浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)2003,20(2): 141~ 145Journal of Zhejiang Forestry College文章編號(hào): 1000-5692( 2003 )02-0141-05大血藤RAPD條件的優(yōu)化金則新|,李鈞敏1,鐘章成2(1.臺(tái)州學(xué)院生物系,浙江臨海317000;2.西南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重慶北碚400715)摘要:在進(jìn)行大血藤遺傳多樣分析時(shí),首先要建立大血藤RAPD反應(yīng)優(yōu)化體系,有必要就反應(yīng)條件進(jìn)行探索。以改進(jìn)SDS法抽提藤本藥用植物大血藤葉片總DNA,進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA( RAPD)分析,分別測(cè)試了鎂離子、dNTP、 模板DNA含量、引物濃度、DNA 聚合酶量和牛血清白蛋白濃度對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。通過(guò)各因子的組合研究,得出大血藤RAPD分析較適宜的擴(kuò)增條件是: 15 pμL PCR反應(yīng)體積，1 x Taq酶配套緩沖液( 10 mmot L-1 Tris HCI pH9.0, 50 mmol L-1 KCl , 0.1%Triton X-100，1.5 mmol L-1 MgCl); 25.01x 10-9mol s-1 Taq酶(上海華美公司); 10 ng模板DNA; 15 pmol引物(上海Sangon公司); 2g L-1 BSA; dATP ,dCTP , dGTP和dTTP各0.15 mmot L-'。圖4表2參8關(guān)鍵詞:大血藤; RAPD;化學(xué)成分;藥用植物中圖分類(lèi)號(hào): Q946文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A大血藤Sargenodoxa cuneata 隸屬大血藤科Sargentodoxaceae大血藤屬。大血藤科為我國(guó)所特有1。大血藤為落葉木質(zhì)藤木,長(zhǎng)達(dá)10 m,根和藤可入藥,有強(qiáng)筋骨、活血散瘀、止痛和通經(jīng)之效,并可治療闌尾炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等,又可用作殺蟲(chóng)劑2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)大血藤的研究較少,僅對(duì)大血藤的次生代謝產(chǎn)物如三萜類(lèi)皂素3]木質(zhì)素4]和黃酮5]等進(jìn)行了研究。為探索大血藤種群的遺傳變異,從分子水平闡明植物變異與環(huán)境的關(guān)系。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA ( random amplifed polymorphie DNA , RAPD)是運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DAN片段,用以作為分子標(biāo)記的-種分子生物學(xué)研究手段,具有快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)6。利用RAPD技術(shù)對(duì)大血藤種群進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí),首先要建立穩(wěn)定的反應(yīng)體系,有助于RAPD結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。為此,我們就大血藤RAPD反應(yīng)中的dNTP濃度、鎂離子濃度、Taq酶用量、模板DNA濃度、引物濃度和牛血清白蛋白( bovine serum albumin , BSA )等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),建立了重復(fù)性強(qiáng),穩(wěn)定的大血藤RAPD反應(yīng)參數(shù),為進(jìn)-步分析大血藤遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)資料。1材料與方法1.1 模板DNA的制備與定量將采自浙江省臨海市云峰的大血藤嫩葉,用濕布包裹,塑料袋封裝,立即帶回實(shí)驗(yàn)室,洗凈后晾干,凍于- 70C超低溫冰箱中,備用。大血藤DNA抽提根據(jù)劉康德等7]方法進(jìn)行改進(jìn),取_ 70 °C凍存葉片研磨成粉狀，取0.1 g轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,加入500 pμL提取緩沖液[ 100 mmohYH中中國(guó)煤化工, 3%可溶性PVP, 20mmot L-'β-巰基乙醇, 20 mmot L-1 EDTA ( pH8.0)],CNMHG,棄上清,取沉淀加入收稿日期: 2002-08-02 ;修回日期: 2003-01-13基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(39870160)作者簡(jiǎn)介:金則新(1960-),男,浙江臨海人,教授,碩土,從事植物生態(tài)學(xué)等研究。142浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)2003年6月500山裂解緩沖液[ 100 mmot L-1 Tris HCl (pH 8.0), 20 mmot L-1 EDTA ( pH8.0), 500 mmot L- 1NaCl , 1.5%SDS], 65 C水浴30 min ,不時(shí)輕輕顛倒,取出加入500 μL氯仿/異戊醇(24:1),顛倒成乳濁狀, 10000↑min- I離心10 min ,取.上清加入體積分?jǐn)?shù)為0.25乙醇和體積分?jǐn)?shù)為0.11的5 mmolL-1 KAc( pH4.8),立即10000r min-|離心10 min ,取上清加入體積分?jǐn)?shù)0.6異丙醇,置-20 C冰箱30 min, 12 000r min- 1離心10 min ,取沉淀,溶于30pL TE(含RNase5mg L-1)備用。DNA定量采用紫外分光光度計(jì)(日本島津UV-2401 PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì))與瓊脂糖凝膠電泳雙重定量。紫外分光光度法以ADNA為標(biāo)準(zhǔn)品，以A260對(duì)DNA進(jìn)行定量;電泳圖譜經(jīng)UTHSCSAImageToo軟件分析熒光面積，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量參照物比較定量而得。1.2 RAPD反應(yīng)程序表1 Mg2+ 與dNTP濃度組合本實(shí)驗(yàn)所用的PCR儀為上海高機(jī)公司生產(chǎn)的Table 1 Different treatment of Mg2 + and dNTP concentrationSRX-481 PCR儀。經(jīng)過(guò)摸索,得適合大血藤RAPD分管號(hào)dNTP濃度/ ( mmod L-1)Mg2+濃度/ ( mmot L-1) .析的PCR反應(yīng)程序(用6 C循環(huán)水冷卻); 94 C預(yù)變0.101.性5min, 94 C變性1 min, 40 C退火1 min, 72 C延1.8伸2min,共35個(gè)循環(huán),72C最后延伸5mino，2.11.3大血藤RAPD實(shí)驗(yàn)中各影響因素2.40.151.51.3.1 Mg2+與dNTP濃度對(duì)RAPD擴(kuò)增的影響15pu山PCR反應(yīng)液中含1x Taq酶緩沖液, 16.67x 10-97mol s-1 Taq酶(上海華美公司), 10 ng模板DNA，820 pmol引物(上海Sangon 公司),2g L-1牛血清90.20白蛋白。Mg2+與dNTP濃度見(jiàn)表1 ,加水補(bǔ)足體積至15 pu山,覆蓋石蠟油按方法1.2進(jìn)行PCR。1.3.2 其余因素對(duì)RAPD擴(kuò)增的影響 模板DNA .量、引物用量、Taq酶量和BSA濃度如表2所示，各管加水補(bǔ)足體積至15 μl。覆蓋石蠟油按方法1.2表2供試因子濃度用量Table 2 Volume of each factor concentration共有成分引物/pmol模板DNAVngTaq酶/ (mol s-1)BSA/(g門(mén))13014151(16.67x 10-92161718195(207:21100221251x Taq酶緩沖液8.34x 10-91.5 mmol L~ 'MgC22416.67x 10-2:0.1 mmo L-'4 x dNTP1025.01 x 10-92633.34x10-27中國(guó)煤化工280.5029MHCNMHG0.753(1.003116.67x10-91.50322.0032.50343.00第20卷第2期金則新等:大血藤RAPD條件的優(yōu)化143進(jìn)行PCR。1.4 PCR產(chǎn)物的鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物取15 μ山在2%瓊脂糖凝膠(0.5xTBE,含5g L- l溴化乙錠)上進(jìn)行電泳分析,于上海天能GIS凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技服務(wù)公司)拍照保存。2結(jié)果與討論2.1 大血藤DNA的提取及分析按方法所述對(duì)大血藤嫩葉DNA進(jìn)行抽提,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射反射分析儀中分析結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示大血藤DNA分子量在23 kb以上,確定是基因組DNA。2.2 Mg2+ 濃度與dNTP濃度對(duì)RAPD帶影響不同Mg2+濃度與dNTP濃度的組合對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果的影響如圖2所示。由圖2可知, dNTP濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較大，當(dāng)dNTPThe genomic DNAof--王人DNAHin dIII molecularSargentodoxa cureataweight standard濃度較低(0. lmmot L-1)時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較少,并且隨著Mg2+ 濃度的升高,擴(kuò)增的條帶數(shù)明顯增加,亮度也明顯增加。當(dāng)Mg2+濃度為1.5mmotL1和1.8mmotL1時(shí),只出現(xiàn).分子量較小的條帶,當(dāng)Mg2+濃度升高至2.0mmol L和2.4 mmol L-1時(shí),擴(kuò)增條帶數(shù)目增圖1大血 藤DNA凝膠電泳結(jié)果加,但仍缺少分子量較大的2條帶。當(dāng)dNTP大血藤DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳(含5g L-溴乙錠)鑒定,濃度升高至0.15 mmot L-'以上時(shí) ,具有清晰1xTAE緩沖液,6 V cm-'電壓強(qiáng)度Figure 1 The agarose gel analysis of Sargentodoxa cuneata DNA的擴(kuò)增結(jié)果,并且Mg2+濃度的改變對(duì)擴(kuò)增結(jié)Sargentodoxa cuneala DNA was determined on 0.8% agarose gel ( including果影響不大。由于較低的Mg2+濃度有利于增5g L ' EB), 1xTAE bufer , 6 v cm-1 volage intensity強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性,因此最適Mg2+濃度選擇1.50mmotL-1,dNTP濃度0.15mmolL-1為最適的組合濃度，此時(shí)RAPD條帶最清晰,條帶數(shù)最多,亮度最大。2.3 引物量對(duì)RAPD帶的影響在本研究中,引物量的變化對(duì)RAPD帶的數(shù)量和強(qiáng)弱影響較大(圖2)當(dāng)引物量為10 pmol時(shí),分子量較大的條帶亮度較低;當(dāng)引物量增高至15 pmol和20 pmol時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物條帶最清晰，亮度最大;當(dāng)引物量繼續(xù)增高至25pmol和30pmol時(shí),出現(xiàn)明顯的引物帶,并且某些條帶的亮度反而減弱。根據(jù)結(jié)果選擇最適的引物用量為15 p山RAPD反應(yīng)體積中添加15 pmol引物。M 1234567891011 121314 I5 1617 18 1920 21 22IIIILIIII中國(guó)煤化工圖2幾種因素對(duì)大血 藤RAPDHHCNMHGM: ADNA/Ec RI+ Hind II 標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物1-22:方法1.3表2中管號(hào)1-22的RAPD擴(kuò)增結(jié)果Figure2 The ffect of amplifcation conditions on Sargentodoxa cuneata RAPD amplifcation ( primer S21 )M: ADNA/Eco RI+ Hind II moleular weight standard. 1 ~ 22 : The RAPD aplifcation of1- 22 eppendorf lsed in the table 2 in method 1.3144浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)2003年6月2.4 模板DNA量對(duì)RAPD帶的影響如圖2所示,模板DNA的量對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果有明顯的影響。當(dāng)模板DNA量為25ng或50ng時(shí),擴(kuò)增的條帶量度太重大，導(dǎo)致電泳條帶的重疊;而當(dāng)DNA量增加至75ng時(shí)，擴(kuò)增的條帶清晰,但當(dāng)DNA量繼續(xù)增加至100 ng以上時(shí)，擴(kuò)增的條帶反而減少。由于本實(shí)驗(yàn)所用的模板DNA未經(jīng)純化，且大血藤葉中含大量的圖3模板DNA量對(duì)大血藤RAPD擴(kuò)增的影響(引物S21)M: ADNAVEco RI+ Hin d II 標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物次生代謝產(chǎn)物,因此分析原因可能是所提1~4:模板DNA量分別為1 ng,5ng, 10 ng和20 ngDNA中含有一定的次生代謝產(chǎn)物,抑制Figure 3 The effect of the content of the template DNA on Sargenodoxa auneata.了RAPD的擴(kuò)增。為了進(jìn)一步確定模板.RAPDamplification ( primer S21 )DNA的量,我們對(duì)1~20ng的模板DNAM: ADNA/Eco RI+ Hin d Il molecular weight standard. 1 ~4 : The content量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示模板DNA量為1of the template DNA was 1 ng, 5ng, 10 ng and 20 ngng時(shí),擴(kuò)增的條帶數(shù)較少;當(dāng)模板DNA量增加至5~20ng之間時(shí),模板DNA量對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果影響不大,均可獲得清晰的條帶(圖3)我們最終選擇最適的引物用量為15 pμL RAPD反應(yīng)體積中添加10 ng模板DNA。2.5 Taq酶單位對(duì)RAPD帶的影響Taq酶單位的變化對(duì)RAPD帶的數(shù)量和強(qiáng)弱影響較大(圖4)當(dāng)Taq酶為8.34x 10-9mot s-1時(shí)擴(kuò)增的條帶數(shù)較少;當(dāng)Taq酶用量增加至16.67x 10-*mot s-'時(shí),條帶數(shù)目有所增加,但有些條帶仍模糊不清;當(dāng)Taq酶用量增加至25.01x 10-9mol s-'時(shí) ,可獲得清晰的擴(kuò)增結(jié)果;當(dāng)Taq酶用量再增加至3..34x 10-9mol s-'以上時(shí),對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有所影響，分子量較大的條帶反而丟失。這與一些文獻(xiàn)8報(bào)道相符:酶量過(guò)高,反而引起RAPD擴(kuò)增效果的降低。我們最終選擇最適的Taq酶的用量為15μL RAPD反應(yīng)體積中添加25.01x 10-9mot s-1 Taq酶。2.6 BSA濃度對(duì)RAPD帶的M232425262728293031323334影響B(tài)SA濃度的變化對(duì)RAPD帶的數(shù)量和強(qiáng)弱有-定的影響(圖4)當(dāng)BSA質(zhì)量濃度為0.5g L一'和0.75g L-'時(shí),擴(kuò)tli II增的條帶較弱,有些條帶丟失;當(dāng)BSA質(zhì)量濃度增加至1.00~2.50g°L-1時(shí)，對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果影響不大,帶圖4Taq酶和BSA濃度對(duì)大血藤RAPD擴(kuò)增的影響(引物S21)型變化不明顯;當(dāng)BSA質(zhì)量M:λDNA/EcRI+HindII標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物23~34:方法1.3表2中管號(hào)23~ 34的RAPD擴(kuò)增結(jié)果濃度增加至3.00g L-1時(shí),有些條帶發(fā)生丟失。我們最終選Figure4 The effect of the unit of Taq polymerase and the concentration of BSA on Sargentodoxa cuneata擇最適的BSA濃度為2.00 gRAPD amplification ( prim中國(guó)煤化工M: λDNA/Eco RI+ Hind IThe PARD aplfcationof 23 ~ 34 eppendorf listed:TYHCNMHG3結(jié)語(yǔ)由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,擴(kuò)增條件的變化會(huì)對(duì)RAPD圖譜產(chǎn)生較大的影響,從而影響RAPD分析的準(zhǔn)確性,而RAPD帶譜的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性是利角據(jù)PD標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析的前提條件。從以上分析可看出大血藤的RAPD分析較第20卷第2期金則新等:大血藤RAPD條件的優(yōu)化145適宜的擴(kuò)增條件如下: 15 pμ PCR反應(yīng)體積，1x Taq酶配套緩沖液( 10 mmot L-'Tris HCI pH9.0, 50mmol L-1 KCl, 0.1%Trion X-100), 1.5 mmot L-1 MgCl2 , 25.01x 10-9 mot s-I酶(上海華美公司),10ng模板DNA，15 pmol 引物(上海Sangon公司), dATP , dCTP , dGTP和dTTP各0.15 mmot L-1 ,2.00g L-'牛血清白蛋白。以此條件對(duì)同-大血藤植株DNA進(jìn)行3次RAPD分析,結(jié)果可靠,帶型穩(wěn)定。參考文獻(xiàn):[1]應(yīng)俊生.張玉龍.中國(guó)種子植物特有屬[ M]. 北京:科學(xué)出版社, 1994. 536 - 539.[2]王景祥，浙江植物志:第2卷[M]. 杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社, 1992. 306.[3] Rmoker G, Mayer R , Shin-Kim J s. 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Faculy of Life Sciences ,Southwest Nornal University , Chongqing 400715 , China)Abstract: The optimized system used in RAPD reaction of Sargentodoxa cuneata must be established beforeanalyzing the genetic diversity of Sargentodoxa cuneata. It is necessary to explore the reaction conditions. Thegenomic DNA of Sargentodoxa cuneata is extracted with improved SDS method and RAPD amplification is carriedout. The effect of content of Mg , Dutp，DNA templates , primers and DNA polymerase on experimental results istested and the optimal reaction system of RAPD for Sargentodoxa cuneata is determined as follows : 1 x Taqpolymerase corresponding buffer( 10 mmol L- 'Tris HCl pH9.0 , 50 mmol L-IKCl, 0.1% Triton X-100, 1.5mmol L 'MgCl2), 25.01x 10- 9mol s- 'Taq DNA polymerase，10 ng template DNA , 15 pmol primer , 2.00 gL~ 'BSA.0.15 mmol L~ 'dATP , dCTP , dGTP , dTTP for each in total 15 puL reaction volume. [ Ch, 4 fig. 2tab.8 ref. ]Key words : Sargentodoxa cuneata ; RAPD ; chemical composition ; medicinal plant中國(guó)煤化工MHCNMHG