江西農業(yè)學報200,19(11):70-72Acta Agriculturae Jiangxi鐵釘菜乙醇提取物對真菌生長的影響歐陽桐嬌,鄭怡2,劉艷如2,林勇3,郭文杰,江枝和3(1.福建省農科院生物技術研究所,福建福州35003;2,福建師范大學生命科學院福建福州350007;3.福建省農科院土壤肥料研究所福建福州350013)摘要:鐵釘萊乙醇粗提物通過薄層層析法分離活性物質,分別采用紙片法和菌餅法測定了鐵釘苿提取物及薄層層析帶對3種真菌的菌絲生長的影響,用玻片法測定了對孢子萌發(fā)的抑制作用。實驗結果表明:乙醇提取物對3種真菌孢子萌發(fā)的抑制作用最強,其中,濃度在0.005-/mL時對綠色木霉和黑曲拿孢子萌發(fā)的抑制率均達到9%。關鍵詞:鐵釘萊;薄層層析;真菌;萬絲生長;孢子萌發(fā)中圖分類號:Q949.327.1文獻標識碼A文章編號:1001-8581(2007)11-0070-03QUYANC of etha n o ENt aCt fr ym iskig e r yAm u guo g w h n znhezhou 350003. China2. College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China;3. Institute of Soil and Fertilizer, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, ChinaAbstract: Active substances separated by TLC from the ethanol extract of ishige okamura were used to study their effects on thehyphal growth of three fungi by using the method of disc and flter paper, as well as their restraining effects on the spore germination byusing the slide method. The results indicated that ethanol extract showed strong inhibition to the spore germination of three fungi anthe maximum inhibitory rate reached 97. 0% to Trichoderma wride and Aspergillus niger under the concentration of 0. 005 mg/mL.ls: Ishige okamura; Thin layer chromatographic analysis; Fungus; Hyphal growth; Spore germination海洋占地球總面積的71%,蘊藏著極其豐富的生物細菌、真菌對抗生素耐藥性和抗藥性的加強,尋找新的抗資源是有機物質的最大生產者。這些有機物基本上是菌活性物質已成為了當務之急。而海洋生物的多樣性、海洋浮游植物合成的特別是海藻。因此可以說海洋藻特殊性及復雜性是理想的新的抗菌素的資源寶庫。海藻類是世界上最大的有機物合成并儲存的資源寶庫并且抗菌活性物質的研究主要包括對具抗菌活性種類的篩它們在海洋中分布廣泛從大洋水體到世界各沿岸海區(qū),選抗菌活性物質的提取、分離純化及化學成分分析和結生活環(huán)境變化多端,物種和生活環(huán)境的多樣性為海洋藻構鑒定等。本研究以綠色木霉( Trichoderma viride)、黑曲類帶來了其生物活性物質的多樣性。由于海洋環(huán)境的特霉( Aspergillus niger)、圓弧青霉( Penicillium cyclopium)為殊性很多的海洋生物在高鹽、高壓、缺氧等惡劣生活環(huán)研究對象研究了乙醇提取物及薄層層析分離物對其生境的長期進化和發(fā)展的過程中為適應生存和競爭生存長的影響旨在為進一步開發(fā)利用海藻的天然活性物質空間形成并產生了許多結構獨特而藥理作用顯著的海提供借鑒。洋次生代謝物質如抗菌、抗病毒、抗腫痼抗氧化等活性1材料與方法物質而海藻作為海洋生物鏈的第一生產者,為了抵1.1材料鐵釘菜采自石獅海域;海藻采回后立即清洗抗外界微生物的感染和獵食者的吞食而獲得生存,它們于凈室內陰干陰涼處保存?zhèn)溆?。在不斷的進化過程中產生了對各種敵害生物的抗性。由1.2真菌本實驗的供試真菌有3種即綠色木霉(mi于海藻本身沒有像高等動物那樣的細胞免疫系統(tǒng)它們 choderma tinde)、黑曲霉( Aspergillus niger)圓弧青霉的這種抗性是一種有目標地產生化學物質的防衛(wèi)機制,( Penicillium cyclopium),由福建農林大學許文耀教授分一般為藻類產生的次生代謝物質。另外海洋藻類還是離純化本實驗室保存。很多其他消費者的活性物質的主要來源。自20世紀601.3試劑石油醚、丙酮、乙醇、乙酸乙酯均為國產分析年代人們提出“向海洋要藥”的口號起,近40年來海洋純薄層層析硅膠為青島海洋化工有限公司產品。化學及生命科學研究成為熱點之一12)。其中對于海14洋藻類抗菌活性物質的研究由來已久特別是隨著很多司);SHH中國煤化工斯特儀器有限公CNMHG一州長城科工貿收稿日期:2007-08-06基金項目:福建省科技廳重點項日(2005N096)。作者簡介:歐陽桐嬌(1963-),女福建平渾人助理研究員從事植物資源化學研究工作。歐陽桐嬌等:鐵釘菜乙醇提取物對真菌生長的影響71有限公司);旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);電熱恒28℃恒溫?；炫囵B(yǎng)6h,顯微鏡下觀察并記錄孢子萌發(fā)溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠);VD-650型桌上式潔凈情況。以等量的乙酸乙酯為對照每處理重復3次按下工作臺(蘇州凈化設備);電熱手提式壓力蒸汽滅菌器面公式計算孢子萌發(fā)抑制率:(上海醫(yī)用核子儀器廠);TDCC2-3接觸調壓器(浙江正孢子萌發(fā)抑制率=(1-處理萌發(fā)率/對照萌發(fā)率)泰電器股份有限公司);雙層鐵皮電爐(上海申航五金電x100%器廠丹陽分廠);F-I型三用紫外分析儀(上海顧村電2結果與分析光儀器廠)。2.1乙醇提取物抗真菌活性通過對鐵釘菜乙醇浸提1.5方法后得到的粗提物經薄層層析后取各個特征帶的乙醇浸151鐵釘菜樣品的處理將已經在通風處陰干的鐵泡液并以乙醇作為對照采用紙片法進行抗菌試驗抗菌釘菜,用高速萬能粉碎機粉碎保存于干燥器中備用。結果如表1所示通過薄層層析后R052對圓弧青霉的152鐵釘萊的浸提液的制備取干鐵釘菜粉末適量,抗菌活性明顯增加,而對黑曲霉、綠色木霉的抗菌活性消加入5倍體積的有機溶劑(乙醚、乙醇),于50℃水浴鍋失,R081的抗菌活性減弱。中浸提72h,常溫下每3d過濾1次,再加等量的有機溶表1鐵釘菜提取物及層析帶的抗真菌活性劑連續(xù)3次,得到浸提液。提取物及層析帶黑刪賽綠色木霉圓弧育莓15.3粗提物的制備將浸提液經旋轉蒸餾,直至把有乙醇提取物機溶劑全部蒸出獲得干物質即是粗提物每一次旋轉蒸Rf0.52餾時都要過濾兩次。旋轉蒸發(fā)時當蒸餾瓶中的有機溶0811.24注:表中數(shù)據(jù)為抑制圈直徑(mm);-表示沒有抑制效果。劑很少時,每隔30min稱重1次,直至恒重15.4萃取將獲得的粗提物以10倍的比例,倒蒸2.2鐵釘菜乙醇提取物對菌絲生長的抑制作用以乙餾水充分振蕩直到粗提物不再溶解同樣以10倍的比醇作為對照測定鐵釘菜乙醇浸提粗物和薄層層析帶乙例倒人乙酸乙酯充分振蕩至粗提物全部溶解然后把溶醇浸泡液對菌絲生長的抑制作用試驗結果表明鐵釘菜液倒入分液漏斗中,上下充分振蕩后,放在鐵架臺上靜置乙醇提取物及各薄層層析帶對綠色木霉均沒有明顯的抑至分層將水相和乙酸乙酯相分別收集。萃取時振蕩制作用;從表2可見,乙醉提取物、R0.52、R05、0.63對圓弧青霉的抑制率都隨著時間的增加而降低,其定要充分靜置后取乙酸乙酯相這樣就配制成0.1B影中R0.5的抑制率最高,R(0.60反而促進其菌絲mL的粗提有機溶劑溶液。由表3可知,乙醇提取物及薄層層析的3個帶即Rf1.55薄層層析分離方法制作薄層層析板稱取薄層000、R063、Rf0.81對黑曲霉的抑制率隨時間的增加層析硅膠10g量取30mL質量分數(shù)為05%的羧甲基纖而降低,H063對黑曲霾的抑制率較原粗提物高出116維素鈉,倒入研缽內研磨10min,后鋪板、顛板、在光線下29.5個百分點,而有些條帶則表現(xiàn)出促進生長作用觀察,直至板均勻為止,常溫下自然風干。烘箱中100℃表2鐵釘菜提取物及層析帶對圓弧條件下,烘30min活化距離板邊緣1.5cm處先畫上膏霉菌絲生長的抑制率條基線然后將浸提液點到基線上。將板點好后,配制展培養(yǎng)時間乙提層劑將其倒入層析缸中再把板放入層析缸,等各個特(h)取物000.50.550.60.630.81征帶分離后即可把板拿出。展層劑為丙酮:石油醚=12433.33.366.7-86733.3-66.736429-28.614.357.1-8.714.3-14.315.6特征帶的制備對已經分離好的多個板觀察展注濃度為00gmL出來的條帶數(shù)計算出R值準備好試劑瓶收集特征帶表3鐵釘菜提取物及層析帶對黑曲霉1.5.7菌絲生長抑制實驗采用菌餅法進行生長速率菌絲生長的抑制率測定在PDA平板表面中心接種菌餅然后用移液槍取時間乙膀提h)取物0000.520.550.600.630.8120μ鐵釘菜提取液,注射在菌餅周圍。以等量的乙酸212.6153-2.5-4.1-1641x.5乙酯作為對照每處理重復3次。28℃恒溫培養(yǎng)。觀測3616712.6-20.8-12512.52.34.2菌絲生長測量直徑連續(xù)測量3次記錄數(shù)據(jù)。按慕立注:濃度為00gm義的方法計算抑制率菌絲生長抑制率=[1-(處理23鐵釘菜提職物對孢子萌發(fā)的抑制作用對鐵釘菜組生長直徑一菌餅直徑)/(對照組生長直徑-菌餅直乙醇粗中國煤化工(以乙醇作為對照)進CNMHG-6。從表4看1.5.8孢子蒴發(fā)抑制實驗采用玻片法往干燥潔凈的出乙醇提取物的分離帶斑052對圓弧青霉的孢子萌無菌口玻片凹孔中滴加100μ海藻提取液在超凈合上發(fā)有抑制作用,而鐵釘菜乙醇提取物在濃度0.005g/mL揮發(fā)至干;然后每孔滴加100μL配制好的孢子懸浮液,時抑制率達到了最高。從表5看出鐵釘菜乙醇提取物江西農業(yè)學報對綠色木霉孢子萌發(fā)有抑制作用濃度為005g/m時林雄平等使用乙酸乙酯和水對海藻乙醇提取物進行抑制率達到了99%。從表6中可以看出,R0.52對黑曲萃取后對兩萃取相分別采用薄層層析進行了初步分離霉孢子萌發(fā)的抑制率隨著濃度的下降而降低并測定了不同層析帶的抑菌活性,結果發(fā)現(xiàn)大部分薄層表4鐵釘菜提取物及層析帶對層析分離組分的抗菌活性均強于分離前的粗提物。作者圓弧青霉孢子萌發(fā)的抑制率%所做的實驗也用薄層層析法分離了乙醇提取物表明大提取物及層析帶濃度(g/mL)部分薄層層析分離組分都有抗菌活性可是沒有粗提物0.0100.0050.00l的活性高。乙醇提取物R0.52本實驗采取了菌餅法、玻片法、紙片法測定鐵釘菜提取物對3種真菌生長的影響,其中紙片法是比較成熟表5鐵釘菜提取物及層析帶對的方法前人經常有使用紙片法的報道而其他2種方法綠色木霉孢于萌發(fā)的抑制率的報道較少。本文菌餅法、玻片法的實驗結果與紙片法提取物及層析帶濃度(g/mL)的實驗結果還是比較一致的。0.0100.001乙醇提取物Rf0.555876參考文獻:Rf0.60[1]劉湘,汪秋安天然產物化學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005,118-126表6鐵釘菜提取物及層析帶對[2] Selective cytotoxicity of marine algae extracts to several human黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制率leukemic cell lines[J]. cytotechnology, 1997, 252(1-3):13提取物及層析帶濃度(g/mL0.0100.005[3]董春景,賀娟,梁惠,等海藻提取物抑瘤活性及抗氧化作用乙醇提取物8092的觀察[].齊魯醫(yī)學雜志,2006,4(2l):98-100.Rf0.52[4]慕立義,植物化學保護研究方法[M].北京:中國農業(yè)出版社,1994.80~813討論5]陳灼華鄭怡,莊惠如10種紅藻和褐藻抗細菌抗真菌活性前人研究業(yè)已證明海藻中含有豐富的抗菌活性物的研究[].福建師范大學學報:自然科學版,194,10質并且有良好的抗細菌活性。但對海藻提取物中是否有抗真菌活性物質尚存在爭議。有研究表明,海藻6徐年軍,范曉,韓麗君等海藻乙醇提取物抗菌活性的研究提取物的抗細菌活性和抗真菌活性相當。而有的試驗結[.海洋與湖沼,200,3(2):265~270.果表明海藻提取物沒有抗真菌活性。 Sreenivas和had[7] ZHENG Y, CHEN Y S, H. Screening for antibacterial andantifungal activities in some marine algae from the Fujian coast ofakuma發(fā)現(xiàn)海藻提取物具有抗真菌活性。陳灼華等China with three dierent solvents[J]. Chinese Journal Oceano和 Zheng,etl的研究也都證明了海藻提取物的抗真菌 yy and Limnology,x00,9(4):x7-3活性。作者所做的實驗表明鐵釘菜乙醇提取物有一定的[8]林雄平,鄭怡,陳曉清.三種褐藻乙醇提取物抗動植物病原抗真菌活性。菌活性[J].福建師范大學學報:自然科學版,2005,21海藻提取物中有許多的活性物質。徐年軍等和1):12(上接第的9頁)油脂,00,(6參考文獻:[S Cora J Dillard, German J B. Review phytochemicals: nutraceuti[1]戴洪平,王興國,金青哲HPC法測定芝麻油中生理活性成cals and human health [J]. J. Sci. Food Agric. 2000, 80分芝麻素[食品科技200,(3):86~88[2]王可成王虹胡麻名考中藥材,19920(9):479-480[6]k P. Suja, A. Jayalekshmy. Antioxidant activity af sesame3]s Sirat Yasumoto, M Katsuta. Efect o sesame sceds rich incake extract [J]. Food Chemisesamin and sesamolin on fatty acid amidation in n liver [J]. [7] Lee-Wen Chang, Wen-Jye Yen. Artionidant activity o seJournal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(5): 2647ne coat [ J]. Food Chemistry, 2002, (78): 347-354[8]李偉紅戴廷燦熊艷HPLC法測定畜禽內中沙丁肢醇的殘[4]唐傳核彭志英芝麻木酚素“芝麻素”研究概況[]糧食與TH中國煤化工CNMHG