - 7631(2003)02 - 0129 - 06一種雙水相親和分配配基的制備過程優(yōu)化亞氨基二乙酸一聚乙二醇文禹擷，林東強(qiáng)，陸瑾，姚善涇(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程系，浙江杭州310027)摘要:考察了不同亞氨基二乙酸(IDA)取代度的亞氨基二乙酸一聚乙=醇(IDA- PEG)的制備,并進(jìn)行了條件優(yōu)化(BFs濃度,NaOH濃度.反應(yīng)時(shí)間,IDA結(jié)合條件等)。通過控制環(huán)氧氯丙烷與聚乙二醇的摩爾配比，得到了不同Cu( I )含量的固定化金屬親和配基:Cu(I )- IDA- PEG(A)(0. 24 molCu2+ /molPEG).Cu( 1 )-IDA- PEG (B)(0. 51 molCu2+ /molPEG) .Cu( I )- IDA- PEG(C) (0. 75molCu2+ /molPEG),并初步探討了固定化金屬親和配基的添加對(duì)PEG4000-(NH4)2SO,-H2O雙水相系統(tǒng)相圖的影響。關(guān)鍵詞:固定化金屬親和分配，亞氨基二乙酸- 聚乙二醇;雙水相系統(tǒng)中圖分類號(hào): Q819.文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A1前言固定化金屬離子親和層析(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)是-種高效分離蛋白質(zhì)的方法1.2] ,利用過渡金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)表面的富電子氨基酸殘基(如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等)的特異性相互作用可以達(dá)到親和分離的目的[3]。把金屬離子親和作用引入雙水相系統(tǒng),利用結(jié)合在成相聚合物上的金屬親和配基,可大大提高雙水相分配的選擇性。Birkenmeier 等[4利用PEG衍生物結(jié)合不同金屬離子,分離a2-巨球蛋白、過氧化物歧化酶和單克隆抗體等,結(jié)果表面固定化金屬離子親和分配對(duì)于分離蛋白質(zhì)很有潛力。Sivars 等5I利用含有金屬螯合聚合物(如Cu( I )-IDA-PEG和Cu(I)-IDA-葡聚糖)的表面活性劑/聚合物雙水相體系分離純化了輔酶Q、細(xì)胞色素,結(jié)果表明金屬親和分配可以有選擇性地分配含有聚組氨酸末端的膜蛋白,其分配系數(shù)從0.015增加到4.8。Maria等間利用金屬親和分配純化了粗大豆過氧化物酶,分配系數(shù)為24,酶收率達(dá)到64%。亞氨基二乙酸(IDA)是較強(qiáng)的金屬離子螯合劑,亞氨基二乙酸-聚乙=醇(IDA- PEG)則是雙水相分配中常見的固定金屬離子親和配基。通常,PEG上結(jié)合IDA需經(jīng)歷三步合成反應(yīng)5:(1)在氮?dú)猸h(huán)境中利用單甲氧基- PEG(M - PEG)與二氯亞砜反應(yīng)得到CI-M- PEG;(2)中間產(chǎn)物Cl一M- PEG與氨水反應(yīng)生成NH,- M一PEG;(3)NH2-M- PEG在堿性環(huán)境中與溴乙酸反應(yīng)生成IDA-PEG;該合成方法步驟繁雜,得率較低。借鑒Porat中國煤化工epharose.上結(jié)合IDA的方法,Pesliakas等[8報(bào)道了在水溶性聚合物上螯合YHCN MH GG與等量的環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)生環(huán)氧活化PEG,然后與IDA反應(yīng)生成IDA- PEG。Lin等9對(duì)此合成條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到了收稿日期:2002- -07 - 12;修訂日期:2002 -01-18.作者簡介:文禹擷(1978-),男,碩士研究生;姚善涇(1957-),男,教授,博士生導(dǎo)師,通訊聯(lián)系人?；痦?xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):20076042)130化學(xué)反應(yīng)工程與工藝2003年Cu( I )含量為0.5 molCu2+ /molPEG的Cu( I )-IDA- PEG。本工作沿用Lin等[9]的合成路線,對(duì)IDA- PEG制備方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化,主要對(duì)催化劑BF3濃度、NaOH用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)物初始配比、IDA結(jié)合條件等各種因素進(jìn)行考察,以期得到不同Cu2+含量金屬離子親和配基,并對(duì)PEG4000- (NH)2SO,-H2O雙水相系統(tǒng)中添加Cu( I )-IDA- PEG時(shí)的相圖變化進(jìn)行探討。2材料與方法2.1材料聚乙二醇(PEG ,浙江巨化集團(tuán)生產(chǎn)),平均分子量為4000(3500- 4500) ;亞氨基二乙酸(IDA,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);環(huán)氧氯丙烷(中國化學(xué)試劑站中心化工廠);硫酸銨、氫氧化鈉、甲醛、乙醚等其它試劑均為市購分析純。2.2實(shí)驗(yàn)部分2.2.1 Cu( I )- IDA-PEG的合成(1)PEG環(huán)氧活化采用 類似縮水甘油醚合成方法[10]。反應(yīng)包括2步:(a)無水酸性環(huán)境中,三氟化硼-乙醚催化環(huán)氧氯丙烷的環(huán)氧鍵開環(huán),與PEG上羥基反應(yīng)制得氯代PEG;(b)氯代PEG在氫氧化鈉作用下脫氯化氫生成環(huán)氧活化PEG。通過無水乙醚沉淀獲得環(huán)氧- PEG,得率一般為85%。(2)IDA的結(jié)合取 2mol/L的Na2CO3溶液,加入20倍于環(huán)氧- PEG摩爾數(shù)的亞氨基二乙酸溶解后,往其內(nèi)加入環(huán)氧-PEG。在65C下攪拌反應(yīng)24h,冷卻后,加入氯仿萃取2次,合并氯仿相加入無水Na2SO,脫水后,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干氯仿,在4C下無水乙醚沉淀獲得IDA- PEG。該合成過程得率為80%。(3)金屬離子的螯合取 20g CuSO。●5H2O溶于125mL 50mmol/L的乙酸鈉溶液(pH4.0),加.入25g IDA-PEG。室溫下攪拌1h后，用氯仿萃取2次,合并氯仿相,蒸干氯仿,4C下無水乙醚沉淀，烘干獲得21g Cu( I )-IDA- PEG。2.2.2 雙水相相圖測(cè)定稱取不同量的Cu( I )-IDA- PEG配基、PEG4000母液(40%w)、(NH)2SO,母液(40%w)和水于刻度離心管中,加蓋,上下倒置50次,充分混合后,離心(5000r/min)5min,20C水浴靜置24h,待相界面穩(wěn)定后,讀出上下相體積數(shù),分別移取上下相溶液分析(NH4)2SO,和PEG的濃度。2.2.3檢測(cè)方法環(huán)氧基含量測(cè)定采用鹵化季 銨鹽- -高氯酸法111.IDA含量測(cè)定采用 凱氏定氮法[12]Cu含量測(cè)定采用原子吸收光譜法硫酸銨測(cè)定采用 甲醛滴定法。利用甲醛與銨鹽作用生成等摩爾的硫酸,用NaOH滴定。該法測(cè)定硫酸銨，相對(duì)誤差為0.35%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚乙=醇的存在對(duì)甲醛法測(cè)定硫酸銨無影響。PEG含量測(cè)定稱取一 定量雙水相系統(tǒng)上下相樣品干65C直空干慢至恒重,從總干重減去中國煤化工(NH,)2SO,量,即得PEG量。該法測(cè)定混合液中PI25%。YHCNMHG3結(jié)果與討論3.1 環(huán)氧活化PEG的制備3.1.1BF。濃度及反應(yīng)時(shí)間的影響B(tài)F3催化環(huán)氧氯丙烷的環(huán)氧鍵斷裂,與PEG的羥基端結(jié)合,因而對(duì)環(huán)氧基取代度有著顯著的影第2期文禹擷等，，-種雙水相親和分配配基的制備過程優(yōu)化亞氨基二乙酸-聚乙二醇.131響。考察了室溫下、不同環(huán)氧氯丙烷與PEG配比時(shí),BF:濃度對(duì)環(huán)氧基取代度的影響。由圖1可見,隨BF3濃度的增加，環(huán)氧基取代度先增加后減小,對(duì)不同環(huán)氧氯丙烷與PEG的配比,BF3濃度在0.5%時(shí),環(huán)氧基取代度最高。進(jìn)-步考察了不同環(huán)氧氯丙烷與PEG配比(1.5: 1,2: 1, 2.5: 1),反應(yīng)時(shí)間的影響,結(jié)果表明:①對(duì)于不同反應(yīng)物配比,環(huán)氧取代度隨時(shí)間的變化規(guī)律基本類似,圖2給出.了配比為1.5:1時(shí)的反應(yīng)時(shí)間曲線;②隨著BF。濃度增加,初始反應(yīng)速度有所增大;③隨著反應(yīng)的進(jìn)行,環(huán)氧基取代度逐漸增加,在20h左右出現(xiàn)最大值，其后環(huán)氧基的取代度反而會(huì)降低,可能是由于交聯(lián)副反應(yīng)引起的。因此,在最佳的反應(yīng)條件(BF:濃度0.5%,反應(yīng)20h)下,環(huán)氧基取代度達(dá)到最高。0.81.00.6盈0.80.4).20 0.25 0.5 0.75 1 1.250l02030 40concentrtion of BF3.%reaction time/h圖1BF:濃度對(duì)環(huán)氧取代度的影響圖2反應(yīng)時(shí)間對(duì)環(huán)氧取代度的影響Fig 1 Effect of BFg Concentration on Epoxide YieldFig 2 Effect of Reaction Time on Epoxide Yield加2. 5mLNaOH(40% )/100mL后反應(yīng)5h,環(huán)氧氯丙烷加2. 5mLNaOH/(40%)100mL后反應(yīng)5h,環(huán)氧氯丙烷與PEG的摩爾配比:◆1.5: 1.■2: 1,▲2.5: 1與PEG的摩爾配比:1.5: 1,BF3 的濃度:◆0. 25%，I ■0.5%,▲0.75%3.1.2氫氧化 鈉濃度及反應(yīng)時(shí)間的影響:氫氧化鈉使得氯代PEG脫氯化氫形成環(huán)氧鍵,因而直接影響了環(huán)氧基取代度。圖3給出了環(huán)氧氯丙烷與PEG的初始摩爾配比分別為1.5: 1,2: 1,2.5: 1時(shí),加入0.5%BF3反應(yīng)20h后,氫氧化鈉用量的影響。結(jié)果表明:氫氧化鈉的用量太低不利于環(huán)氧鍵的生成;當(dāng)40%(w)氫氧化鈉的用量達(dá)到2.5mL/100mL反應(yīng)液時(shí),環(huán)氧基取代度基本達(dá)到最大,繼續(xù)增加氫氧化鈉的用量,對(duì)環(huán)氧取代度影響不大。1.2 |1 0.8冒0.st冒.2 I34567volume of 40%(w/w) NaOH . mL/ 100mLtime after ndding Na0H/h中國煤化工圖3NaOH用量對(duì)環(huán)氧取代度的影響對(duì)環(huán)氧取代度的影響Fig 3 Effect of NaOH on Epoxide YieldCNMHGTimeonEpoxideYield加40%NaOH/100mL后反應(yīng)5h,環(huán)氧氯丙烷環(huán)氧氯丙烷與PEG的摩爾配比:1.5: 1,40%NaOH溶液與PEG的摩爾配比:◆1.5: 1,■2: 1,▲2.5: 1加入量:◆1.5,■2,▲2.5mL/ 100mL加入氫氧化鈉后的反應(yīng)時(shí)間同樣影響著環(huán)氧取代度的高低。對(duì)不同的環(huán)氧氯丙烷與PEG初始摩爾配比,加入0.5%BF:反應(yīng)20h后,環(huán)氧基取代度隨著與氫氧化鈉反應(yīng)時(shí)間的延長而增大,在5h左.右達(dá)到最大;但是反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行,取代度稍有下降。圖4給出了環(huán)氧氯丙烷與PEG的初始摩爾配比為132化學(xué)反應(yīng)工程與工藝2003年1.5: 1,40% (w)氫氧化鈉的用量分別是1.5mL/ 100mL ,2mL/ 100mL,2.5mL/100mL的情況。該反應(yīng)步驟要求溫度控制在20C以下。3.1.3環(huán)氧氯丙烷與PEG配比的影響結(jié)果如圖5所示，在最佳的反應(yīng)條件下,環(huán)氧取代度基本上同環(huán)氧氯丙烷與PEG的摩爾配比呈線形相關(guān)，因而可通過控制環(huán)氧氯丙烷與PEG的摩爾配比制得不同環(huán)氧取代度的環(huán)氧活化PEG。3.2 IDA- PEG的合成環(huán)氧活化PEG進(jìn)-步與金屬螯合劑IDA反應(yīng),可以制得IDA-PEG。IDA的用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間是該反應(yīng)過程的關(guān)鍵因素。圖6表示IDA用量對(duì)IDA結(jié)合密度的影響。由圖可以看出IDA的結(jié)合密度隨IDA用量的增加而增大。當(dāng)IDA/PEG的摩爾比達(dá)到20時(shí),IDA的結(jié)合密度基本達(dá)到最大，此后隨IDA用量的增加影響不大。圖7表示反應(yīng)溫度對(duì)IDA結(jié)合密度的影響。隨著溫度的增加,IDA結(jié)合密度也增大,65C左右達(dá)到最大值,此后溫度升高,IDA結(jié)合密度略有下降，故適宜的反應(yīng)溫度為65C。圖8表示反應(yīng)時(shí)間對(duì)IDA結(jié)合密度的影響。從圖中看出,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,IDA結(jié)合密度增大,當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到20h后,IDA的結(jié)合密度變化很小。由此可得,IDA與環(huán)氧活化PEG的最佳反應(yīng)條件是2mol/L的Na2CO3溶液中,亞氨基二乙酸與環(huán)氧一PEG的摩爾配比為20,反應(yīng)溫度65C,反應(yīng)時(shí)間24h。11.0.80.6g飛040.2百020.000.5.52.51020304(mol mtio of epichirolydring : PBGmol ration oIDA : PEG圖5反應(yīng)物比例對(duì)環(huán)氧得率的影響圖6 IDA 濃度對(duì)IDA- -PEG制備的影響Fig 5 Effect of the Reactant Ratio .Fig 6 Effect of IDA Concentration onBF:濃度: 10. 50%IDA- PEG0.8 t香管o6冒040.4 t冒“I060128eaction temprature 1C中國煤化工/圖7反應(yīng)溫度對(duì)IDA-PEG制備的影響MHCN M H GA-PEG制備的影響Fig 7 Efect of Reaction Temprature on IDA- PEGFig 8 Effect of Reaction Time on IDA-PEG環(huán)氧氯丙烷與PEG的摩爾配比:◆1.5: 1環(huán)氧氯丙烷與PEG的摩爾配比:◆1.0: 1,■1.5: 13.3 Cu(I )的螯合結(jié)果如圖9所示,Cu2+含量基本上與IDA結(jié)合密度一致,Cu2+的螯合率能夠達(dá)到90%以上,說第2期文禹擷等，，-種雙水相親和分配配基的制備過程優(yōu)化亞氨基二乙酸-聚乙二醇.133明Cu2+和IDA--PEG螯合是比較容易進(jìn)行的。在最優(yōu)條件下,通過控制環(huán)氧氯丙烷與聚乙二醇的摩爾配比,可得到了不同Cu( I )含量的固定化金屬親和配基:Cu( I )-IDA-PEG (A) (0. 24 mol-Cu2+ /molPEG)、Cu( I )- IDA- PEG (B) (0. 51 molCu2+ /molPEG)、Cu( I )一IDA- PEG (C)(0.75molCu2+ /molPEG)。3.4 PEG-(NH,)2SO,- H2O雙水相系統(tǒng)相圖的影響測(cè)定了雙水相系統(tǒng)中10%的PEG被不同Cu2+含量的Cu(I)-IDA-PEG替代后對(duì)系統(tǒng)相圖的影響。結(jié)果如圖10所示,對(duì)于不同Cu( I )- IDA- PEG配基,相圖的差別非常小。說明在用Cu .(I)-IDA-PEG作為金屬螯合親和配基添加到雙水相系統(tǒng)中時(shí),可以忽略Cu(I)-IDA-PEG.的影響,直接用原系統(tǒng)的相圖。.0030}0.82S }0.6200.45t0020.00.5:11.0:1152(mo ratio of eiclorohydring : PEGsal(6/u),%圖9Cu(I)在IDA-PEG上的螯合量圖10 PEG4000/ (NHJ)2SO,/H2O相圖(20C)Fig 9 Content of Cu( I ) Combined .Fig 10 Phase Diagram forwith IDA- PEGPEG4000/(NH4)2SO,/H2O (20C)■IDA,OCu( 1 )聚合物組成:◆PEG,■Cu(I )-IDA- PEG(A).▲Cu( I )- IDA- PEG(C)4結(jié)論通過調(diào)節(jié)環(huán)氧氯丙烷與PEG的摩爾配比可以制備得到不同IDA取代度的IDA-PEG。環(huán)氧活化PEG的反應(yīng)條件為:室溫下BF3濃度0. 5%,反應(yīng)時(shí)間為20h ;40%(w)NaOH用量為2.5 mL/100mL,反應(yīng)時(shí)間5h。IDA與環(huán)氧活化PEG的優(yōu)化反應(yīng)條件: 2mol/LNa,CO3溶液中,IDA與環(huán)氧- PEG的摩爾配比為20,反應(yīng)溫度65C ,反應(yīng)時(shí)間24h。.在最優(yōu)條件下,通過控制環(huán)氧氯丙烷與聚乙二醇的摩爾配比,可得到了不同Cu(I)含量的固定化金屬親和配基:Cu( I )-IDA- PEG (A) (0. 24 molCu2+ /molPEG)、Cu( I )-IDA- PEG (B)(O.51 molCu2+ /molPEG).Cu( I )-IDA-PEG (C) (0. 75molCu2+ /molPEG)。雙水相系統(tǒng)相圖的初步考察結(jié)果表明,10%PEG被不同Cu2+含量的Cu(I)-IDA-PEG替代后對(duì)雙水相系統(tǒng)相圖的影響不大。中國煤化工MYHCNMH G參考文獻(xiàn):[1] Sulkowski E. 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It was found that the amount of copper( I ) on the immobilized metal ion affinity ligand is related to the molecular ratio of epichlorohydrin :to PEG in the synthesis process. Under optimal conditions, three affinity ligands of Cu( I )- IDA- PEG were prepared with different Cu ( I ) concentrations， 0. 24 mol/molPEG，0. 51 mol/molPEG，0. 75 mol/molPEG, respectively. The effect of the immobilized metal ion affinity ligandon the phase diagram of PEG4000- (NH)2SO4-H2O aqueous two- phase systems was discussed.Key words : immobilized metal ion affinity partitioning; iminodiacetic acid- polyethylene gly-col; aqueous two phase systems中國煤化工YHCNMH G