※營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生品科獸2014V.35,No.17197杜仲葉乙醇提取物的降糖作用機(jī)理張紅霞,楊丹丹,王鳳,李伊嬌,范俊峰(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100083)摘要:為了闡明杜仲葉的降血糖功效及其機(jī)制,采用酶抑制劑模型,篩選高抑制率的杜仲葉乙醇提取物并判斷其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型;借助caco-2人結(jié)腸腺癌細(xì)胞模型,研究杜仲葉20%乙醇解吸物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析杜仲葉20%乙醇解吸物主要成分。杜仲葉20%乙醇解吸物可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制a葡萄糖苷酶,其抑制常數(shù)K值為3290mg/mL。它對(duì)Caco-2細(xì)胞中的a-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)抑制作用,其ICs為0.57mg/mL,且對(duì)Cac-2細(xì)胞攝取葡萄糖也有一定抑制作用,1mg/m時(shí)抑制率可達(dá)2625%。氣相色譜質(zhì)譜分析表明杜仲葉20%乙醇解吸物主要有DL異檸檬酸內(nèi)酯、百里酚、兒茶素、2,6-二羥基苯甲酸和3,4-羥基苯丙烯酸等。這些結(jié)果表明,杜仲葉乙醇提取物可以通過抑制a-葡萄糖苷酶活性,降低葡萄糖吸收來實(shí)現(xiàn)降血糖的效果。關(guān)鍵詞:杜仲葉;Caco-2細(xì)胞;α-葡萄糖苷酶;降血糖;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn):兒茶素Ethanol Extract of Eucommia ulmoides Leaves Inhibits Alpha-Glucosidase in Caco-2 CellsZHANG Hong-xia, YANG Dan-dan, WANG Feng, LI Yi-jiao, FAN Jun-fengCollege of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)Abstract: The inhibitory effects of 40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves on alpha-glucosidase and glucosetransport were investigated in Caco-2 cells in vitro to elucidate the anti-hyperglycemic mechanism of Eucommia ulmoideleaves. The alpha-glucosidase inhibitors in the ethanol extract were also identified by GC-MS analysis. The kinetic studyshowed that the 20% ethanol elution fraction(EEB)from macroporous resin AB-8 of the ethanol extract of Eucommiaulmoides leaves could competitively inhibit alpha-glucosidase with a K, value of 32.90 mg/mL, indicating that alphaglucosidase has a strong affinity with the extract. Meanwhile, the inhibition was found to be reinforced as the concentrationof EEB increased. For investigation of the inhibitory effect of EEB in Caco-2 cells, cytotoxicity assays were firstly conductedby using different concentrations of EEB (0.05, 0.10, 0.20, 0.50 and 1.00 mg/mL)to determine the safety level at which cellgrowth and viability could not be affected. All tested concentrations of EEB had no effect on the growth or viability of Caco-2cells. Subsequently, EEB at various concentration exhibited effective suppression on alpha-glucosidase by using maltose(28 mmol/L) as the substrate in Caco-2 cells in a concentration-dependent manner with an ICs of 0.57 mg/mL. FurthermoreEEB could also attenuate glucose transport in Caco-2 cells, which could be decreased to 26. 25% by EEB(1 mg/mL).Theseresults indicate that EEB exerts strong anti-hyperglycemic effect by suppressing disaccharidase and glucose transportorsGC-MS analysis was conducted to elucidate the composition of the ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves. It wasfound that acids, monosaccharides, polyphenols, esters, amino acids were the main components of EEB. Further analysis byGC-MS revealed that the ethanol extract was rich in DL-isocitric acid lactone, thymol, catechin, 2, 6-dihydroxybenzoic acidand 3, 4-dihydroxy cinnamic acid. These compounds may play important roles in the hypoglycemic effect of the extract.Thepresent study suggests Eucommia ulmoides leaves are a medicinal food material for preventing and treating diabetes,andcould be further developed into healthful productsKey words: Eucommia ulmoides leaves; Caco-2 cells; a-glucosidase; hypoglycemic; glucose transport; catechin中圖分類號(hào):TS2521文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1002-6630(2014)17-019707doi:10.7506spkx1002-6630201417038收稿日期:2013-11-03基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(J103516)作者簡(jiǎn)介:張紅霞(1988-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail:Luludeert305@sina.cn*通信作者:范俊峰(1970—),男,副教授,博士,研究方向?yàn)橹苍葱远嚯暮忘S酮的抗血栓、抗糖尿病功能。1982014,.35,No.17自品科字※營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生糖尿病已被列為繼心腦血管疾病、胂瘤之后的第三細(xì)胞北京協(xié)和醫(yī)院;MEM培養(yǎng)基、胎牛血清美國(guó)大致死性疾病凹。碳水化合物在人體內(nèi)必須經(jīng)由α-葡萄 Gibco公司;96孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、糖苷酶水解其α-1,4糖苷鍵,生成葡萄糖、果糖、半乳糖磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered saline,PBS)、胰蛋后才能被小腸吸收。因此通過抑制a葡萄糖苷酶活性,白酶美國(guó) Hy Clone公司;阿卡波糖拜耳醫(yī)藥保健可延遲或阻礙多糖在消化道內(nèi)水解,以降低人體血糖濃有限公司;麥芽糖(分析純)北京化工廠:葡萄糖試度,可有效防治糖尿病。a-葡萄糖苷酶抑制劑,已第劑盒上海超研試劑有限公司:N,O-雙(三甲基硅烷3次被亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南推薦為降餐后血糖的基)三氟乙酰胺(MObs( (trimethylsi) trifluoroacetamide,線藥物。a-葡萄糖苷酶抑制劑越來越成為近年來藥物 BSTFA)、三甲基氯硅烷( trimethylchlorosilane,TMcs)化學(xué)的研究熱點(diǎn)。上海安普儀器試劑公司。杜仲( Eucommia uLmoides oliver)是藥理性質(zhì)很強(qiáng)的中藥材,杜仲有降血壓、提高免疫力、抗衰老、補(bǔ)12儀器與設(shè)備腎、強(qiáng)筋健骨等作用6。同時(shí),杜仲也是中國(guó)傳統(tǒng)的藥LL-1500真空冷凍干燥機(jī)賽默飛世爾科技有限公食同用的保健食品,以杜仲鮮葉為原料炮制而成的杜仲司; GC/MS-QP2010A氣質(zhì)聯(lián)用儀日本島津公司;CO2茶可減少體內(nèi)多余脂肪和膽固醇,在東亞非常流行。細(xì)胞培養(yǎng)箱日本 Yamato公司;超凈工作臺(tái)蘇州醫(yī)杜仲制成的杜仲晶、杜仲粉等都有一定的保健功效療器械儀器廠;ST-360酶標(biāo)儀上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限最近研究表明杜仲葉具有降血糖作用,杜仲分離得到公司;倒置顯微鏡日本 Olympus公司。的黃酮醇糖苷可抑制糖化作用,作用可以與氨基呱相13方法媲美1;杜仲葉水提物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠1.3.1杜仲葉乙醇提取物的提取及純化有一定的降血糖作用山;杜仲茶甲醇抽提物可有效抑制杜仲葉洗凈烘干粉碎,過20目篩,40%乙醇溶液為a-葡萄糖苷酶活性,維持體內(nèi)適當(dāng)?shù)难侵?。但?提取液,料液比1:60(m/V),浸泡25h后,每次超聲提目前對(duì)杜仲葉降血糖的研究大多停留在化學(xué)成分分析、取1h,重復(fù)提取2次,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后降糖效果上,針對(duì)其在人體內(nèi)降血糖機(jī)制尚不清楚。冷凍干燥,備用"本實(shí)驗(yàn)借助Caco-2人結(jié)腸腺癌細(xì)胞模擬人體小腸壁將所得樣品配制為質(zhì)量濃度5mg/mL,共100mL的環(huán)境,從腸道二糖酶系活性以及葡萄糖吸收的角度出EE溶液。使用AB8大孔樹脂裝入20cm×40cm玻璃色譜發(fā),研究了杜仲葉20%乙醇解吸物降血糖機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)柱,柱床體積60mL進(jìn)行分離純化。首先,吸附過程中調(diào)首先對(duì)杜仲葉乙醇提取物( ethanol extract of Eucommia節(jié)流速為10mL/min,直到提取液完全進(jìn)入樹脂層;充分uLmoides leaves,EE)進(jìn)行分離純化,并以酶-抑制劑吸附后依次使用200mL的0、20%、40%、60%、80%乙為模型通過酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究,判斷杜仲葉20%乙醇醇溶液以2.0ml/min流速進(jìn)行洗脫,收集解吸液,分別解吸物對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制類型及親和度;然后借助為EEA、EEB、EEC、EED、EEE,濃縮后冷凍干燥,備Caco-2細(xì)胞模型,研究了杜仲葉20%乙醇解吸物的降糖作用,并初步探討其作用機(jī)制;最后利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用。具體的提取分離流程如圖所示。用儀( gas chromatograph- mass spectrometer,GCMS)對(duì)杜仲葉烘千粉碎,過20目杜仲葉20%乙醇解吸物主要降糖成分進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)40%乙醇溶液,料液比1:60(m),浸泡2.5h可以從糖的消化轉(zhuǎn)運(yùn)途徑闡明杜仲葉降血糖保健功效[超聲波,1的原理,為進(jìn)一步生產(chǎn)杜仲葉降血糖保健品提供理論旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮依據(jù)。[空冷凍1材料與方法AB8大孔樹脂分離純化,得到杜仲葉乙醇提取物0%乙醇解吸□20%乙醇解吸40%乙醇解吸60%乙醇解吸乙醇解吸(EEA)(EEB)I(EEC)L(EED)L(EEE)11材料與試劑杜仲葉采集自陜西漢中略陽(yáng)縣。酶抑制劑模型篩選高抑制率的杜仲葉乙醇提取物EEB大孔樹脂(AB-8)天津市南開大學(xué)化工借助C2細(xì)胞,研究EB抑制葡萄糖苷酶活性廠;α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷EEB的GCMS成分分析(4 nitrophenyl-a-D- glucopyranoside,PNPG)、噻唑圖1杜仲葉活性成分提取分離流程R(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-Fig 1 Extraction and separation of bioactive components fromtetrazolium bromide,MTT)美國(guó) Sigma公司;Caco2Eucommia ulmoides leaves※營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生且品科獸2014,Wl.35,No.171991.32杜仲葉乙醇提取物對(duì)酶抑制劑模型的a葡萄糖苷200μLEEB,使EEB終質(zhì)量濃度為005、0.10、0.20酶的抑制作用0.50、1.00mg/mL;置37℃反應(yīng)40min后移入冰浴,迅速在9孔酶標(biāo)板上,每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),在每個(gè)吸出反應(yīng)液50,分別加入200L的葡萄糖試劑盒中孔中先后加入120μ05moM的磷酸緩沖液(pH67),37℃反應(yīng)30min,在490m波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A并記錄,20μL一定質(zhì)量濃度的杜仲葉乙醇提取物,50μa葡萄糖計(jì)算抑制率及IC苷酶溶液(25mgmL)和50μPNPG(3 mmolL),混勻酶活力單位定義:每分鐘分解10mo底物為一個(gè)后37℃反應(yīng)1h,然后加入50μ碳酸鈉溶液(067mo)酶活力單位。按公式(3)計(jì)算二糖酶活力。終止反應(yīng),最后在405nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度嗎。CN按公式(1)計(jì)算酶活性抑制率。二糖酶活力(μmo(L·min))=(3)酶活性抑制率%=4-42+4式中:c為反應(yīng)所釋放的葡萄糖濃度/(pmol):NA(1)為樣品稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時(shí)間/min;B為1個(gè)單位的二糖式中:A1為空白組吸光度,20的去離子水代替分解后葡萄糖釋放量(即麥芽糖B為2)提取液;A2為實(shí)驗(yàn)組吸光度;A3為背景組吸光度,只1.36EEB對(duì)Caco2細(xì)胞模型葡萄糖吸收的影響加入提取物,以100μL磷酸緩沖液代替a-葡萄糖苷酶實(shí)驗(yàn)在24孔板的單層細(xì)胞上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前棄去培養(yǎng)及PNPG。液,細(xì)胞用PBS洗3次,除去細(xì)胞表面附著物。加入含133EEB對(duì)a-葡萄糖苷酶抑制的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)EFB的PBS04mL,置37℃孵育10min后加入0.55 mmolL選定質(zhì)量濃度為10、20mg/mL的EEB,分別加入濃的葡萄糖溶液1.6mL,使EEB終質(zhì)量濃度分別為0.05度()為1、3、6、9、12 mmol/L的PNPG,按照1.320.10、0.20、0.50、100mgmL:空白組以04 mL PBS代節(jié)方法作出不同濃度的PNPG吸光度A隨時(shí)間變化圖,并替含EEB的溶液。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min,迅速吸出以直線部分求速率V,同時(shí)測(cè)定不加抑制劑時(shí)不同濃度溶液,用冰冷(4℃)PBS洗細(xì)胞3次,收集細(xì)胞,反復(fù)PNPG的反應(yīng)速率。按 Lineweaver-Burk作圖,以IS凍融破碎,分別測(cè)定細(xì)胞中葡萄糖及蛋白質(zhì)含量2。細(xì)為橫坐標(biāo),1為縱坐標(biāo),分別繪制不同濃度EEB的抑制胞葡萄糖含量測(cè)定采用氧化酶葡萄糖試劑盒法;細(xì)胞蛋作用動(dòng)力學(xué)曲線,求出米氏常數(shù)K并根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。力學(xué)方程(2),確定抑制常數(shù)K值13.7EEB成分分析1/Km=l/(Km(1+[K)(2)取干燥樣品EEB置于安培瓶中,無水分殘留,否式中:K為加入抑制劑后的米氏常數(shù);四為B濃度則會(huì)影響衍生化的效果。以1:1(VV)的比例加入衍134EEB的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)生化試劑,含0.1%TMCS的 BSTFA,將安培瓶口封采用MTT法,選擇EE對(duì)caco2細(xì)胞的安全質(zhì)量濃好,超聲波處理lh,放入100℃的烘箱中加熱,取出度。將細(xì)胞懸液稀釋為3×10個(gè)/mL,混勻后每孔100山后冷卻至室溫接種于96孔板上,37℃、5%CO2環(huán)境中孵育24h,棄氣相色譜檢測(cè)條件:進(jìn)樣量為1u,分流進(jìn)樣,分上清液,貼壁細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),每孔加入含EEB的完全培養(yǎng)基(對(duì)照孔只加完全培養(yǎng)基)100μL,培養(yǎng)48h后檢流比30:1;Rx5毛細(xì)管柱(30m×032mm,0.5μm);測(cè)細(xì)胞增殖情況。加MTT(5mg/mL)每孔20μ,胃程序升溫柱溫設(shè)置:柱初溫50℃,升溫速率6℃/min,升至250℃,繼續(xù)升溫,速率15℃/min,升至280℃,取( dimethyl sulfoxide,DMso)每孔200,避光振蕩保持時(shí)間不少于10mim,按口溫度250℃,進(jìn)樣口溫15min,于酶標(biāo)儀570m波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度度270℃。質(zhì)譜條件:EI離子源溫度220℃,電離電壓1.3.5EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型a-葡萄糖苷酶活性的70eV,倍增器電壓350V,掃描范圍33~500amu,掃描抑制速率05s/次。實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)14數(shù)據(jù)處理組,Caco-2細(xì)胞接種于24孔板上(4×104個(gè)/mL),培實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)3次取平均值,表示為士s,所有數(shù)養(yǎng)至12d。實(shí)驗(yàn)前棄去培養(yǎng)液,細(xì)胞用PBS洗3次,除去據(jù)用SPSS20.0軟件處理,用 Duncan's法進(jìn)行方差分析,細(xì)胞表面附著物?？瞻捉M每孔加入1 mL PBS;陰性對(duì)照組P<005為差異顯著。每孔加入800μ28mmo麥芽糖溶液和200μPBS;陽(yáng)性對(duì)照組每孔加入800山28mmo麥芽糖溶液和200μ2結(jié)果與分析阿卡波糖溶液,使阿卡波糖終質(zhì)量濃度為0.20mg/mL實(shí)驗(yàn)組每孔加入800μL28mmol/L麥芽糖溶液和21杜仲葉乙醇提取物對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制作用2002014,Vo.35,No.17品利字※營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生由圖4可知,在0、0.05、0.10、0.20、0.50、100mg/mL條件下吸光度A50m分別為0.818±0.046、0.849±0.015、0.849±0.033、0.783±0.0530.767±0.118、0.74±0.037。實(shí)驗(yàn)組與空白組無顯著差異(P>0.05)。這說明實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度下,EEB對(duì)Caco2細(xì)胞無明顯毒性。EEA EEB EEC EED EEE組別24Caco2細(xì)胞中EEB的降血糖機(jī)制小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)2.4.1EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型的a-葡萄糖苷酶抑制作用圖2大孔樹脂分離純化后各成分對(duì)a葡萄糖苷酶抑制率Fig2 Anti-a-glucosidase activity of the fractions separated from the40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves by macroporousresin adsorptionR16經(jīng)大孔樹脂動(dòng)態(tài)純化后的杜仲葉乙醇提取物對(duì)a-葡120萄糖苷酶有一定的抑制作用,由圖2可知,EEB對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制率最高,為(43.08±0.55)%;其次是0.60.81.0EEB質(zhì)量濃度/(mg/mLEEC,(26.74±0.32)%,比EEA高114%;而EED抑制圖5EFB對(duì)a葡萄糖苷酶酶活性的抑制作用率只有(13.87±0.20)%,是5個(gè)組分中最低的。ig.5 Anti-a-glucosidase activity of EEB in Caco-2 cells22EEB對(duì)a葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)如圖5所示,EEB在以麥芽糖為底物時(shí)對(duì)Caco-2細(xì)胞中a-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。當(dāng)EEB質(zhì)23409x+47513量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/mL時(shí),抑200R2=09814無抑制劑制率分別為(19.50±193)%、(32.07±1.08)%、m 10 mg/mL EEB(4421±334)%、(49.11±3.78)%、(51.75±215)%。▲20mg/ mL EEB04=02000204060.81012其ICs值為0.57mg/mL。隨著EE質(zhì)量濃度的升高,a葡I/[S/(L/mmol)萄糖苷酶活性逐漸降低,說明其抑制α-葡萄糖苷酶活性圖3EEB的 Lineweaver-Burk的雙倒數(shù)曲線具有質(zhì)量濃度依賴性。Fig-3 Lineweaver-Burk curve of EEB2.42EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型葡萄糖吸收的影響由圖3可知,最大反應(yīng)速率(Vmx)隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增大保持不變,米氏常數(shù)(Km)增大,說明了EEB對(duì)a-葡萄糖苷酶底物在該酶上的絡(luò)合位點(diǎn)相同,號(hào)20互相競(jìng)爭(zhēng),屬競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程1/K=/kn(1+[/K;)},從圖3中求得EEB質(zhì)量濃度為10、20mg/mL時(shí)Kn,再根據(jù)a-葡萄糖苷酶的K和Vmx,可求出EEB質(zhì)量濃度為10、20mg/mL時(shí)K的均值0.6EEB質(zhì)量濃度/(mgmL)為32.90mg/mL。圖6EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞的葡萄糖吸收抑制作用23EEB的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)g6 Anti-absorption of glucose of EEB in Caco-2 cells如圖6所示,空白組中葡萄糖吸收量為3018μ moVing;添加EEB的實(shí)驗(yàn)組中,Caco-2細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收量出現(xiàn)0.4定程度的降低。隨著EEB質(zhì)量濃度的上升,抑制率逐漸上升。這說明EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型葡萄糖吸收有一定的抑制作用,1mgm時(shí)抑制率為(26.25±0.86)%0.501.00EEB質(zhì)量濃度25EEB硅烷化衍生物GCMS分析不同質(zhì)量濃度EEB對(duì)Caco2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響EEB的GCMS總離子流圖如圖7所示。其中一部分化Effect of EEB on the合物由于含量少或者無法衍生化為揮發(fā)性物質(zhì),故無法※營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生品科獸2014,Vol.35,No.17201確定其化學(xué)結(jié)構(gòu),也有一部分為雜峰,予以扣除后通過機(jī)酸種類最多,包含飽和脂肪酸,不飽和脂肪酸以及芳標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索和人工解吸相結(jié)合,分析EEB中主要降香族脂肪酸。飽和脂肪酸中主要含有草酸(0.95%)血糖成分,結(jié)果見表1。乳酸(0.57%)等;不飽和脂肪酸主要含有2-酮-D-葡萄糖酸(2.63%)、10,12-二十二碳二炔二酸(142%)(表中未列出)等;芳香族脂肪酸中2,6-二羥基苯甲酸含量較高,為211%。酚類化合物總相對(duì)含量為4.36%分別為百里酚(0.67%),鄰羥基苯乙醇(0.46%),3,4-二羥基-苯丙烯酸(1.9%),兒茶素(0.88%)4-羥基-3-甲氧基苯乙二醇(0.45%)。EEB還檢測(cè)到左12515015210252302530253544254604595旋葡聚糖(0.62%)、阿拉伯呋喃糖(1.46%)、呋喃半時(shí)間/min乳糖(1.81%)、吡喃葡萄糖(3.09%)、吡喃甘露糖圖7EEB的總離子流圖Fig 7 TIC profileof EEB(2.37%)、D巖藻糖(0.65%)等單糖類化合物。就氨基酸而言,5氧代脯氨酸相對(duì)含量為054%;4羥基脯氨酸相對(duì)含量為1.25%。醇類物質(zhì)而言,3,4-雙脫氧己糖醇表1EEB中抑制a葡萄糖苷酶成分的相對(duì)含量able 1 Relative contents of aase inhibitors in EEB相對(duì)含量為054%;桃金娘烯醇為0.54%。此外,EEB中序號(hào)保留時(shí)間mnEEB成分相對(duì)含量%還含有07%甲酚甘油醚;0.7%苯胺羰酸;0.45%VB等草酸物質(zhì)。乳酸15219665氧代腩氨酸1623.628百里酚3討論1723.724鄰羥基苯乙醇1824271D甘露糖酸14內(nèi)酯小腸絨毛壁上皮的二糖酶系豐富,可引起餐后血糖192537826二羥基苯甲酸212627534雙脫氧己糖醇升高,其中最重要的是a-葡萄糖苷酶2。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2226529左旋葡聚糖杜仲葉20%乙醇解吸物(EEB)有很強(qiáng)的體外抗α-葡萄糖2326697苯基乙醇酸苷酶活性,并且EEB與a-葡萄糖苷酶有較高的親和性(K2427558桃金娘烯醇27697阿拉伯呋喇糖值為3290mg/mL)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EEB對(duì)于262777D葡萄糖酸-1,4內(nèi)酯Caco-2細(xì)胞中a-葡萄糖苷酶活性也具有較強(qiáng)抑制作用,并2827996甲酚甘油醛且可以抑制Caco-2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收。GCMS分析表30285512酮D葡萄糖酸2.63明,杜仲葉EEB含有重要的抗a-葡萄糖苷酶成分,包括百3228.791苯胺羰酸里酚、兒茶素、2,6-二羥基苯甲酸、3,4-二羥基-苯丙烯3329122呋喃半乳糖3629891吡喃葡萄糖309酸和DL-異檸檬酸內(nèi)酯等成分,含量最高可達(dá)1379%383135111甲氧基37,11三甲基24十二碳二烯酸甲酯正常人進(jìn)食后,食物中的碳水化合物如淀粉先在3931640吡喃甘露糖a淀粉酶作用下生成麥芽糖、麥芽三糖等,隨后經(jīng)a-葡42349704二羥基苯丙烯酸4337.0554羥基脯氨酸萄糖苷酶水解作用生成葡萄糖等,經(jīng)腸壁細(xì)胞吸收而被4648.147茶素機(jī)體利用。因此抑制α-葡萄糖苷酶活性,阻礙二糖進(jìn)4748.533D巖藻糖步分解對(duì)于延緩餐后血糖值升高有著重要作用。現(xiàn)在研48.72850492284羥基3甲氧基苯乙二醇究多采用PNPG為底物的酶-抑制劑模型,篩選強(qiáng)活性的5351.3084氨基5咪唑甲酰胺α-葡萄糖苷酶抑制劑。但是這種模型無法直接評(píng)價(jià)篩選51.552L異檸檬酸內(nèi)酯得到的降糖物質(zhì)在體內(nèi)的藥效作用,存在假陽(yáng)性率高、體內(nèi)外活性差異較大、臨床效果不理想等弊端。因此由表1可知,EEB主要以內(nèi)酯類、有機(jī)酸、酚類、本實(shí)驗(yàn)在采用PNPG為底物的酶-抑制劑模型基礎(chǔ)上,借單糖類、醇類、氨基酸為主。除此之外,還有核苷、醚助Caco-2細(xì)胞模擬人體小腸壁環(huán)境,克服了體內(nèi)外活性類、胺類、烯烴類化合物。差異大等缺點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上研究了EEB降血糖機(jī)制EEB成分中含有的內(nèi)酯類化合物相對(duì)含量最高,為Caco-2細(xì)胞來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞,體外培養(yǎng)達(dá)到融合16.75%。這其中DL-異檸檬酸內(nèi)酯的相對(duì)含量最高,達(dá)后,可自然分化為與成熟小腸細(xì)胞具備類似形態(tài)和生化到了1379%,其次為D甘露糖酸-1,4-內(nèi)酯(073%),特性的細(xì)胞。目前Caco2細(xì)胞主要用于藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)D葡萄糖酸-14-內(nèi)酯(2.23%)。EEB成分中含有的有制研究,可表現(xiàn)出與人小腸上皮細(xì)胞相似的與糖消化2022014,vo.35,No.17自品科字※營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生吸收有關(guān)的酶以及蛋白質(zhì)。故可借助Caco-2細(xì)胞所表山奈酚a-3OB-葡萄糖和杜仲醇。本實(shí)驗(yàn)分析得到了兒達(dá)的α-葡萄糖苷酶構(gòu)建模型來研究EEB對(duì)α-葡萄糖苷酶的荼素,含量為0.88%。由于提取分離杜仲葉方法不同,作用。并未檢測(cè)到槲皮素、山奈酚a-3-O-B-葡萄糖和杜仲醇。首先在酶-抑制劑模型中,EEB抑制率最高,為但是,EEB中的其他成分可能具備抑制a-葡萄糖苷酶的(43.08±0.55)%。其次酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)活性。桂花中的脂肪酸具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活EEB對(duì)a-葡萄糖苷酶抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制且K值僅為性國(guó)。EEB成分中含有有機(jī)酸的種類最多,包含10種飽32.90mg/mL,這說明EEB與α-葡萄糖苷酶有很高的親和和脂肪酸,6種不飽和脂肪酸以及3種芳香族脂肪酸。性。之后進(jìn)一步利用Caco-2細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn),EEB以麥芽其中不飽和脂肪酸含量最高,達(dá)6.86%。杜仲多糖對(duì)四糖為底物時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)a-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)抑制率。EEB氧嘧啶致糖尿病小鼠有一定的降血糖作用。苦瓜多糖抑制a-葡萄糖苷酶活性隨著EEB質(zhì)量濃度升高而升高,和蘆薈多糖都有降血糖的作用,而苦瓜多糖主要由阿拉ICs值為0.57mg/mL。對(duì)比常用降血糖藥物-阿卡波糖在伯糖、半乳糖和鼠李糖等構(gòu)成;蘆薈多糖以甘露糖、阿020mg/mL時(shí)對(duì)a-葡萄糖苷酶活性抑制率為6792%,同拉伯糖等構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EEB含有的單糖類化合物等質(zhì)量濃度的杜仲葉乙醇提取物抑制率達(dá)到了5757%。相對(duì)含量為13.25%,其中吡喃甘露糖含量相對(duì)較高葡萄糖吸收過程中主要涉及鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1為2.37%;阿拉伯呋喃糖含量為1.46%;呋喃半乳糖為( sodium/ glucose cotransporter-1,SGLT-1)、葡萄1.81%。茶多酚對(duì)a-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制活性且延緩糖協(xié)助擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)載體2( glucose transporter2,GLUT-2)小腸對(duì)糖的消化吸收起到降糖作用。EEB中兒茶素含兩種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白(28。其中位于小腸細(xì)胞黏量為088%。除此,EEB中還檢測(cè)到百里酚、3,4二羥基膜表面上的SGLT-1起主導(dǎo)作用,其在細(xì)胞基底膜苯丙烯酸、4-羥基-3-甲氧基苯乙二醇等酚類物質(zhì)。海帶NaK-ATP酶作用下逆№濃度差,消耗能量,主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄中提取得到的D甘露醇與丙酮合成的二異亞丙基甘露醇糖。因此,腸道葡萄糖的跨膜吸收主要涉及SGLT1、可抑制a-葡萄糖苷酶活性。EEB中可分離得到5種醇類GLUT2和Na-KATP酶共3種蛋白。Caco-2細(xì)胞模型成分(327%)。EEB中內(nèi)酯類化合物的相對(duì)含量最高,中,EEB除可抑制α-葡萄糖苷酶活性外還可抑制葡萄糖為1675%,其中DL-異檸檬酸內(nèi)酯的相對(duì)含量最高,達(dá)到攝取吸收,1.00mg/mL時(shí)抑制率26.25%。針對(duì)EEB抑1379%。此外,EEB中還檢測(cè)出2種氨基酸(17%)制℃aco-2細(xì)胞中葡萄糖吸收的具體機(jī)制尚不清楚。但研分別為5-氧代脯氨酸和4羥基脯氨酸。L-羥基脯氨酸能使究表明,茶葉提取物可通過竟?fàn)幮砸种艭aco-2細(xì)胞膜上正常小鼠進(jìn)食量明顯增加時(shí)而不增加體質(zhì)量增長(zhǎng)速率,減SGLT-I、GLUT-2、GLUT-5等葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性來少營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型大鼠的體質(zhì)量馴。根據(jù)以上成分結(jié)構(gòu)鑒抑制細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的吸收。夏枯草提取物可能通過定,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EEB含有兒茶素、百里酚、吡喃甘露糖、抑制SCLT-1、GLUT-2及Na'-K‘-ATP酶在mRNA水平上的2,6二羥基-苯甲酸,3,4二羥基-苯丙烯酸和DL-異檸檬酸表達(dá),抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生成量,從而降低葡萄糖吸收量。內(nèi)酯等成分,含量最高可達(dá)13.79%。推測(cè)這些成分可以抑因此,EEB可能通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或者抑制a-葡萄糖苷酶活性,為測(cè)定其在杜仲葉中的含量以及進(jìn)制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在mRNA水平上的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)步研究它們對(duì)a葡萄糖苷酶的抑制作用奠定了基礎(chǔ)。葡萄糖吸收的抑制。在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,可通過繼續(xù)實(shí)驗(yàn)研究在Caco-24結(jié)論細(xì)胞模型上EEB對(duì)于蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖等其他二糖酶的抑制效果,研究其對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),杜仲葉乙醇提取物降血糖效果主要是響,以便于進(jìn)一步研究EEB的降血糖機(jī)制。綜上可通過抑制α-葡萄糖苷酶活力,減少葡萄糖吸收,降低餐得,EEB可通過抑制a-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖吸收后高血糖實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)從糖的消化轉(zhuǎn)運(yùn)途徑闡明了杜起到降血糖的效果。仲葉降血糖保健功效的原理,為杜仲葉治療糖尿病的開藥用植物中,具備抗a-葡萄糖苷酶活性的有效成分發(fā)利用打下了理論基礎(chǔ)。主要由多酚、黃酮及黃酮苷、生物堿、三萜及其苷類、肽類、酯類、酸類等組成。GCMS分析EEB主要成參考文獻(xiàn)分含有酸類、單糖類、多酚、酯類、氨基酸等物質(zhì)。有]王華.糖尿病藥物治療的研究進(jìn)展U]臨床合理用藥雜志,2010研究發(fā)現(xiàn),利用高效液相色譜法分離杜仲茶甲醇提取物3(3):123-124.可得到5種α-葡萄糖苷酶抑制劑分別為:槲皮素、兒茶[2]季芳,肖國(guó)春,董莉,等.藥用植物來源的a葡萄糖苷酶抑制劑研究進(jìn)展U中國(guó)中藥雜志,2010,35(12):16331640素a(78-bc)-44(34二羥基)a(3HD吡喃糖、兒B李玉萍,白冰,葉軍,等,a葡萄糖苷酶抑制劑的制備和活性研究進(jìn)茶素-a(7,8-b.c)4B-(3,4二羥基)-a(3H)葡萄糖展門食品科學(xué),2008,299):617-62※營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生良品利享2014,W.35,No.172034】] 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