江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2013年第41卷第1期245勉,翁海波,李萍萍,等.作物秸稈實驗室條件發(fā)酵制乙醇研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(1):245-246作物秸稈實驗室條件發(fā)酵制乙醇研究覃勉,翁海波,李萍萍,孫武舉,晉果果(鄭州大學(xué)生物工程系,河南鄭州40001)摘要:利用具有高效產(chǎn)酶的菌株土曲霉Ml,對作為底物的3種秸稈進(jìn)行固體發(fā)酵研究,探討秸稈種類顆粒度濕度、生長時間4個條件對產(chǎn)酶發(fā)酵過程的影響。結(jié)果表明,產(chǎn)酶發(fā)酵最適合的工藝是顆粒度為0.8mm的芝麻秸稈,濕度80%,產(chǎn)酶生產(chǎn)時間是7d,最適反應(yīng)條件下乙醇產(chǎn)量為23.56mg/g。關(guān)鍵詞:秸稈;固體發(fā)酵;纖維素乙醇;土曲霉Mll;工藝條件中圖分類號:TQ923文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號:1002-1302(2013)01-0245-02我國是個農(nóng)業(yè)大國,農(nóng)作物資源十分豐富。作為糧食的生長培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200g煮水,加入葡萄副產(chǎn)物,秸稈的處理方式通常是焚燒。每年處理秸稈時產(chǎn)生糖20.0g瓊脂15.0g,加水至1000mL混勻?；A(chǔ)鹽溶液:的氣體,不僅污染了環(huán)境還對農(nóng)村生態(tài)環(huán)境造成了破壞。MgSO4·7H200.5g,CaC20.5g,KH2PO43.0g,(NH)2SO秸稈的主要成分是纖維素。纖維素是植物通過光合作用轉(zhuǎn)化3.5g,pH值3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液1000mL。糖化發(fā)能量的主要載體,是重要的生物能資源,也是地球上資源量最酵培養(yǎng)基:蛋白胨5.0g,NH4Cl2.0g,KH2PO41.0g,豐富的可再生資源。若僅將秸稈作為燃料,對其能源的利用MgSO4·7H2O,pH值4.8的檸檬酸鈉的緩沖溶液1000mL。率僅在10%左右近89%的能量被白白損失2。用秸稈生產(chǎn)酵母培養(yǎng)基:酵母膏10g,蛋白粉20g,葡萄糖20g,蒸餾水燃料乙醇,可以大大提高其能源利用率,為解決能源危機(jī)提供90mL,瓊脂20g(固體)。所用培養(yǎng)基均在10Pa下滅菌了更為理想的方法。采用生物技術(shù)生產(chǎn)秸稈纖維素乙醇,首先是利用纖維素.3儀器酶將秸稈中的纖維素降解成還原糖,然后進(jìn)行生物發(fā)酵生產(chǎn)烘箱,粉碎機(jī),血球計數(shù)板,超凈工作臺,培養(yǎng)箱,恒溫?fù)u乙醇。用以處理秸稈的纖維素酶,也是廣泛應(yīng)用于食品、飼床,pH計,722W微機(jī)型分光光度計。料、造紙紡織工業(yè)的一種重要的生物制劑。纖維素酶的1.4方法生產(chǎn),是所有纖維原料生物轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是成本最高試驗流程:秸稈處理粉碎→蒸煮殺菌→接種產(chǎn)酶及酶處的一個部分。研究表明,使用固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)纖維素酶,如理→乙醇發(fā)酵→燃料乙醇。用秸稈等纖維原料直接生產(chǎn)纖維素酶,可以有效減少生產(chǎn)成1.4.1秸稈處理收集作物秸稈,沖洗,晾干,放入干燥箱中本3”。本研究采用筆者所在實驗室自行分離鑒定的土曲霉充分烘干便于粉碎。使用農(nóng)業(yè)秸稈粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎轉(zhuǎn)速菌株M1,它具有高效降解纖維素的活性在實驗室條件下,1000r/min,粉碎的顆粒直徑分別為1.5、0.8、0.5mm。稱使用固態(tài)發(fā)酵法,對同時作為產(chǎn)酶底物和纖維素原料的幾種取不同顆粒度秸稈原料,以20g為單位,加入基礎(chǔ)鹽溶液培秸稈原料進(jìn)行研究摸索新型的乙醇發(fā)酵方式,旨在為利用秸養(yǎng)基,在10Pa壓力下高壓蒸汽滅菌稈為原料工業(yè)化生產(chǎn)乙醇提供依據(jù)。將土曲霉MI1接種在PDA培養(yǎng)基上,45℃培養(yǎng)7d使之形1材料與方法成成熟孢子。用5mL滅菌生理鹽水沖洗培養(yǎng)基,收集孢子,并用血球計數(shù)板計數(shù)控制溶液中孢子含量為10-107個/mL1.1材料在鐵盤中裝入不同顆粒度的4種秸稈原料,每份25g小麥秸稈和玉米秸稈采自河南省鄭州市溝趙鄉(xiāng)祥營村,14.2產(chǎn)酶分解纖維素的正交試驗采用正交試驗,研究秸芝麻秸稈產(chǎn)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻試驗基地。鄭州大學(xué)生稈種類顆粒度、濕度、發(fā)酵時間等對纖維素分解成還原糖的物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室提取分離鑒定的土曲霉M1l菌影響,并選定最適宜因素組合。選擇上述不同因素的原因在株,具有耐高溫耐強(qiáng)酸的高效降解特性。酵母菌也是筆者所于以秸稈為原材料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇的過程中接種在實驗室分離的高效菌種。M11菌種須同步完成纖維素酶的生產(chǎn)和秸稈纖維素分解的1.2培養(yǎng)基過程。纖維素酶活性與土曲霉MIl菌種的生長狀況直接相關(guān)。合適的濕度對于真菌生長十分重要。不同顆粒度的秸秤收稿日期:2012-04-09底物,也會通過通氧量和含水量影響真菌的生長狀況。為?；痦椖?河南省重點科技攻關(guān)項目(編號072102220002)。證土曲霉MII生長良好,須選擇最適宜菌種生長的底物種作者簡介:覃勉(1987-),女,河南鄭州人,碩士研究生,從事微生類、顆粒度、濕小理時間的長短也影響酶解纖維素生物與發(fā)酵研究。E-mail:qinnan@126.com成還原糖的產(chǎn)中國煤化工定乙醇的產(chǎn)量,通信作者:翁海波博士,副教授,從事微生物與發(fā)酵研究。E-mal:檢測還原糖量CNMH(走時間。正交試hbweng@gmail.com驗因素水平見表1246江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2013年第41卷第1期表1作物秸稈發(fā)酵正交試驗因素水平表2作物秸稈發(fā)酵正交試驗結(jié)果與極差分析因素水平因素水平A:秸稈種類B;顆粒度C:濕度D:生長時間試驗號還原糖量(%)A:秸稈種類B:顆粒度c濕度D:生長時間(mg)15.066玉米秸稈2小麥秸稈0.818.849芝麻秸稈1.4.3糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇試驗正交試驗完成后,將培養(yǎng)基移18.723人250mL三角瓶中,加入糖化培養(yǎng)基,在恒溫?fù)u床中以45℃13.674l20r/min混合24h。對處理過的培養(yǎng)基進(jìn)行pH值測定,將pH值調(diào)節(jié)為4.5,之后接種釀酒酵母發(fā)酵還原糖,密閉條件3231312223119.778下37℃培養(yǎng)3d,測定乙醇產(chǎn)量。20.57916.54117.62016.17318.1231.4.4還原糖與乙醇測定使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與DNS溶k215.60619.11719.95018.631液反應(yīng),540m處檢測不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,繪出散21.24316.65419.26716.63點圖,擬合葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。正交試驗結(jié)束后,各個樣品與糖化培養(yǎng)基混合24h,使用DNs法監(jiān)測各個試驗樣品中的R5.6372.4633.041.95還原糖含量,并計算還原糖轉(zhuǎn)化率。取無水乙醇配制標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液,以不同濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液與重鉻酸鉀溶液反應(yīng),水y=0.0426x-0.1414浴后,測定600mm處吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值變化曲線,r=0974得出回歸方程。經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后,取上清液,測定在目0.6600mm處的吸光度,依照回歸方程計算樣品中乙醇的含量。2結(jié)果與分析2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。乙醇含量(%)圖32乙醉標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.074x+00883r=0992622110在此條件下,秸稈底物的纖維素酶解所得的還原糖濃度較高。目前,尚無對土曲霉作為產(chǎn)酶生產(chǎn)菌種底物的研究。相比于小麥秸稈和玉米秸稈,以芝麻秸稈作為纖維素原料,可以產(chǎn)生較高濃度的還原糖,有進(jìn)行進(jìn)→步研究的價值。250300葡萄糖濃度(mg/mL)參考文獻(xiàn):圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[1]周肇秋,馬隆龍,李海濱等.中國稻殼資源狀況及其氣化/燃燒2.2正交試驗結(jié)果發(fā)電前景[打].可再生能源,2004(6):7-9由表2可知,影響還原糖產(chǎn)量的主次因素次序為秸稈種[2]黃琴賀稚非.纖維素類物質(zhì)生產(chǎn)乙醇研究進(jìn)展[].糧食與類>濕度>顆粒度>生長時間。最佳工藝為A3B2C3D2,即采油脂,2008(5):8-10用芝麻秸稈,顆粒度0.8mm,濕度80%,發(fā)酵時間為7d。土[3] JungE D,LaoG, Inwin D,eta. DNA sequences and expression in曲霉M1l生長的最佳濕度為80%,產(chǎn)酶發(fā)酵的最佳生長時間Streptomyces lividans of an exoglucanase gene and an endoglucanase為7d,這與之前的研究結(jié)論相符合。采用最佳發(fā)酵條件對芝gene from Thermomonospora fusca[ J]. Appl Environ Mierobiol麻秸稈進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵,獲得的還原糖量為29.08mg,還原糖1993,59:3032-3043的產(chǎn)率約為0.291g/g[4]Bielefeld M, Hollenberg C P. Bacterial beta-lactamase is efficientl2.3乙醇含量測定secreted in Saccharomyces cerevisiae under control of the invertase采用最佳發(fā)酵條件,對完成糖化發(fā)酵的芝麻樣品進(jìn)行乙gnal sequenced[ J]. Curr Genet, 1992, 21: 365-268醇產(chǎn)量測定。使用重鉻酸鉀法測定乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如[5]劉淑華魯新潔張發(fā)群固態(tài)纖維素酶曲的制備[J].微生物學(xué)通報,1992,19(3):151-153圖2所示。對照圖表,計算出芝麻秸稈轉(zhuǎn)化乙醇的產(chǎn)量為[61 Chahal P S, Chahal D S, L e G B B. Production of cellulase insolid-state fermentation with Trichoderma reesei MCG 80 on wheat3結(jié)論straw[7]Sun T, Liu BTV中國煤化工4-s本研究結(jié)果表明,土曲霉M1l生產(chǎn)纖維素酶的最佳工藝solid stateCNMHG-1(]Jourmal是芝麻秸稈,顆粒度08mm,濕度80%,最佳生長時間為7dChemical Technology Biotechnology, 1997, 69: 429-432.