山西醫(yī)藥雜志2012年7月葦41卷郭7期下半月 Shanxi Med J,July2012.vol.41.No.7 the Second667論著乙醇對腸黏膜屏障功能的影響及作用機制中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(110001)佟靜王穎王炳元【摘要】目的探討乙醇對腸上皮細胞屏障功能的影響及作用機制。方法將不同濃度的乙醇與腸上皮細胞株Caco2細胞共培養(yǎng)4h采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法及乳酸脫氫酶法LDH)檢測細胞存活率。應(yīng)用Caco2細胞建立腸上皮細胞屏障模型,不同濃度乙醇溶液處理后,測定其跨上皮細胞電阻值(TEER)及熒光黃透過率的變化。應(yīng)用蛋白印跡法及免疫熒光染色法檢測緊密連接蛋白 occludin的表達和分布。結(jié)果乙醇濃度≤5%時,不影響Cac2細胞的生存率。乙醇誘導(dǎo)腸上皮細胞屏障通透性增加,呈濃度時間依賴性;乙醇作用后,細胞膜上 occludin表達逐漸降低,60min時達最低值,細胞膜上呈點狀分布,此后部分可逐漸恢復(fù),趨勢與TEER值及熒光黃透過率一致。結(jié)論乙醇可破壞細胞間緊密連接蛋白,進而誘導(dǎo)腸上皮細胞屏障通透性增加?！娟P(guān)鍵詞】乙醇;跨上皮細胞電阻;緊密連接;Caco2細胞目前研究中關(guān)于乙醇致腸道通透性改變的病理培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24b后換上含不同濃度乙醇的培養(yǎng)液(1%機制很多均認為腸道通透性改變的根本原因在于2.5%、5%7.5%、10%),每種濃度設(shè)6孔重復(fù),以不含乙腸道黏膜的損傷。完整的腸黏膜是防止細菌移位醉的培養(yǎng)液為陰性對照,分組繼續(xù)培養(yǎng)4h后,每孔加人的基礎(chǔ)及主要屏障。實驗發(fā)現(xiàn)在給予添加乙醇飲MTT20μL(5g/L),溫浴4h,棄上清液,每孔加入DM食的大鼠中有腸道上皮細胞緊密連接的破壞,提so150μL,室溫避光搖床上充分振蕩10min,混勻后以空示在乙醇誘導(dǎo)的腸道通透性改變中,腸黏膜上皮屏白孔調(diào)零,在酶標(biāo)儀上檢測490mm波長吸光度(A)值每次實驗重復(fù)3次障遭到的破壞是可能的機制之一。1.2.3乳酸脫氫酶(LDH)檢測法:本實驗采用LDH試劑1材料和方法盒檢測Caco2細胞經(jīng)不同乙醇濃度(1%、2.5%5%1.1材料7.5%、10%)作用4h后,細胞溶質(zhì)中LDH的釋放,進而評Caco2細胞株購自南京凱基生物有限公司,達氏修正估細胞的生存率依氏培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Hy1.2.4腸上皮細胞屏障通透性的檢測:Caco2細胞形成單clone公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國 Sigma公司層上皮細胞屏障后,在 Transwell基底側(cè)加入不同濃度的乙二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司,醇(1%2.5%5%),孵育不同時間(0、15、30、60、120、180occludin抗體購自北京博奧森公司美國 Santa scru公司,240min),觀察加入乙醇前后Caco2細胞TEER的變化情熒光黃購自美國 sigma公司。況,并測定加入乙醇后Caco2細胞對熒光黃透過率的改1.2方法1.2.1體外腸上皮細胞屏障模型的建立:分化良好的Ca變。每種實驗均選取4組非同代細胞進行。①TEER的測定:應(yīng)用細胞電阻儀(EVOM)測定加入乙醇前后Caco2細co2細胞接種于 Transwell板上(孔徑3pm,有效膜面積1.12cm2),接種密度為1×105/cm2,隔天換液( Transwell胞的TEER測定方法參照文獻[1]。為保證數(shù)值的準(zhǔn)確上層加入600μL培養(yǎng)液,下層加入1800μL培養(yǎng)液),倒置性,整個過程在恒定溫度下(37℃)進行,每個 Transwell均顯微鏡下觀察細胞生長情況,同時測定跨上皮細胞電阻取不同方向的3個點,重復(fù)測定3次。②熒光黃透過率的(TEER)。約21~24d細胞形成緊密單層,TEER明顯升檢測:應(yīng)用熒光黃作為標(biāo)記物,檢測乙醇對Caco2細胞細高,證明腸上皮細胞屏障形成胞旁轉(zhuǎn)運的影響。細胞用Hank平衡鹽溶液(HBSs)(pH1.2.2MTT比色實驗:將處于對數(shù)生長期的細胞,7.4)小心沖洗3次,37℃孵育30mn,吸凈孔內(nèi)的HBSS以2.5%胰蛋白酶消化后,以每孔1×10加人96孔培養(yǎng)板防止干擾;在 Transwell頂端加入40gg/mL熒光黃,37℃中,每孔體積100置于37℃,體積分數(shù)為5%CO2的解育1h后收集基底側(cè)液體,熒光分光光度計下測定吸光度中國煤化工m)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算熒CNMH基金項目:遼寧省科技廳高等學(xué)?？蒲许椖?2009A809)1.2.關(guān)蛋白表達:當(dāng)T通信作者;王炳無,Emailwangby@medmail.com.cnswell小室的上室細胞生長至融合時,用含有0.1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液山西醫(yī)藥雜志2012年7月第41卷第7期下半月 Shanxi Med J,July2012,vo.41,No.7 the Second(PBS)沖洗,細胞鏟小心刮取細胞,倒入1mL裂解液A(2測結(jié)果提示(檢測時間4h),當(dāng)乙醇濃度≤5%時,Cac02細mmo/ L EDTA,10mmol/L乙二醇雙醚四乙酸(EGTA),胞處理組生長抑制率與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.4%NaF,20mmol/ L Tisha,蛋白酶抑制劑混合物,苯0.05);當(dāng)乙醇濃度>5%時,細胞生長抑制率隨乙醇處理濃甲基磺酰氟(PMSF),1% Titon x100,pH7.5),4℃勻度升高而顯著升高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<漿,離心,上清液為蛋白樣品液。加入抗 occludin抗體(10.05或P<0.01)。LDH試劑盒檢測結(jié)果提示(檢測時間4100),抗β肌動蛋白抗體(1:5000),4C孵育過夜,在羊h),當(dāng)乙醇濃度≤10%時,Caco2細胞處理組生長抑制率與抗兔辣根過氧化物標(biāo)記的IgG二抗中37℃孵育45min,化對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。學(xué)發(fā)光(ECL),X線片曝光、顯像,所得膠片用 Chemi Ima表1各組MTT比色法及LDH法檢測ger5500V3.0軟件掃描,通過 Fluor Chen20軟件進行定細胞生存率(%)(x士s)量分析,測得A值組別10%乙醇MTT比色法LDH法1.2.6免疫熒光觀察緊密連接相關(guān)蛋白 occludin的表達和分布:依照不同的實驗組,將生長在蓋玻片上Caco2單1%乙醇組9.1±1.02.5%乙醇組99.9±0.9100.4±3.5層用4%的多聚甲醛固定30min,用0.5% Triton X100透5%乙醇組99.2±1.9化5min,用5%牛血清白蛋白(BsA)封閉1h?？贵w稀釋7.5%乙醇組度: occludin(1:60),陰性對照用0.01mol/LPBS代替10%乙醇組48.3±3.48.6±5.1抗,4C孵育過夜。應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FTC)標(biāo)記的熒2.2乙醇對Caco2細胞的屏障功能的作用:為了確定乙光二抗(1:100)孵育1h,避光操作,甘油封片熒光顯微鏡醇在不破壞Caco2細胞膜的情況下是否對細胞的屏障功觀察,采集圖像。能有直接的損傷作用,本實驗觀察了乙醇對培養(yǎng)的Caco21.3統(tǒng)計學(xué)處理細胞緊密連接的作用。測定不同濃度乙醇對腸上皮細胞屏所有數(shù)據(jù)以x士s表示,2組間采用t檢驗,多組間比較障作用不同時間的TEER變化見表2。檢測不同濃度乙采用重復(fù)測量的方差分析和 Bonferroni檢驗,P<0.05為醇作用不同時間的熒光黃透過率的變化,見表3。發(fā)現(xiàn)腸上差異有統(tǒng)計學(xué)意義皮屏障通透性增加,呈時間濃度依賴性,作用60min時2結(jié)TEER值達最低值,熒光黃透過率達峰值,此后可逐漸恢2.1乙醇對Caco2細胞的生長抑制作用:MTT比色法檢復(fù)表2各組不同時間腸上皮細胞屏障通透性(TEER值)(x士s)組別30 min180 min240 min1%乙醇組3.0±3.9372.7±3.4357,.6±2.9348.7±4.0350.8士4.3361.2士4,8374.8士5,22.5%乙醇組383.9士4.8362.9士293481±3.3327.6±3.4346.5±5.23578±4,6372.7士4.45%乙醇組383.6士4.7348.9士29334.3±36311.9士5.6335.8±4.2356.0±3.9370.2士44表3各組不同時間腸上皮細胞屏障通透性(熒光黃透過率)(%)(±s)120 min1%乙醇組099士0.258.00士10512.15±0.5214.50±0.3712.75士0.3710.75士0.328.50士0,472.5%乙醇組0.99士0.258.60士04914.20±0.3916.80±0.3614.30±0.4012.20±0.338.90士0.485%乙醇組0.99±0.259.00±0.3417.00±0.3719.80士0.4318.80士0.5114.90±0.369.30±0.282.3乙醇作用后腸上皮細胞間緊密連接蛋白 occludin表蛋白的重分布:免疫熒光分析顯示,在未處理的細胞中,oc達水平顯著減低:通過前期研究,選擇不影響Caco2細胞 cludin位于細胞膜上,且呈連續(xù)性分布。乙醇處理60min生存率且明顯增加腸上皮細胞屏障通透性為原則故選擇時, occludin在細胞膜上表達水平降低由細胞膜向細胞質(zhì)%乙醇為作用濃度進行以下實驗。結(jié)果顯示,5%乙醇作內(nèi)轉(zhuǎn)移部分斷裂消失。乙醇處理180min時,可見細胞膜用過程中, occludin表達水平逐漸降低,60min時達最低值,上 occludin蛋白表達部分恢復(fù)。此后逐漸恢復(fù)。60mn組 occludin蛋白表達水平與其他各3討論組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。腸黏膜上皮屏障是構(gòu)成機體內(nèi)外環(huán)境之間的種機械保護作用的組織學(xué)屏障,在防止病原微生物從黏膜侵入方面有著非常重要的作用。腸黏膜凵中國煤化工古膜上皮細胞及其1對照組;2:0min組;3:30min組;4:60min組;5:120min組;6:180min組;7:210min組;8:300min組周圍CNMHG鄰細胞膜處各種圖1蛋白印跡法檢測各組 occludin蛋白的表達蛋白質(zhì)的相互作用所構(gòu)成(,其中 occludin是最主2.4乙醇誘導(dǎo)腸上皮細胞屏障緊密連接相關(guān)蛋白 occludin要的跨膜蛋白。正常情況下,緊密連接通過調(diào)控作山西醫(yī)藥雜志2012年7月第41喜第7期下半月 Shanxi Med J,Jly2012.vol.41,No.7 the Second·669·用,選擇性地轉(zhuǎn)運相應(yīng)物質(zhì),而有效地阻止腸腔內(nèi)峰值,此后逐漸恢復(fù)。通過蛋白印跡法及免疫熒光細菌毒素及炎癥介質(zhì)等物質(zhì)的旁細胞轉(zhuǎn)運,維持染色法檢測細胞間緊密連接蛋白 occludin表達水腸黏膜上皮屏障功能的完整平與TEER值及熒光黃透過率趨勢一致。Fish-Swanson等和Rao報道乙醇可致腸上皮er證明了緊密連接與TEER直接相關(guān),更加支持屏障功能障礙,使小腸黏膜通透性增加。然而,腸我們的結(jié)論:乙醇可通過破壞Caco2細胞緊密連上皮屏障功能的改變是由于乙醇直接損傷腸黏膜接的完整性進而增加腸上皮屏障通透性細胞引起的還是損傷細胞間緊密連接所致有待進綜上所述,乙醇濃度≤5%時可短暫性破壞細步詳細闡明。本實驗首先通過MTT比色法及胞間緊密連接,導(dǎo)致腸黏膜屏障通透性增加;當(dāng)5%檢測LDH來評價乙醇對Caco2細胞生存率的影<乙醇濃度≤10%時,可使腸上皮細胞發(fā)生脫落,響。MTT可被活細胞線粒體上琥珀酸脫氫酶轉(zhuǎn)化可能與細胞間緊密連接破壞程度較嚴(yán)重有關(guān)。上成藍紫色甲臢顆粒,此顆粒被DMS溶解后用分光述具體機制很復(fù)雜,有待于進一步研究。光度計測定出A值,A值的大小與活細胞數(shù)呈正參考文獻相關(guān)。我們在MTT實驗中發(fā)現(xiàn),乙醇濃度在不1] Schmitz H, Fromm M, Wentzel C,etl. Tumor necrosis fa超過5%時,與對照組相比細胞生存率影響差異無tor-alpha(TNF alpha) regulates the epithelial barrier in thehuman intestinal cell line HT-29/B6. J Cell Sci, 1991, 12(Pt統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),如超過5%時,細胞首先發(fā)生脫落,影響細胞生存率的檢測結(jié)果。而LDH[2] Anderson JM, van Itallie CM. Tight試驗是用紫外分光光度儀測定乳酸鹽的含量。因basis for regulation of paracellular permeability. Am J僅使用培養(yǎng)細胞的廢液來進行,故不受細胞脫落、Physiol,1995,269:467-475漂浮等因素的影響。我們在LDH實驗發(fā)現(xiàn),乙醇[3]鄒仲之,組織學(xué)與胚胎學(xué),6版北京:人民衛(wèi)生出版社,2005濃度不超過10%與對照組相比細胞生存率影響差[4] Swanson G, Forsyth CB, Tang y,et al. Role of intestinal circa異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。證實乙醇濃度≤5%dian genes in alcohohinduced gut leakiness, Alcohol Clin Exp時不影響細胞生存率;5%<乙醇濃度≤10%時Res2011,35(7);1305-1314Caco2細胞發(fā)生脫落而細胞未出現(xiàn)破裂而導(dǎo)致細5]RaoR. Endotoxemia and gut barrier dysfunction in alcoholic胞死亡,可能與細胞間緊密連接蛋白損傷嚴(yán)重程度liver disease. Hepatology, 2009, 50(2):638-644.較大有關(guān)。[6]成惠林,劉承基檢測細胞活性的MTT方法江蘇醫(yī)藥,1996,通過前期試驗乙醇濃度選擇5%進行后續(xù)實[7] Fisher S. Swaan PW, Eddington ND, et al. The ethanol me-驗,檢測體外腸上皮屏障通透性。本實驗中通過tabolite acetaldehyde increases para-cellular drug permeabilityTEER及熒光黃透過率來檢測腸上皮屏障通透性。in vitro and oral bioavailability in viDo. J Pharmacol Exp Ther,TEER是檢測細胞屏障的指標(biāo),其值越大代表細2010,332(1):326-333胞的屏障功能越好。而熒光黃透過率實驗檢測腸(收稿日期:20120406)上皮屏障通透性,較TEER實驗更準(zhǔn)確,不易受外作者簡介:佟靜,女,1979年11月生,主治醫(yī)師,中國醫(yī)科大學(xué)附第一醫(yī)院,110001界因素影響。本實驗發(fā)現(xiàn)乙醇作用后腸上皮屏障通透性增加,呈時間濃度依賴性,作用60mn時達中國煤化工CNMHG