研究論文乙醇對角質(zhì)酶性質(zhì)的影響王莉,王森1.2(1.江南大學(xué)食品學(xué)院江蘇無錫214122:2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室江南大學(xué),江蘇無錫214122摘要:研究了乙醇溶液對角質(zhì)酶性質(zhì)的影響同時用圓二色光譜和熒光光譜法對經(jīng)過硫酸銨沉淀、鎳柱親和層析等方法獲得的電泳純角質(zhì)酶進行了構(gòu)象研究。結(jié)果表明,在體積分數(shù)40%、30%和20%乙醇溶液中角質(zhì)酶催化反應(yīng)的最適溫度分別為50、55和65℃;在37℃下,酶在體積分數(shù)20%~50%乙醇中具有較好的穩(wěn)定性,體積分數(shù)30%和40%乙醇對角質(zhì)酶具有激活作用;角質(zhì)酶在體積分數(shù)30%和50%乙醇中催化反應(yīng)的最適pH分別為9.5和9.0;在體積分數(shù)30%乙醇溶液中角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定范圍為6.~10.5.角質(zhì)酶在50℃的乙醇溶液中的失活動力學(xué)研究表明,角質(zhì)酶的失活屬于一級動力學(xué)反應(yīng)(R2>0.98)。從角質(zhì)酶構(gòu)象的研究結(jié)果可以看出,在乙醇體系中角質(zhì)酶的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)都發(fā)生了相應(yīng)的變化。關(guān)鍵詞:角質(zhì)酶;乙醇;酶學(xué)性質(zhì);構(gòu)象中圖分類號:Q814.9文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1673-1689(2012)01-033-07 Effect of Ethanol on the Property of Cutinase WANG Li, WANG Miao*1.2 (1. The School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China: 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122. China) Abstract: In this manuscript, effect of ethanol solutions on the biochemical property and con- formation of cutinase were studied. The results showed that the optimum temperatures of cuti- nase were 65 C, 55 C and 50 C respectively in 20%(V/V), 30% and 40% ethanol solutions. In 20% and 50% ethanol solutions cutinase was stable at 37C. In 30% and 50% ethanol solu- tions the optimum pH of cutinase were 9. 5 and 9.0 respectively. In 30% ethanol solution the pH stability range of cutinase was 6. 5-10. 5. In 30% and 40% ethanol solutions activity of cutinase at 37 C was enhanced. The inactivation kinetic of cutinase was researched in ethanol solutions at 50. The results showed that the inactivation kinetic of cutinase in ethanol solu- tions followed the first order reaction(>0.98). And the secondary and the tertiary structure conformations greatly changed in ethanol solutiods. Key words: cutinase, ethanol, enzymatic property, conformation生物酶作為高效的生物催化劑,傳統(tǒng)意義上是的催化反應(yīng)已經(jīng)倍受關(guān)注,酶學(xué)領(lǐng)域也有了一個全在水溶液中進行的,但是,目前對其在有機溶液中新的分支一非水酶學(xué)2。通常認為在極性溶劑中收日期:2092基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(20776063);家計劃863項目(2011AA100905)通信作者:王森(1962-),女江蘇無錫人工學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事食品生物化學(xué)方面的研究。 mail: mwangjiangnan. edu.cn WANG Li. et al: Effect of Ethanol on the Property of Cutinase Research Article酶的穩(wěn)定性較差,大部分非水相酶反應(yīng)均被限制于1.3試驗方法相對非極性的溶劑中。一方面非極性溶劑利于提1.3.1pNPB水解酶活力的測定分光光度法。高酶的穩(wěn)定性,另一方面,在非極性溶劑中酶易于酶活在20℃下測定,反應(yīng)體積為1mL,其含20μL保持其活性構(gòu)象而表現(xiàn)出高的催化活力。極性有酶液、50mmol/L對硝基苯丁酸酯和50mmol/L硫機溶劑會爭奪酶分子表面的結(jié)構(gòu)水,使酶失活。因磺脫氧膽酸鈉pH為8.0的緩沖液980μL。在405此,對酶在有機溶劑中性質(zhì)及穩(wěn)定性的研究主集nm記錄對硝基酚的生產(chǎn)速率。酶活定義:20℃下,中與非極性溶劑中3每分鐘催化對硝基苯丁酸酯水解1μmol對硝基酚角質(zhì)酶是一種可以降解角質(zhì)并產(chǎn)生大量脂肪的酶量為一個酶活力單位酸單體的水解酶,是a/水解酶家族中相對分子質(zhì)1.3.2酶的分離與純化將發(fā)酵液于4℃、量較小的成員,其活性中心含有典型的催化三元組1000r/min離心20min去除菌體,上清液經(jīng)質(zhì)量(Ser His so、sp17),具有酯酶和脂肪酶的功分數(shù)50%的硫酸銨鹽析,4℃10000r/min離心能。角質(zhì)酶可降解不溶性甘油三酯、可溶性酯和20min,得沉淀并透析,經(jīng)0.45nm的濾紙微濾,然角質(zhì)等聚酯,也能破壞角質(zhì)多聚物分子的酯鍵使其后經(jīng)鎳柱進行親和層析得純酶制品水解為單體和小分子寡聚體-。它作為一種多功1.3.3蛋白質(zhì)含量測定福林酚法能水解酶,在食品、化工及紡織等諸多領(lǐng)域都具有1.3.4Sa-age分析分離膠質(zhì)量濃度為12廣泛的應(yīng)用-g/dL,濃縮膠質(zhì)量濃度為2.5g/dL,電泳采用pH目前,國內(nèi)關(guān)于角質(zhì)酶的研究較少,國外對角8.3的Tris-hCl緩沖體系,電泳后用考馬斯亮藍質(zhì)酶的研究大多集中于酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)以及生產(chǎn)菌G250染色。株構(gòu)建、以及酶在反膠束體系中的性質(zhì)及應(yīng)13.5角質(zhì)酶性質(zhì)的研究角質(zhì)酶性質(zhì)研究采用用10-12,雖然有研究表明角質(zhì)酶在體積分數(shù)75%硫酸銨分級沉淀、透析后的粗酶液。乙醇中20℃下放置18h活力基本不喪失13,但并1)角質(zhì)酶在乙醇溶液中的最適反應(yīng)溫度以未對酶在乙醇體系中的性質(zhì)進行系統(tǒng)研究。乙醇ppB為底物,用不同體積分數(shù)乙醇溶液(20%、在工業(yè)中被廣泛應(yīng)用,是一種良好的有機溶劑,許30%、40%、50%)配制pH8.0、20mmol/L的緩沖多食品原料中功能性成分的提取都是用乙醇作為液代替pNPB水解酶活測定方法中的緩沖液,在不溶劑的,研究角質(zhì)酶在乙醇中的催化性質(zhì),將有助同溫度下(37~70℃)測定酶的剩余活力,以天然酶于擴大角質(zhì)酶的應(yīng)用范圍活力為100%,確定該酶在不同體積分數(shù)乙醇溶液中的最適反應(yīng)溫度。材料與方法2)角質(zhì)酶在體積分數(shù)30%和50%乙醇溶液中1.1實驗材料的最適反應(yīng)pH值分別用體積分數(shù)30%和50%角質(zhì)酶發(fā)酵液:作者所在實驗室提供;對硝基的乙醇溶液配制不同pH值(6.0~11.0)的緩沖液,苯丁酸酯(pNPB)、硫磺脫氧膽酸:購自公代替NPB水解酶活測定方法中的緩沖液,在其最司;其它試劑均為分析純試劑。適反應(yīng)溫度下測定酶的殘余活力,以天然酶活力為1.2實驗儀器100%,研究酶在體積分數(shù)30%和50%乙醇溶液中ARB120電子天平:尤尼柯上海儀器有限公司最適作用pH。所用的緩沖液體系是用體積分數(shù)產(chǎn)品AB204N電子天平:上海森信實驗儀器有限30%和50%乙醇溶液配制,分別為:20mmol/L磷公司產(chǎn)品;L20型pH計梅特勒托利多儀器有限酸緩沖體系(ph6.0~7.0);20mmol/ Tris--HCl公司產(chǎn)品; Backman Coulter(USA)臺式冷凍離心緩沖液體系(pH7.5~9.0);20mmol/L磷酸氫二機:上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;V-1800型可鈉NaOH緩沖體系(pH9.5~11.0)見分光光度計:上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品;F3)角質(zhì)酶在乙醇溶液中的熱穩(wěn)定性為了研7000熒光光譜儀:日本日立公司產(chǎn)品;MOS450究該酶的在不同體積分數(shù)乙醇溶液(20%、30%、AF-cd圓二色光譜儀:法國Bio -logic-公司產(chǎn)品40%、50%)中的熱穩(wěn)定性,將酶液按一定比例分別與不同體積分數(shù)乙醇溶液配制的pH8.020mmol研究論文王莉,等:乙醇對角質(zhì)酶性質(zhì)的影響 Tris-H-HCl緩沖液混合在37、45、50和55℃保溫,9.75%,以上各步的純化結(jié)果如表1所示。每隔一定時間取出部分酶液,立即在冰浴中冷卻,按pNPB水解酶活力測定方法測定殘余酶活。4)角質(zhì)酶在體積分數(shù)30%和50%乙醇溶液中的pH穩(wěn)定性將酶在37℃、不同pH值(pH6.0~11.0)的緩沖液中放置12h,每隔一段時間取出部分酶液,按pNPB水解酶活力測定方法測定殘留酶活。緩沖液體系同1.3.7。5)酶在乙醇溶液中的失活動力學(xué)將酶液按一定比例分別與體積分數(shù)20%、30%、40%、50%乙E醇溶液配制的pH8.0、20mmol/ Tris--HCl緩沖液混合,在50℃下放置一定時間,每 Lane隔一定時間取 Purified cutinase Lane Molecular weight marker出部分酶液,按pNPB水解酶活力測定方法測定殘97400B.66200;C.43000:D31000余酶活。圖1pNpB水解 SDS-PAGE酶的凝膠電泳根據(jù) Arrhenius方程lnA=-kt和lnk=lnk一 Fig. I SDS-PAGE of cutinase(E/RT)計算失活動力學(xué)參數(shù)。其中A是酶活,U/ml;T是絕對溫度,K;E是活化能;t12是半衰表1角質(zhì)酶純化過程參數(shù)期,min;t是保溫時間,min;R是氣體常數(shù),8.314 Tab.I The parameters of cutinase purification510j/(k·mol);k是速率常數(shù),1/min純化總酶活/U回收總蛋白質(zhì)/比酶活純化過程率%mg(/mg)倍數(shù)1.3.6角質(zhì)酶在醇溶液中的構(gòu)象圓二色光譜檢測:將純化后的樣品溶解于pH8.0、20mmol/L的粗酶液37384.40100.001965.9519.021.00Tris-HCl緩沖液中室溫放置30min,立即冰浴;樣鹽析37111.9599.27975.4538.052.00品溶解于體積分數(shù)30%、50%乙醇溶液配制的pH透析36858.6498.59896.0641.132.168.0、20mmol/ Tris-HCI緩沖液中,各自分別在鎳柱層析3646.689.7531.36116.286.1237℃、50℃下放置30min,立即冰浴。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.1mg/mL測定遠紫外區(qū)(190~250nm)2.2角質(zhì)酶在乙醇溶液中的性質(zhì)CD譜,掃描速度1nm/s,重復(fù)5次。圓二色譜用平2.21乙醇體積分數(shù)對角質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度的影均橢圓度[表示,單位為度·厘米2分摩爾(dg·溫度是影響酶催化作用的主要因素之一,一方cmdmol)面隨著溫度的升高,化學(xué)反應(yīng)速度加快,另一方面熒光光譜檢測:樣品處理方式同圓二色光譜檢高溫會使酶變性失活,有機溶劑的加入也會影響酶測。熒光掃描采用F-7000FL型分光光度計,激發(fā)反應(yīng)的最適溫度。因此,需要通過實驗確定酶在有波長為280nm,發(fā)射波長為290~450nm1-20機介質(zhì)中酶催化的最適溫度,以提高酶催化反應(yīng)速率。2結(jié)果與分析在不同體積分數(shù)乙醇溶液中,角質(zhì)酶的最適反2.1角質(zhì)酶的分離純化應(yīng)溫度也不同,且不同于酶在正常情況下的最適作將含有角質(zhì)酶的發(fā)酵液通過硫酸銨分級鹽析、用溫度60℃。由圖2可知,體積分數(shù)20%、30%透析、鎳柱親和層析進行分離純化,純化表見表1,和40%乙醇溶液中,酶的最適反應(yīng)溫度分別為得到的樣品通過 SDS-PAGE凝膠電泳檢測只顯現(xiàn)65℃、55℃和50℃,且當(dāng)乙醇體積分數(shù)低于40%時,出一條譜帶,說明純化的角質(zhì)酶已達到電泳純(圖角質(zhì)酶的催化活力明顯高于其在緩沖液中,該體系1)。純化后pNPB水解酶比活力從19.02U/mg提對角質(zhì)酶具有激活作用,在體積分數(shù)30%乙醇溶液高到116.28U/mg,純化倍數(shù)為6.12,回收率為中的酶活力最高可達緩沖液中的2.14倍,當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到50%時,酶活力顯著降低。有研究表明 WANG Li.et al: Effect of Ethanol on the Property of Cutinase Research Article上述現(xiàn)象可能是由于適當(dāng)體積分數(shù)的乙醇改變了酶37℃45℃50℃55℃的構(gòu)象,從而使酶分子更有利于與底物接觸進行催化120反應(yīng),當(dāng)乙醇濃度過高時,它對酶構(gòu)象的改變超出了10080酶的承受能力,使酶變性,酶活力下降甚至失活2。避6020%30%40%50%4022020170204080100期炙時間/min120(b)買7037℃45℃12050℃55℃20401003540455055606570溫度℃80圖2不同體積分數(shù)乙醇中角質(zhì)酶的最佳反應(yīng)溫度60 Fig.2 Optimal temperature of cutinase in ethanol solutions402.2.2角質(zhì)酶在乙醇溶液中的熱穩(wěn)定性研究角20質(zhì)酶在乙醇溶液中熱穩(wěn)定性研究表明(見圖3)。在0008020406080100體積分數(shù)20%乙醇溶液中,45℃以下酶活基本保持時間/min不變,酶相對穩(wěn)定。溫度高于45℃時,隨著溫度的(c)升高,酶的穩(wěn)定性顯著降低(圖3(a));在體積分數(shù)12037℃45℃50℃55℃30%乙醇溶液中,37℃時酶穩(wěn)定性較好,在此條件100下保溫100min后,殘余酶活仍比在緩沖液中的原80始酶活高。但在45℃下酶的穩(wěn)定性有所下降,且隨著溫度升高酶穩(wěn)定性快速下降(圖3(b));當(dāng)乙醇買40體積分數(shù)為40%~50%時,酶只在37℃具有較好的20熱穩(wěn)定性(圖3(c)、(d))。這說明酶在高體積分數(shù)20406080100的乙醇溶液中,只有在低溫下具有較好的穩(wěn)定性。時間/mi(d)角質(zhì)酶在水溶液中40℃下保溫70h,殘留酶活仍在80%以上;在60℃時半衰期為42h,與此相圖3角質(zhì)酶在乙醇溶液中的熱穩(wěn)定性(a、b、cd分別為角質(zhì)酶在體積分數(shù)20%、30%、40%和50%乙醇中的熱比在乙醇溶液中熱穩(wěn)定性有所下降。乙醇是與水穩(wěn)定性)互溶的極性溶劑,會與酶爭奪水分子,甚至除蛋Fig.3 Thermostability of cutinase in ethanol solutions白質(zhì)分子的“必需水”層,擾亂酶分子天然構(gòu)象的形(20%),b(30%),c(40%)andd(50%)成3,在乙醇存在的條件下,高溫更易使酶變性,從2.2.3角質(zhì)酶在乙醇溶液中的最適pH值由上而使酶在醇中的穩(wěn)定性降低。述研究結(jié)果可知角質(zhì)酶在體積分數(shù)30%乙醇溶液中的催化活性最高,當(dāng)乙醇體積分數(shù)大于30%時,1203050℃5角質(zhì)酶的催化活性下降,達到體積分數(shù)50%時只在10037℃下有一定的穩(wěn)定,選擇研究體積分數(shù)30%和8050%乙醇中角質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH值具有代表性。60前人研究表明,角質(zhì)酶在水溶液中的最適pH408.01,乙醇對角質(zhì)酶最適pH值的影響如圖4所200示,角質(zhì)酶在乙醇溶液中的最適反應(yīng)pH值發(fā)生了020406080100時間/min改變,在體積分數(shù)30%、50%乙醇溶液中的最適反 (a)應(yīng)pH值分別為9.5和9.0,在體積分數(shù)30%乙醇研究論文王莉等:乙醇對角質(zhì)酶性質(zhì)的影響溶液中pH8.0~10.0范圍內(nèi)酶活變化不大,但均-pH6.0-ph9.5pH11.0比在水溶液中有大幅提高,當(dāng)pH為9.5時,最大活 150--pH 6.5-X-pH8.0-0-pH10.5pH7.0力是水中的2.45倍。很多研究表明酶在有機介質(zhì)120中催化反應(yīng)的最適pH值通常與酶在水溶液中反應(yīng)90的最適pH值接近或相同7,這主要是針對非極60性有機溶劑而言,乙醇是與水互溶的極性溶劑,它30對角質(zhì)酶的激活效應(yīng)有待進一步探討。體積分數(shù)30%乙醇681012250體積分數(shù)50%乙醇時間200圖5角質(zhì)酶在體積分數(shù)50%(a)、30%(b)乙醇中的pH穩(wěn)150港安要定性100 Fig. 5 pH stability of cutinase in ethanol solutions (a)(50%)and(b)(30%)502.2.5角質(zhì)酶在乙醇溶液中的失活動力學(xué)為了進一步探索分析不同體積分數(shù)乙醇對角質(zhì)酶活力 pH的影響,作者對50℃下角質(zhì)酶的失活動力學(xué)進行圖角質(zhì)酶在體積分數(shù)30%、50%乙醇中的最適反應(yīng)H值研究,不同乙醇體積分數(shù)下角質(zhì)酶的失活動力學(xué)曲 Fig.4 Optimal pH of cutinase in ethanol solutions線見圖6所示。2.2.4角質(zhì)酶在乙醇溶液中的pH穩(wěn)定性由角體積分數(shù)20%乙醇質(zhì)酶在乙醇溶液中最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性可體積分數(shù)40%乙醇知,37℃時角質(zhì)酶在體積分數(shù)50%以下的乙醇溶體積分數(shù)30%液中都具有一定的穩(wěn)定性,且角質(zhì)酶在體積分數(shù)30%乙醇溶液中活性最高;從角質(zhì)酶在乙醇溶液中6.5最適反應(yīng)pH的研究結(jié)果可知,角質(zhì)酶在體積分數(shù)50%乙醇溶液具有一定的酶活,且乙醇作為一種食5.5品級的有機溶劑,高體積分數(shù)的乙醇在工業(yè)中被廣泛應(yīng)用因此研究角質(zhì)酶在體積分數(shù)50%乙醇中的5pH穩(wěn)定性是有必要的。角質(zhì)酶在乙醇中的pH穩(wěn)定4.5性如圖5所示,在體積分數(shù)50%乙醇溶液中角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定性較差,短時間內(nèi),在pH6~7的范圍內(nèi)405101520時間/min有一定穩(wěn)定性,當(dāng)pH到9.0時,酶的穩(wěn)定性迅速下圖6角質(zhì)酶在醇溶液中的失活動力學(xué)曲線降(圖5(a)),而在30%乙醇溶液中角質(zhì)酶較穩(wěn)定,Fig.6 Inactivation curves of cutinase in ethanol solutionspH穩(wěn)定范圍為pH6.5~10.5(見圖5(b))從圖6可以看出,角質(zhì)酶的失活反應(yīng)基本符合150→pH6.0一級反應(yīng)動力學(xué)的規(guī)律,利用 Arrhenius方程可以6120pH7.0計算出各種失活動力學(xué)參數(shù),結(jié)果如表2所示。pH8.0從表2可以看出,隨著醇體積分數(shù)的增大,酶90pH9.0的失活速率常數(shù)增加,失活的活化能下降。角質(zhì)酶60在體積分數(shù)20%乙醇溶液中半衰期為71.63min,00而在體積分數(shù)50%乙醇溶液中其半衰期迅速下降到5.23min。這說明50℃下角質(zhì)酶會很快失活。024681012時間/h酶失活的活化能E,與角質(zhì)酶的穩(wěn)定性有關(guān),E越(a)大角質(zhì)酶越穩(wěn)定,由此也可以看出隨著醇體積分數(shù) WANG Li.et al: Effect of Ethanol on the Property of Cutinase Research Article的增大,角質(zhì)酶的穩(wěn)定性在下降。條件下角質(zhì)酶的熒光強度。蛋白質(zhì)在340nm左右表2角質(zhì)酶在醇溶液中的失活動力學(xué)參數(shù)的熒光強度主要與蛋白質(zhì)分子中Trp和Tyr殘基Tab.2 The inactivation kinetic parameters of cutinase in eth--的暴露和解離的程度有關(guān)2,213。熒光發(fā)射光譜的 anol solutions變化與生色基團的微環(huán)境等多方面因素相關(guān)。由乙醇失活速率活化能半衰期此推測,角質(zhì)酶在37℃下30%乙醇中三級結(jié)構(gòu)發(fā)體積分數(shù)/%常數(shù)kE()/(min)生了有利于催化活性的變化。200.009617636.0771.63表3角質(zhì)酶分子構(gòu)象中各結(jié)構(gòu)單元含量300.053112997.2213.89 Tab. Secondary structural compositions of cutinase400.105611106.916.86處理方式a螺旋/%3折疊/%轉(zhuǎn)角/%無規(guī)則500.118610712.085.23卷曲/%緩沖液、常溫42.3715.2717.3925.082.2.6角質(zhì)酶在醇溶液中的構(gòu)象上述研究表明30%乙醇、37℃9.2445.8810.8433.94角質(zhì)酶在37℃體積分數(shù)30%的乙醇溶液中具有較30%乙醇、50℃55.663.4019.4220.52高活性,且有較好的穩(wěn)定性,為此,作者對角質(zhì)酶的構(gòu)象進行了研究。圖7是角質(zhì)酶在不同溫度下、不50%乙醇、37℃9.1145.9510.9133.93同體積分數(shù)的乙醇溶液中放置30min后測得的圓50%乙醇、50℃9.3245.7910.7234.17二色圖譜。2401030%37℃190緩沖液50%37℃37℃30%一緩沖液37℃50%50%50℃14030%50℃50℃30%230250米9050℃50%4020503800-10290320350380410440波長/nm波長/nm圖7不同方式處理后角質(zhì)酶的圓二色光譜圖8不同方式處理后角質(zhì)酶的熒光發(fā)射光譜圖 Fig. 7 Circular dichroism spectrums of cutinase incubated Fig.8 Fluorescence intensity of cutinase incubated 30min in 30min in different ways different ways從圖7可以看出,在不同體積分數(shù)的乙醇溶液3結(jié)語中角質(zhì)酶CD光譜有較大差別,通過 SELCON3軟件分析,得出角質(zhì)酶在不同體系中a螺旋、折疊、1)角質(zhì)酶在低體積分數(shù)的乙醇溶液中的催化轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲的比例(見表3)從表3的數(shù)據(jù)性質(zhì)發(fā)生了變化。20%、30%、40%乙醇溶液中的可以看出,酶的相對活力與其二級結(jié)構(gòu)之間沒有明最適溫度分別為65、55、50℃。熱穩(wěn)定性研究表顯的相關(guān)性。因此作者采用熒光光譜法對酶蛋白明,在37℃下,酶在體積分數(shù)20%~50%乙醇中都的三級結(jié)構(gòu)進行進一步的研究。圖8是不同體系具有較好的穩(wěn)定性中角質(zhì)酶的熒光發(fā)射光譜,角質(zhì)酶在336~342nm2)角質(zhì)酶在體積分數(shù)30%和50%乙醇中催化處有一特征熒光發(fā)射峰,但在50℃下、體積分數(shù)反應(yīng)的最適pH分別為9.5和9.0。在30%乙醇溶50%乙醇中角質(zhì)酶的熒光發(fā)射峰位紅移至34nm,液中角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定范圍為6.5~10.5;在50%其他條件下角質(zhì)酶的熒光發(fā)射峰未發(fā)生位移,只是乙醇溶液中角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定性較差。熒光強度不同,對于活力較高的37℃下30%乙醇3)角質(zhì)酶在50℃的乙醇溶液中的失活動力學(xué)中的角質(zhì)酶,在336nm的熒光強度明顯低于其他研究表明角質(zhì)酶的失活屬于一級動力學(xué)反應(yīng)(R2研究論文王莉等:乙醇對角質(zhì)酶性質(zhì)的影響>0.98)活性沒有明顯相關(guān)性,但與三級結(jié)構(gòu)有很大的相關(guān)4)用CD光譜法和熒光光譜法對電純的角質(zhì)性,且角質(zhì)酶在37℃下30%乙醇中三級結(jié)構(gòu)可能酶進行構(gòu)象研究表明,角質(zhì)酶的二級結(jié)構(gòu)與其催化發(fā)生了有利于催化活性的變化。參考文獻(References):[1]陳晟,陳堅,吳敬一種嗜熱細菌來源角質(zhì)酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[]應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報2009,15(6):846-850 CHEN Sheng. 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