第38卷第3期水生生物學(xué)報Vol. 38. No. 32014年5月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAMay,2014doi:10.7541/2014.69乙醇消耗菌的分離鑒定及其對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響葛平平·2陳林1張維董慶喆劉天中呂雪峰(1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,生物燃料重點實驗室,青島266101;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京100049)摘要:為研究產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻培養(yǎng)液中的乙醇消耗菌污染情況及其對乙醇產(chǎn)量的影響,從污染的培養(yǎng)液中分離岀4株乙醇消耗菌,通過16SrNA、26 SrNA序列分析對分離岀的菌株進(jìn)行鑒定,并研究其乙醇消耗能力及對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明,分離岀的4株菌分別為紅酵母( Rhodotorulap)、季也蒙酵母( Meyerozyma guilliermondii)、短波單胞菌( Brevundimonas sp.)、微桿菌( Microbacterium sp.)。其中乙醇消耗能力最強的是紅酵母,乙醇比消耗速率達(dá)到391g(10-3cfud);其次為季也蒙酵母,乙醇比消耗速率為80.1g(10 cfu.d);短波單胞菌和微桿菌的乙醇比消耗速率遠(yuǎn)低于紅酵母和季也蒙酵母。將分離出的菌株與產(chǎn)乙醇集胞藻共培養(yǎng)πd后,污染紅酵母、季也蒙酵母、短波單胞菌、微杄菌的實驗組乙醇產(chǎn)量分別下降了53.8%、23.6%、40.7%、27.3%。4株菌對基因工程集胞藻的生長無明顯影響,均通過直接消耗乙醇而降低集胞藻的乙醇產(chǎn)量。關(guān)鍵詞:乙醇消耗菌;微生物污染;生物乙醇;基因工程集胞藻中圖分類號:Q949,22文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1000-3207(2014)03-0487-08生物乙醇是重要的生物液體燃料之一,可作為巴氏醋桿菌、門多薩假單胞菌等都可代謝乙醇61,汽油替代品或可再生交通燃料添加劑。應(yīng)用基因其中巴氏醋桿菌的乙醇消耗速率達(dá)到2.3mL/d。而工程藍(lán)藻直接利用太陽能和CO2一步法生物合成乙在管囊酵母2、釀酒酵母叫中,乙醇的合成代謝和醇具有獨特的優(yōu)勢,因此成為各界關(guān)注的熱點2分解代謝同時存在。如果污染了這些微生物,也可目前,用于生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻主要有聚球藻能嚴(yán)重影響乙醇產(chǎn)量。目前,關(guān)于微生物污染對基( Synechococcus sp.PCC7942)和集胞藻(Sme-因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響還未有報道。chocystis sp.PCC6803)3等,最高乙醇產(chǎn)量達(dá)到本研究從污染的產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻的培養(yǎng)5.5g冮,顯示出太陽能生物轉(zhuǎn)化直接合成乙醇的液中分離出4株乙醇消耗菌,評價各菌的乙醇消耗巨大潛力。然而,有研究表明基因工程集胞藻的乙能力以及對基因工程集胞藻的生長和乙醇產(chǎn)量的影醇產(chǎn)量很不穩(wěn)定,在培養(yǎng)后期培養(yǎng)液中的乙醇濃度響,并采用形態(tài)觀察和基因序列分析手段鑒定污染急劇下降5,因此研究確定影響乙醇產(chǎn)量穩(wěn)定性菌的種類,以期能為藍(lán)藻乙醇的培養(yǎng)工藝及污染控的因素對生產(chǎn)工藝的建立有重要意義。制提供理論參考。在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn),基因工程集胞藻在培養(yǎng)過程中易發(fā)生食藻生物和微生物污染,尤其是1材料與方法在放大培養(yǎng)階段這種污染尤為嚴(yán)重。食藻生物會吞1.1藻種及培養(yǎng)方法食藻細(xì)胞,使生物量迅速下降,從而降低乙醇產(chǎn)量。產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻 Synechocystis sp.PCC自然界中存在著多種能利用乙醇的微生物,例如醋6803Syn-zG25,由中國科學(xué)院青島生物能源與過酸菌、面包酵母、嗜有機甲基桿菌、枯草芽孢桿菌、程研究所構(gòu)建。集胞藻在250mL三角搖瓶(裝液收稿日期:2013-04-10;修訂日期:2013-12基金項目:國家高技術(shù)發(fā)展計劃(863)(2012AA052103)資助作者簡介:葛平平(1988),女,河北保定人;碩士研究生;主要從事生物化工TYH中國煤化工通信作者:陳林,Te:0532-80662737;E-mail:chenlin(@qibebt.ac.cnCNMHG488水生生物學(xué)報38卷量100mL)或直徑30mm的氣泡柱式光反應(yīng)器(裝液提取的基因組DNA為模板,用高保真aq酶進(jìn)行量200mL)中培養(yǎng),通入含5%CO2的空氣混合氣,PCR擴增。反應(yīng)條件為:95℃5min;94℃30s,55℃通氣速率(102)Lh,光強100μmol(m2s),培養(yǎng)溫1min,72℃lmin,34個循環(huán);72℃10min。PCR產(chǎn)物度(302)℃。培養(yǎng)基為BGlⅠ培養(yǎng)基,其中含用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗。目的基因片段克20mg/L壯觀霉素( Spectinomycin, Sigma)4隆:將PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒( Cycle-Pure Kit1.2乙醇消耗菌的分離純化美國 Omega公司)進(jìn)行純化,產(chǎn)物與pMDl8-TⅤec-培養(yǎng)基(1)初篩培養(yǎng)基:牛肉膏3gL,蛋白胨tor連接后轉(zhuǎn)化到E. coli dh5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布10g,NaCl5gL,乙醇2g/L,壯觀霉素20mg,到Amp抗性平板上培養(yǎng)9-16h挑取3個單克隆瓊脂15g/;(2)復(fù)篩培養(yǎng)基: BGll培養(yǎng)基中添加擴繁后送上海桑尼生物科技有限公司測序,將測2g/L的乙醇,20mg/L的壯觀霉素,15g/L的瓊脂;序結(jié)果與 Gen bank中已有序列進(jìn)行比對和同源性(3)純化培養(yǎng)基:牛肉膏3gL,蛋白胨10g/L,NaC1分析5g冮,乙醇2gL,瓊脂15g/L(4)發(fā)酵培養(yǎng)基:牛1.4乙醇消耗菌的生長及乙醇消耗速率測定肉膏3gL,蛋白胨10gL,NaCl5gL,乙醇23g乙醇消耗菌生長曲線的測定挑取純化后的單壯觀霉素20mg/L菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,取適量培養(yǎng)液乙醇消耗菌的分離及純化(1)初篩:集胞藻在在6600nm下測定其吸光度(A6o),然后稀釋至A6o=氣泡柱式反應(yīng)器中通氣培養(yǎng)12—14d后,經(jīng)無菌檢0.05,按10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30℃測為陽性,作為染菌藻液。取染菌的Syn-ZG25藻液,180rmin搖床中培養(yǎng),定時取樣測定菌液A60。每經(jīng)梯度稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基平板上,置于30℃實驗組設(shè)2個平行,對照組中接種等體積的無菌培生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待平板上有單菌落長岀后,依養(yǎng)液。據(jù)菌落形態(tài)和顯微觀察結(jié)果,分別挑取多株菌落菌液細(xì)胞濃度的確定取生長至對數(shù)期旳菌液形態(tài)和顯微形態(tài)相同的單菌落培養(yǎng)。(2)復(fù)篩:將初測定其A6。梯度稀釋后采用平板活菌計數(shù)法測定篩得到的各菌株分別在復(fù)篩培養(yǎng)基平板上劃線或細(xì)胞濃度,計數(shù)時僅選取菌落數(shù)在20-200的平板凃布,平板放置于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7—10d,每株菌每濃度做3個平行。用 Origin擬合出菌液A6長出的菌株在純化培養(yǎng)基平板上經(jīng)多次傳代后作與細(xì)胞濃度D( Cell density, cfu/mL)的關(guān)系,結(jié)果列為復(fù)篩菌株。入表1。1.3乙醇消耗菌的鑒定菌落及個體形態(tài)觀察在純化培養(yǎng)基平板上,表菌液A60與其細(xì)胞濃度D的關(guān)系Tab. Ionship between A660 and cell densit利用目測法觀察乙醇消耗菌的菌落形態(tài)。挑取純化菌株編號關(guān)系式擬合系數(shù)后的單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24h后取適量菌液低速離心,收集菌體,依次使用2.5%戊二醛GRI3D=1.179×103A6o+68.120.994GTID=2327×1010A60+62750.990溶液和1%鋨酸固定,經(jīng)乙醇梯度脫水后噴金處理GW13D=5641×103A6+16.670.996然后用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800型,日本GY22D=2.036×10A60+97540,994Hitachi公司)進(jìn)行個體形態(tài)觀察。乙醇消耗菌的16 RdNA及26 S rDNA序列測定乙醇消耗速率的測定將培養(yǎng)18-24h后的各根據(jù)各菌的菌落和個體形態(tài)分析,4種菌可能分屬細(xì)菌接種到裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中,根據(jù)菌和酵母兩大類,因此同時進(jìn)行了16 S rDNA及26s擬合得到的公式將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋,使其初始細(xì)胞rDNA序列測定。引物設(shè)計:分別選用16 S rDNA通濃度維持在10° cfu/mL,將錐形瓶置于30℃、180rmin用引物對27F(5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)搖床培養(yǎng)。以不接菌實驗組為對照,每組實驗設(shè)21492R(5 TACCTTGTTACGACTT-3)以及26 SrNA個平行。每6h取樣測定細(xì)胞濃度,并用生物傳感分通用引物對NL1(5′ GCATATCAATAAGCGGAGGA析儀(SBA-40D,山東省科學(xué)院生物研究所)測定培AAAG3)NL45 -GGTCCgTGTTtCaaGaCGg-3)。養(yǎng)液中乙醇濃度4PCR反應(yīng)體系與條件:PCR反應(yīng)采用50uL體系,以乙醇的比消耗速率按公式(1)計算:中國煤化工CNMHG期葛平平等:乙醇消耗菌的分離鑒定及其對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響489(1)和采用平板活菌計數(shù)法測定菌的細(xì)胞密度。(2-1)·D1.6基因工程集胞藻生長的測定其中,Q為比消耗速率,單位為g(cfud);C,表示1考慮到乙醇消耗菌在730nm處也有光吸收,因時刻的乙醇濃度,單位為g;D為1到t2時間段內(nèi)此以葉綠素a的含量計量集胞藻的生物量。取1mL藻液,離心收集藻細(xì)胞,再加入1mL甲醇重懸浸泡,的平均細(xì)胞濃度,按照公式(2)計算60℃水浴避光提取30min,離心取上清液測定665nmD=-下的吸光度,計算葉綠素a含量S17統(tǒng)計分析1.5乙醇消耗菌對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響統(tǒng)計分析采用單因素方差分析( One-Way ANOVA無菌藻種在三角瓶中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,授方法,使用SPSs1.0軟件。種于氣泡柱式光生物反應(yīng)器(裝液量200mL)中,每24h取樣,測定藻液的葉綠素a含量及乙醇濃度。自2結(jié)果培養(yǎng)第4天始,向各實驗組中分別接種稀釋至一定2.1乙醇消耗菌的分離及鑒定細(xì)胞濃度的菌液2mL,使各乙醇消耗菌細(xì)胞終濃度從污染的基因工程集胞藻培養(yǎng)液中,經(jīng)過初篩、為Io° cfu/mL,對照組加入2mL無菌水;每組實驗多次純化及復(fù)篩,得到4株具有乙醇消耗能力的菌,設(shè)2個平行。每24h取樣,測定藻液的葉綠素a含分別編號為GR3、GW13、GT17、GY22四株菌分量及乙醇濃度。對照組及實驗組每48h作無菌檢測別在30℃恒溫箱中培養(yǎng)5d后的菌落特征列入表2。表2四株乙醇消耗菌的菌落特征Tab 2 Colony characteristics of the four ethanol consuming microorganisms菌株編號菌落直徑菌落顏色菌落形狀邊緣正反面顏色差別olonyColony colotSurface Color difference of both sideGRI3紅色圓形,帽子狀整齊無45純白色圓形整齊無0.8—1乳白色圓形整齊光滑無GY22橘黃色圓形,帽子狀整齊光滑無掃描電鏡觀察顯示(圖1)GR13菌的細(xì)胞為球形或橢球形細(xì)胞直徑約24m;GW13菌的細(xì)胞呈卵球形,長度約1.53μum,GTl7菌的細(xì)胞呈桿狀,直徑約為03um,長度約1-2um。GY22菌的細(xì)胞呈短桿狀,直徑GR13約0.30.4μm,長度約0.81.2μum。綜合考慮四株菌的菌落和個體形態(tài),初步認(rèn)為GRl3和Gw13屬于酵母菌,GT17和GY22屬于細(xì)菌。隨后分別提取各菌的DNA,并進(jìn)行16 S TDNA及26SrDNA序列測定,將測得的序列在 Genbank blast進(jìn)行同源性圖1四株乙醇消耗菌的個體形態(tài)比對(表3)Fig. I The morphology of the fouH中國煤化工CNMHG水生生物學(xué)報38卷表3四株乙醇消耗菌的同源性比對結(jié)果Tab 3 BLAST results of the four ethanol consuming microorganisms菌株編號序列長度生物名同源性蓋率Strain number Sequence length(kb)MicroorganismIdentity(%) Cover(%)GRI3Rhodotorula sp. M26100Meyerozyma guilliermondii strain KAMLO5GW13Meyerozyma guilliermondii strain KAMLo3GTI1385Brevundimonas terrae strain KSL-145Mycoplana bullata strain IAM 13153979Microbacterium hominis strain DSM 12509GY221444Microbacterium trichothecenolvticum strain DSM 8608Microbacterium testaceum strain DSM 20166100從比對結(jié)果可以看出,菌株GRI3、GT174株菌的初始接種濃度均為10°cfu/mL,在此GW13、GY22分別與黏質(zhì)紅酵母( Rhodotorula mue條件下,發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇濃度變化見圖3。其中vinosa)、缺陷短波單胞菌( Brevundimonas diminuta對照組由于自然揮發(fā)的原因,乙醇濃度略有下降。ATcC11568)季也蒙酵母( Meyerozyma guilliermondii在扣除因自然揮發(fā)而消耗的乙醇后,除了GY22外,strain Kaml05)人型微桿菌( Microbacterium hominis其他三個實驗組中的乙醇濃度均顯著下降(P0.05)。由此可見,在本實驗條乙醇產(chǎn)量的影響件下,4株菌的存在雖然明顯降低培養(yǎng)液中乙醇濃度向無菌集胞藻培養(yǎng)液中分別加入不同的乙醇消(圖6),但對TH影什492水生生物學(xué)報38卷耗菌。K詛 maraine,eral.的研究證明培養(yǎng)液中乙醇→GRl3濃度為4.5gL時,可以對集胞藻PCC6803的生長產(chǎn)--GT170.030F-GW13生明顯抑制,導(dǎo)致最高細(xì)胞濃度下降4.5%1。本研0.025究發(fā)現(xiàn)基因工程集胞藻在培養(yǎng)過程中容易染菌,并從中分離出4株能夠代謝乙醇的菌(表2,3)。圖7的結(jié)旨0.020果表明,4株菌在BGll培養(yǎng)液中均表現(xiàn)出明顯的乙醇消耗能力,GR13、GW13、GT17、GY22的乙醇消0.010耗速率分別為0.051、0.022、0.038和0.026g(Ld),在0.005°營養(yǎng)更豐富的發(fā)酵培養(yǎng)基中的乙醇消耗速率更高髙0.000分別達(dá)到1.7、2.05、0.725和0.025g(Ld)(圖3)。在培養(yǎng)時間 Culture time(d本研究中使用的基因工程藻株 Synechocystis sp.PCC圖7四株乙醇消耗菌對集胞藻生長的影響6803Syn-zG25的乙醇產(chǎn)率為0.0090.104g(Ld),Fig. 7 Effects of the four microorganisms on growth of Syneche與上述分離的菌株共培養(yǎng)7d后,實驗組的乙醇產(chǎn)量cystis sp均顯著低于無菌對照組(圖6)。當(dāng)培養(yǎng)液中無乙醇消響,據(jù)此也能推測乙醇濃度的降低主要是由于污染耗菌時,乙醇產(chǎn)量呈現(xiàn)增長趨勢;當(dāng)培養(yǎng)液中污染的乙醇消耗菌對乙醇的直接消耗。少量乙醇消耗菌時,乙醇積累速度減緩。隨著培養(yǎng)液中乙醇消耗菌濃度的增加,污染乙醇消耗速率較3討論低的雜菌的實驗組,乙醇濃度不再增長;污染乙醇基因工程集胞藻是在野生型集胞藻PCC6803中消耗速率較快的雜菌的實驗組,乙醇濃度迅速下轉(zhuǎn)入表達(dá)丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的基因,構(gòu)建降。在本研究中菌株GRl3的乙醇消耗能力最強,其出乙醇合成途徑,通過光合作用固定CO2直接合成乙醇比消耗速率為391g(103cfud。目前報道的基乙醇。研究表明,有很多種因素會影響乙醇合成途因工程藍(lán)藻的最高乙醇產(chǎn)量為0.21g(Ld),據(jù)此徑中關(guān)鍵酶的活性,從而影響藻細(xì)胞的乙醇產(chǎn)率,計算,若要將菌株GR13對乙醇產(chǎn)量的影響控制在Gao,etal.的研究結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)基中存在較高濃1%以內(nèi),則其最高細(xì)胞濃度應(yīng)控制在537×l0 cfu/mL度的Zn3、Co3等金屬離子時,乙醇脫氫酶的活性受以內(nèi)。抑制S。Lan,etal發(fā)現(xiàn)富氧條件下相關(guān)酶的活性受些研究表明,某些細(xì)菌能通過分泌溶藻物質(zhì),抑制,相應(yīng)地,藻細(xì)胞的產(chǎn)醇能力降低16。但在直接破壞藻細(xì)胞;或者與藻細(xì)胞競爭營養(yǎng)和光照Deer,eal、Gao, et al!的研究中即使在上述扣制因而抑制藻細(xì)胞的生長。而本研究中分離到的4株乙醇素并不存在的情況下,集胞藻培養(yǎng)液中的乙醇積累消耗菌與基因工程集胞藻共培養(yǎng)時,并未對集胞藻量仍然表現(xiàn)出快速下降的現(xiàn)象35。Gao,eta認(rèn)為的生長產(chǎn)生明顯抑制(圖7),而與此同時,培養(yǎng)液中因藻細(xì)胞的衰老而引起的乙醇產(chǎn)率降低是乙醇積累乙醇的積累量岀現(xiàn)明顯差異,說眀本研究中的幾株量迅速下降的主要原因。而本研究發(fā)現(xiàn)即使在生乙醇消耗菌并非通過抑制藻細(xì)胞的生理狀態(tài)而影響長末期藻細(xì)胞不產(chǎn)生乙醇,自然揮發(fā)也只是導(dǎo)致乙其乙醇產(chǎn)量,而是通過消耗產(chǎn)物乙醇而導(dǎo)致乙醇產(chǎn)醇濃度略微下降(圖3)。 Deer,etal猜測是乙醇脫氫量的降低。酶反向催化乙醇轉(zhuǎn)變成乙醛,但沒有闡明導(dǎo)致代謝經(jīng)形態(tài)和分子鑒定,本研究中分離的4株菌分方向轉(zhuǎn)變的原因3別屬于紅酵母屬、季也蒙酵母屬、短波單胞菌屬和基因工程集胞藻的目的產(chǎn)物乙醇可通過自由擴微桿菌屬。 Okada,etal.、 Verduyn,etal.的研究表散透過原生質(zhì)膜,直接分泌到胞外,從而在培養(yǎng)液明9某些酵母兼有生產(chǎn)和消耗乙醇的能力,兩中積累一定濃度的乙醇。從產(chǎn)物回收的角度看,從種代謝的方向取決于培養(yǎng)液中可利用糖的濃度,當(dāng)培養(yǎng)液中而非從藻細(xì)胞中回收目的產(chǎn)物相對較容易,培養(yǎng)液中糖濃度較高時,酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇;當(dāng)培養(yǎng)成本也相應(yīng)降低。而就培養(yǎng)本身而言,乙醇的積累液中糖濃度較低時,酵母就會消耗乙醇。而產(chǎn)乙醇可能對藻細(xì)胞產(chǎn)生脅迫或?qū)е屡囵B(yǎng)液中滋生乙醇消集胞藻培養(yǎng)使圍無機養(yǎng)石相礎(chǔ)相對匱乏,因中國煤化工CNMHG期葛平平等:乙醇消耗菌的分離鑒定及其對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響493此污染的酵母可能從發(fā)酵產(chǎn)乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橄囊掖?ethanol [J]. Chinese Journal of Applied Environmental從而降低培養(yǎng)液中的乙醇積累量。本研究還發(fā)現(xiàn),Biology,2009,15(4):559562[陳亮,鄭軍,張益霞,等短波單胞菌和微杄菌也能夠消耗乙醇,有文獻(xiàn)報道株乙醇利用菌的分離及其在乙醇含量測定中的應(yīng)用顯示短波單胞菌能夠代謝利用乙醇2,而微桿菌消應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,200,15(4:559562][9 Sun Z Y, Niu T G. Isolation and identification of a Bacillus耗乙醇的報道還不多見。sp degrading alcohol [J]. Food Research and development在規(guī)模培養(yǎng)中,由于反應(yīng)器的非完全密閉性、2006,27(7):77—79[孫志一,牛天貴.一株能夠有效解酒培養(yǎng)環(huán)節(jié)眾多和培養(yǎng)周期較長等原因,很難做到絕的芽孢桿菌的分離篩選與初步鑒定.食品研究與開發(fā)對避免菌的污染。而且在不同培養(yǎng)情況下,污染菌2006,27(7):77-79株的種類和對目標(biāo)藻類和目標(biāo)產(chǎn)物的影響機制也各[10 LuC C, LiZ L, LiY R, et al. Screening identification of astrainpotentiality in ethanol detoxification and有不同。本研究分離出的幾株菌廣泛存在于環(huán)境中,optimizition of its culture conditions J. Liquor-Making容易造成規(guī)模培養(yǎng)中的污染并大量消耗乙醇而影響Science Technolog,2011,6(204):17-20[陸晨晨,李宗乙醇產(chǎn)量,尤其是短波單胞菌、微桿菌因為體積微亮,李盈叡,等.一株乙醇降解菌株的篩選、鑒定及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化.釀酒科技,2011,6(204):17-20小(直徑約為03pm),容易通過用于制備無菌空氣1 Xiao JB, Jiang H X, Chu SY. Isolation and Characterization的過濾器而造成污染,在未來的研究和生產(chǎn)中應(yīng)該of Denitrifying Bacterium Pseudomonas Mendocina aHD7加以重視。因此,本研究通過對幾株乙醇消耗菌的分with Anaerobic Ammonium Oxidization [A]. In: Sustainable離鑒定并評價其乙醇消耗速率,有益于人們了解基Environment and Transportation. Applied Mechanics and因工程集胞藻培養(yǎng)過程中乙醇產(chǎn)量下降的原因,也Materials, May 2012, Stafa, Zurich [C]. Trans Tech有助于認(rèn)識微藻培養(yǎng)中污染菌的性狀和污染途徑,Publications. 2012. 699-703[12 Maleszka R, Schneider H. Concurrent production and并就此可進(jìn)一步發(fā)展針對性的污染控制方法。Tannophilus growing on D-xylose [J]. Applied and參考文獻(xiàn):Environmental Microbiology, 1982, 44(4): 909-912[13] Pham H T, Larsson G, Enfors S O. Growth and energy[1 Balat M, Balat H. 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University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)Abstract: Four ethanol consuming microorganisms(GR13, GW13, GT17, and gY22)were isolated from the contami-nated culture of genetically engineered Synechocystis sp. and were utilized to evaluate the effects of these microorganisms on the ethanol consuming capabilities and ethanol productions of Synechocystis sp. Based on the morphologicalcharacteristics and 16S rDNA and 26S rDNA gene sequence, the four strains were identified as Rhodotorula sp, Meyerozyma sp, Brevundimonas sp, and Microbacterium sp, respectively. We observed that strain gri3(Rhodotorula sphad the highest level of specific ethanol consumption rate [391 g/(10 cfu- d)], followed by strain Gw13(Meyerozymasp,[80.1 g/(10 cfu- d). While strains GT17(Brevundimonas sp. and GY22(Microbacterium sp. had much lowerethanol consumption rate. All four strains did not significantly affect the growth of Synechocystis sp, however, theyremarkably decreased the ethanol production of Synechocystis sp. The results of the co-culture experiment demonstratedthat strains Gr13, GW13, GT17, and GY22 diminished ethanol production of the genetically engineered Synechocystissp. by 53. 8%, 23.6%0, 40.7% and 27.3%, respectivelyKey words: Ethanol consuming microorganism; Microorganism contamination; Bioethanol; Genetically engineeredSynechocystis sp中國煤化工CNMHG