※營養(yǎng)衛(wèi)生品科獸2014V.35,No.17197杜仲葉乙醇提取物的降糖作用機理張紅霞,楊丹丹,王鳳,李伊嬌,范俊峰(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100083)摘要:為了闡明杜仲葉的降血糖功效及其機制,采用酶抑制劑模型,篩選高抑制率的杜仲葉乙醇提取物并判斷其對α-葡萄糖苷酶的抑制類型;借助caco-2人結(jié)腸腺癌細胞模型,研究杜仲葉20%乙醇解吸物對α-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的影響;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析杜仲葉20%乙醇解吸物主要成分。杜仲葉20%乙醇解吸物可競爭性地抑制a葡萄糖苷酶,其抑制常數(shù)K值為3290mg/mL。它對Caco-2細胞中的a-葡萄糖苷酶有較強抑制作用,其ICs為0.57mg/mL,且對Cac-2細胞攝取葡萄糖也有一定抑制作用,1mg/m時抑制率可達2625%。氣相色譜質(zhì)譜分析表明杜仲葉20%乙醇解吸物主要有DL異檸檬酸內(nèi)酯、百里酚、兒茶素、2,6-二羥基苯甲酸和3,4-羥基苯丙烯酸等。這些結(jié)果表明,杜仲葉乙醇提取物可以通過抑制a-葡萄糖苷酶活性,降低葡萄糖吸收來實現(xiàn)降血糖的效果。關(guān)鍵詞:杜仲葉;Caco-2細胞;α-葡萄糖苷酶;降血糖;葡萄糖轉(zhuǎn)運:兒茶素Ethanol Extract of Eucommia ulmoides Leaves Inhibits Alpha-Glucosidase in Caco-2 CellsZHANG Hong-xia, YANG Dan-dan, WANG Feng, LI Yi-jiao, FAN Jun-fengCollege of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)Abstract: The inhibitory effects of 40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves on alpha-glucosidase and glucosetransport were investigated in Caco-2 cells in vitro to elucidate the anti-hyperglycemic mechanism of Eucommia ulmoideleaves. The alpha-glucosidase inhibitors in the ethanol extract were also identified by GC-MS analysis. The kinetic studyshowed that the 20% ethanol elution fraction(EEB)from macroporous resin AB-8 of the ethanol extract of Eucommiaulmoides leaves could competitively inhibit alpha-glucosidase with a K, value of 32.90 mg/mL, indicating that alphaglucosidase has a strong affinity with the extract. Meanwhile, the inhibition was found to be reinforced as the concentrationof EEB increased. For investigation of the inhibitory effect of EEB in Caco-2 cells, cytotoxicity assays were firstly conductedby using different concentrations of EEB (0.05, 0.10, 0.20, 0.50 and 1.00 mg/mL)to determine the safety level at which cellgrowth and viability could not be affected. All tested concentrations of EEB had no effect on the growth or viability of Caco-2cells. Subsequently, EEB at various concentration exhibited effective suppression on alpha-glucosidase by using maltose(28 mmol/L) as the substrate in Caco-2 cells in a concentration-dependent manner with an ICs of 0.57 mg/mL. FurthermoreEEB could also attenuate glucose transport in Caco-2 cells, which could be decreased to 26. 25% by EEB(1 mg/mL).Theseresults indicate that EEB exerts strong anti-hyperglycemic effect by suppressing disaccharidase and glucose transportorsGC-MS analysis was conducted to elucidate the composition of the ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves. It wasfound that acids, monosaccharides, polyphenols, esters, amino acids were the main components of EEB. Further analysis byGC-MS revealed that the ethanol extract was rich in DL-isocitric acid lactone, thymol, catechin, 2, 6-dihydroxybenzoic acidand 3, 4-dihydroxy cinnamic acid. These compounds may play important roles in the hypoglycemic effect of the extract.Thepresent study suggests Eucommia ulmoides leaves are a medicinal food material for preventing and treating diabetes,andcould be further developed into healthful productsKey words: Eucommia ulmoides leaves; Caco-2 cells; a-glucosidase; hypoglycemic; glucose transport; catechin中圖分類號:TS2521文獻標(biāo)志碼:A文章編號:1002-6630(2014)17-019707doi:10.7506spkx1002-6630201417038收稿日期:2013-11-03基金項目:國家自然科學(xué)基金面上項目(J103516)作者簡介:張紅霞(1988-),女,碩士研究生,研究方向為功能性食品。E-mail:Luludeert305@sina.cn*通信作者:范俊峰(1970—),男,副教授,博士,研究方向為植源性多肽和黃酮的抗血栓、抗糖尿病功能。1982014,.35,No.17自品科字※營養(yǎng)衛(wèi)生糖尿病已被列為繼心腦血管疾病、胂瘤之后的第三細胞北京協(xié)和醫(yī)院;MEM培養(yǎng)基、胎牛血清美國大致死性疾病凹。碳水化合物在人體內(nèi)必須經(jīng)由α-葡萄 Gibco公司;96孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶、糖苷酶水解其α-1,4糖苷鍵,生成葡萄糖、果糖、半乳糖磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered saline,PBS)、胰蛋后才能被小腸吸收。因此通過抑制a葡萄糖苷酶活性,白酶美國 Hy Clone公司;阿卡波糖拜耳醫(yī)藥保健可延遲或阻礙多糖在消化道內(nèi)水解,以降低人體血糖濃有限公司;麥芽糖(分析純)北京化工廠:葡萄糖試度,可有效防治糖尿病。a-葡萄糖苷酶抑制劑,已第劑盒上海超研試劑有限公司:N,O-雙(三甲基硅烷3次被亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南推薦為降餐后血糖的基)三氟乙酰胺(MObs( (trimethylsi) trifluoroacetamide,線藥物。a-葡萄糖苷酶抑制劑越來越成為近年來藥物 BSTFA)、三甲基氯硅烷( trimethylchlorosilane,TMcs)化學(xué)的研究熱點。上海安普儀器試劑公司。杜仲( Eucommia uLmoides oliver)是藥理性質(zhì)很強的中藥材,杜仲有降血壓、提高免疫力、抗衰老、補12儀器與設(shè)備腎、強筋健骨等作用6。同時,杜仲也是中國傳統(tǒng)的藥LL-1500真空冷凍干燥機賽默飛世爾科技有限公食同用的保健食品,以杜仲鮮葉為原料炮制而成的杜仲司; GC/MS-QP2010A氣質(zhì)聯(lián)用儀日本島津公司;CO2茶可減少體內(nèi)多余脂肪和膽固醇,在東亞非常流行。細胞培養(yǎng)箱日本 Yamato公司;超凈工作臺蘇州醫(yī)杜仲制成的杜仲晶、杜仲粉等都有一定的保健功效療器械儀器廠;ST-360酶標(biāo)儀上?？迫A實驗系統(tǒng)有限最近研究表明杜仲葉具有降血糖作用,杜仲分離得到公司;倒置顯微鏡日本 Olympus公司。的黃酮醇糖苷可抑制糖化作用,作用可以與氨基呱相13方法媲美1;杜仲葉水提物對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠1.3.1杜仲葉乙醇提取物的提取及純化有一定的降血糖作用山;杜仲茶甲醇抽提物可有效抑制杜仲葉洗凈烘干粉碎,過20目篩,40%乙醇溶液為a-葡萄糖苷酶活性,維持體內(nèi)適當(dāng)?shù)难侵?。但?提取液,料液比1:60(m/V),浸泡25h后,每次超聲提目前對杜仲葉降血糖的研究大多停留在化學(xué)成分分析、取1h,重復(fù)提取2次,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后降糖效果上,針對其在人體內(nèi)降血糖機制尚不清楚。冷凍干燥,備用"本實驗借助Caco-2人結(jié)腸腺癌細胞模擬人體小腸壁將所得樣品配制為質(zhì)量濃度5mg/mL,共100mL的環(huán)境,從腸道二糖酶系活性以及葡萄糖吸收的角度出EE溶液。使用AB8大孔樹脂裝入20cm×40cm玻璃色譜發(fā),研究了杜仲葉20%乙醇解吸物降血糖機制。本實驗柱,柱床體積60mL進行分離純化。首先,吸附過程中調(diào)首先對杜仲葉乙醇提取物( ethanol extract of Eucommia節(jié)流速為10mL/min,直到提取液完全進入樹脂層;充分uLmoides leaves,EE)進行分離純化,并以酶-抑制劑吸附后依次使用200mL的0、20%、40%、60%、80%乙為模型通過酶促反應(yīng)動力學(xué)研究,判斷杜仲葉20%乙醇醇溶液以2.0ml/min流速進行洗脫,收集解吸液,分別解吸物對a-葡萄糖苷酶的抑制類型及親和度;然后借助為EEA、EEB、EEC、EED、EEE,濃縮后冷凍干燥,備Caco-2細胞模型,研究了杜仲葉20%乙醇解吸物的降糖作用,并初步探討其作用機制;最后利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用。具體的提取分離流程如圖所示。用儀( gas chromatograph- mass spectrometer,GCMS)對杜仲葉烘千粉碎,過20目杜仲葉20%乙醇解吸物主要降糖成分進行分析。本實驗40%乙醇溶液,料液比1:60(m),浸泡2.5h可以從糖的消化轉(zhuǎn)運途徑闡明杜仲葉降血糖保健功效[超聲波,1的原理,為進一步生產(chǎn)杜仲葉降血糖保健品提供理論旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮依據(jù)。[空冷凍1材料與方法AB8大孔樹脂分離純化,得到杜仲葉乙醇提取物0%乙醇解吸□20%乙醇解吸40%乙醇解吸60%乙醇解吸乙醇解吸(EEA)(EEB)I(EEC)L(EED)L(EEE)11材料與試劑杜仲葉采集自陜西漢中略陽縣。酶抑制劑模型篩選高抑制率的杜仲葉乙醇提取物EEB大孔樹脂(AB-8)天津市南開大學(xué)化工借助C2細胞,研究EB抑制葡萄糖苷酶活性廠;α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷EEB的GCMS成分分析(4 nitrophenyl-a-D- glucopyranoside,PNPG)、噻唑圖1杜仲葉活性成分提取分離流程R(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-Fig 1 Extraction and separation of bioactive components fromtetrazolium bromide,MTT)美國 Sigma公司;Caco2Eucommia ulmoides leaves※營養(yǎng)衛(wèi)生且品科獸2014,Wl.35,No.171991.32杜仲葉乙醇提取物對酶抑制劑模型的a葡萄糖苷200μLEEB,使EEB終質(zhì)量濃度為005、0.10、0.20酶的抑制作用0.50、1.00mg/mL;置37℃反應(yīng)40min后移入冰浴,迅速在9孔酶標(biāo)板上,每個樣品做3個平行實驗,在每個吸出反應(yīng)液50,分別加入200L的葡萄糖試劑盒中孔中先后加入120μ05moM的磷酸緩沖液(pH67),37℃反應(yīng)30min,在490m波長處測定吸光度A并記錄,20μL一定質(zhì)量濃度的杜仲葉乙醇提取物,50μa葡萄糖計算抑制率及IC苷酶溶液(25mgmL)和50μPNPG(3 mmolL),混勻酶活力單位定義:每分鐘分解10mo底物為一個后37℃反應(yīng)1h,然后加入50μ碳酸鈉溶液(067mo)酶活力單位。按公式(3)計算二糖酶活力。終止反應(yīng),最后在405nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度嗎。CN按公式(1)計算酶活性抑制率。二糖酶活力(μmo(L·min))=(3)酶活性抑制率%=4-42+4式中:c為反應(yīng)所釋放的葡萄糖濃度/(pmol):NA(1)為樣品稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時間/min;B為1個單位的二糖式中:A1為空白組吸光度,20的去離子水代替分解后葡萄糖釋放量(即麥芽糖B為2)提取液;A2為實驗組吸光度;A3為背景組吸光度,只1.36EEB對Caco2細胞模型葡萄糖吸收的影響加入提取物,以100μL磷酸緩沖液代替a-葡萄糖苷酶實驗在24孔板的單層細胞上進行。實驗前棄去培養(yǎng)及PNPG。液,細胞用PBS洗3次,除去細胞表面附著物。加入含133EEB對a-葡萄糖苷酶抑制的動力學(xué)實驗EFB的PBS04mL,置37℃孵育10min后加入0.55 mmolL選定質(zhì)量濃度為10、20mg/mL的EEB,分別加入濃的葡萄糖溶液1.6mL,使EEB終質(zhì)量濃度分別為0.05度()為1、3、6、9、12 mmol/L的PNPG,按照1.320.10、0.20、0.50、100mgmL:空白組以04 mL PBS代節(jié)方法作出不同濃度的PNPG吸光度A隨時間變化圖,并替含EEB的溶液。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min,迅速吸出以直線部分求速率V,同時測定不加抑制劑時不同濃度溶液,用冰冷(4℃)PBS洗細胞3次,收集細胞,反復(fù)PNPG的反應(yīng)速率。按 Lineweaver-Burk作圖,以IS凍融破碎,分別測定細胞中葡萄糖及蛋白質(zhì)含量2。細為橫坐標(biāo),1為縱坐標(biāo),分別繪制不同濃度EEB的抑制胞葡萄糖含量測定采用氧化酶葡萄糖試劑盒法;細胞蛋作用動力學(xué)曲線,求出米氏常數(shù)K并根據(jù)競爭性抑制動白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法。力學(xué)方程(2),確定抑制常數(shù)K值13.7EEB成分分析1/Km=l/(Km(1+[K)(2)取干燥樣品EEB置于安培瓶中,無水分殘留,否式中:K為加入抑制劑后的米氏常數(shù);四為B濃度則會影響衍生化的效果。以1:1(VV)的比例加入衍134EEB的細胞毒性實驗生化試劑,含0.1%TMCS的 BSTFA,將安培瓶口封采用MTT法,選擇EE對caco2細胞的安全質(zhì)量濃好,超聲波處理lh,放入100℃的烘箱中加熱,取出度。將細胞懸液稀釋為3×10個/mL,混勻后每孔100山后冷卻至室溫接種于96孔板上,37℃、5%CO2環(huán)境中孵育24h,棄氣相色譜檢測條件:進樣量為1u,分流進樣,分上清液,貼壁細胞用于實驗,每孔加入含EEB的完全培養(yǎng)基(對照孔只加完全培養(yǎng)基)100μL,培養(yǎng)48h后檢流比30:1;Rx5毛細管柱(30m×032mm,0.5μm);測細胞增殖情況。加MTT(5mg/mL)每孔20μ,胃程序升溫柱溫設(shè)置:柱初溫50℃,升溫速率6℃/min,升至250℃,繼續(xù)升溫,速率15℃/min,升至280℃,取( dimethyl sulfoxide,DMso)每孔200,避光振蕩保持時間不少于10mim,按口溫度250℃,進樣口溫15min,于酶標(biāo)儀570m波長處測定吸光度度270℃。質(zhì)譜條件:EI離子源溫度220℃,電離電壓1.3.5EEB對Caco-2細胞模型a-葡萄糖苷酶活性的70eV,倍增器電壓350V,掃描范圍33~500amu,掃描抑制速率05s/次。實驗分為空白組、陰性對照組、陽性對照組、實驗14數(shù)據(jù)處理組,Caco-2細胞接種于24孔板上(4×104個/mL),培實驗最少重復(fù)3次取平均值,表示為士s,所有數(shù)養(yǎng)至12d。實驗前棄去培養(yǎng)液,細胞用PBS洗3次,除去據(jù)用SPSS20.0軟件處理,用 Duncan's法進行方差分析,細胞表面附著物?？瞻捉M每孔加入1 mL PBS;陰性對照組P<005為差異顯著。每孔加入800μ28mmo麥芽糖溶液和200μPBS;陽性對照組每孔加入800山28mmo麥芽糖溶液和200μ2結(jié)果與分析阿卡波糖溶液,使阿卡波糖終質(zhì)量濃度為0.20mg/mL實驗組每孔加入800μL28mmol/L麥芽糖溶液和21杜仲葉乙醇提取物對a-葡萄糖苷酶的抑制作用2002014,Vo.35,No.17品利字※營養(yǎng)衛(wèi)生由圖4可知,在0、0.05、0.10、0.20、0.50、100mg/mL條件下吸光度A50m分別為0.818±0.046、0.849±0.015、0.849±0.033、0.783±0.0530.767±0.118、0.74±0.037。實驗組與空白組無顯著差異(P>0.05)。這說明實驗質(zhì)量濃度下,EEB對Caco2細胞無明顯毒性。EEA EEB EEC EED EEE組別24Caco2細胞中EEB的降血糖機制小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)2.4.1EEB對Caco-2細胞模型的a-葡萄糖苷酶抑制作用圖2大孔樹脂分離純化后各成分對a葡萄糖苷酶抑制率Fig2 Anti-a-glucosidase activity of the fractions separated from the40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves by macroporousresin adsorptionR16經(jīng)大孔樹脂動態(tài)純化后的杜仲葉乙醇提取物對a-葡120萄糖苷酶有一定的抑制作用,由圖2可知,EEB對a-葡萄糖苷酶的抑制率最高,為(43.08±0.55)%;其次是0.60.81.0EEB質(zhì)量濃度/(mg/mLEEC,(26.74±0.32)%,比EEA高114%;而EED抑制圖5EFB對a葡萄糖苷酶酶活性的抑制作用率只有(13.87±0.20)%,是5個組分中最低的。ig.5 Anti-a-glucosidase activity of EEB in Caco-2 cells22EEB對a葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)如圖5所示,EEB在以麥芽糖為底物時對Caco-2細胞中a-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。當(dāng)EEB質(zhì)23409x+47513量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/mL時,抑200R2=09814無抑制劑制率分別為(19.50±193)%、(32.07±1.08)%、m 10 mg/mL EEB(4421±334)%、(49.11±3.78)%、(51.75±215)%?！?0mg/ mL EEB04=02000204060.81012其ICs值為0.57mg/mL。隨著EE質(zhì)量濃度的升高,a葡I/[S/(L/mmol)萄糖苷酶活性逐漸降低,說明其抑制α-葡萄糖苷酶活性圖3EEB的 Lineweaver-Burk的雙倒數(shù)曲線具有質(zhì)量濃度依賴性。Fig-3 Lineweaver-Burk curve of EEB2.42EEB對Caco-2細胞模型葡萄糖吸收的影響由圖3可知,最大反應(yīng)速率(Vmx)隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增大保持不變,米氏常數(shù)(Km)增大,說明了EEB對a-葡萄糖苷酶底物在該酶上的絡(luò)合位點相同,號20互相競爭,屬競爭性抑制劑。根據(jù)競爭性抑制動力學(xué)方程1/K=/kn(1+[/K;)},從圖3中求得EEB質(zhì)量濃度為10、20mg/mL時Kn,再根據(jù)a-葡萄糖苷酶的K和Vmx,可求出EEB質(zhì)量濃度為10、20mg/mL時K的均值0.6EEB質(zhì)量濃度/(mgmL)為32.90mg/mL。圖6EEB對Caco-2細胞的葡萄糖吸收抑制作用23EEB的細胞毒性實驗g6 Anti-absorption of glucose of EEB in Caco-2 cells如圖6所示,空白組中葡萄糖吸收量為3018μ moVing;添加EEB的實驗組中,Caco-2細胞對葡萄糖吸收量出現(xiàn)0.4定程度的降低。隨著EEB質(zhì)量濃度的上升,抑制率逐漸上升。這說明EEB對Caco-2細胞模型葡萄糖吸收有一定的抑制作用,1mgm時抑制率為(26.25±0.86)%0.501.00EEB質(zhì)量濃度25EEB硅烷化衍生物GCMS分析不同質(zhì)量濃度EEB對Caco2細胞生長的影響EEB的GCMS總離子流圖如圖7所示。其中一部分化Effect of EEB on the合物由于含量少或者無法衍生化為揮發(fā)性物質(zhì),故無法※營養(yǎng)衛(wèi)生品科獸2014,Vol.35,No.17201確定其化學(xué)結(jié)構(gòu),也有一部分為雜峰,予以扣除后通過機酸種類最多,包含飽和脂肪酸,不飽和脂肪酸以及芳標(biāo)準質(zhì)譜庫檢索和人工解吸相結(jié)合,分析EEB中主要降香族脂肪酸。飽和脂肪酸中主要含有草酸(0.95%)血糖成分,結(jié)果見表1。乳酸(0.57%)等;不飽和脂肪酸主要含有2-酮-D-葡萄糖酸(2.63%)、10,12-二十二碳二炔二酸(142%)(表中未列出)等;芳香族脂肪酸中2,6-二羥基苯甲酸含量較高,為211%。酚類化合物總相對含量為4.36%分別為百里酚(0.67%),鄰羥基苯乙醇(0.46%),3,4-二羥基-苯丙烯酸(1.9%),兒茶素(0.88%)4-羥基-3-甲氧基苯乙二醇(0.45%)。EEB還檢測到左12515015210252302530253544254604595旋葡聚糖(0.62%)、阿拉伯呋喃糖(1.46%)、呋喃半時間/min乳糖(1.81%)、吡喃葡萄糖(3.09%)、吡喃甘露糖圖7EEB的總離子流圖Fig 7 TIC profileof EEB(2.37%)、D巖藻糖(0.65%)等單糖類化合物。就氨基酸而言,5氧代脯氨酸相對含量為054%;4羥基脯氨酸相對含量為1.25%。醇類物質(zhì)而言,3,4-雙脫氧己糖醇表1EEB中抑制a葡萄糖苷酶成分的相對含量able 1 Relative contents of aase inhibitors in EEB相對含量為054%;桃金娘烯醇為0.54%。此外,EEB中序號保留時間mnEEB成分相對含量%還含有07%甲酚甘油醚;0.7%苯胺羰酸;0.45%VB等草酸物質(zhì)。乳酸15219665氧代腩氨酸1623.628百里酚3討論1723.724鄰羥基苯乙醇1824271D甘露糖酸14內(nèi)酯小腸絨毛壁上皮的二糖酶系豐富,可引起餐后血糖192537826二羥基苯甲酸212627534雙脫氧己糖醇升高,其中最重要的是a-葡萄糖苷酶2。本實驗發(fā)現(xiàn)2226529左旋葡聚糖杜仲葉20%乙醇解吸物(EEB)有很強的體外抗α-葡萄糖2326697苯基乙醇酸苷酶活性,并且EEB與a-葡萄糖苷酶有較高的親和性(K2427558桃金娘烯醇27697阿拉伯呋喇糖值為3290mg/mL)。進一步的實驗結(jié)果表明,EEB對于262777D葡萄糖酸-1,4內(nèi)酯Caco-2細胞中a-葡萄糖苷酶活性也具有較強抑制作用,并2827996甲酚甘油醛且可以抑制Caco-2細胞對葡萄糖的吸收。GCMS分析表30285512酮D葡萄糖酸2.63明,杜仲葉EEB含有重要的抗a-葡萄糖苷酶成分,包括百3228.791苯胺羰酸里酚、兒茶素、2,6-二羥基苯甲酸、3,4-二羥基-苯丙烯3329122呋喃半乳糖3629891吡喃葡萄糖309酸和DL-異檸檬酸內(nèi)酯等成分,含量最高可達1379%383135111甲氧基37,11三甲基24十二碳二烯酸甲酯正常人進食后,食物中的碳水化合物如淀粉先在3931640吡喃甘露糖a淀粉酶作用下生成麥芽糖、麥芽三糖等,隨后經(jīng)a-葡42349704二羥基苯丙烯酸4337.0554羥基脯氨酸萄糖苷酶水解作用生成葡萄糖等,經(jīng)腸壁細胞吸收而被4648.147茶素機體利用。因此抑制α-葡萄糖苷酶活性,阻礙二糖進4748.533D巖藻糖步分解對于延緩餐后血糖值升高有著重要作用?，F(xiàn)在研48.72850492284羥基3甲氧基苯乙二醇究多采用PNPG為底物的酶-抑制劑模型,篩選強活性的5351.3084氨基5咪唑甲酰胺α-葡萄糖苷酶抑制劑。但是這種模型無法直接評價篩選51.552L異檸檬酸內(nèi)酯得到的降糖物質(zhì)在體內(nèi)的藥效作用,存在假陽性率高、體內(nèi)外活性差異較大、臨床效果不理想等弊端。因此由表1可知,EEB主要以內(nèi)酯類、有機酸、酚類、本實驗在采用PNPG為底物的酶-抑制劑模型基礎(chǔ)上,借單糖類、醇類、氨基酸為主。除此之外,還有核苷、醚助Caco-2細胞模擬人體小腸壁環(huán)境,克服了體內(nèi)外活性類、胺類、烯烴類化合物。差異大等缺點,并在此基礎(chǔ)上研究了EEB降血糖機制EEB成分中含有的內(nèi)酯類化合物相對含量最高,為Caco-2細胞來源于人結(jié)腸腺癌細胞,體外培養(yǎng)達到融合16.75%。這其中DL-異檸檬酸內(nèi)酯的相對含量最高,達后,可自然分化為與成熟小腸細胞具備類似形態(tài)和生化到了1379%,其次為D甘露糖酸-1,4-內(nèi)酯(073%),特性的細胞。目前Caco2細胞主要用于藥物吸收轉(zhuǎn)運機D葡萄糖酸-14-內(nèi)酯(2.23%)。EEB成分中含有的有制研究,可表現(xiàn)出與人小腸上皮細胞相似的與糖消化2022014,vo.35,No.17自品科字※營養(yǎng)衛(wèi)生吸收有關(guān)的酶以及蛋白質(zhì)。故可借助Caco-2細胞所表山奈酚a-3OB-葡萄糖和杜仲醇。本實驗分析得到了兒達的α-葡萄糖苷酶構(gòu)建模型來研究EEB對α-葡萄糖苷酶的荼素,含量為0.88%。由于提取分離杜仲葉方法不同,作用。并未檢測到槲皮素、山奈酚a-3-O-B-葡萄糖和杜仲醇。首先在酶-抑制劑模型中,EEB抑制率最高,為但是,EEB中的其他成分可能具備抑制a-葡萄糖苷酶的(43.08±0.55)%。其次酶促反應(yīng)動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)活性。桂花中的脂肪酸具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活EEB對a-葡萄糖苷酶抑制類型為競爭性抑制且K值僅為性國。EEB成分中含有有機酸的種類最多,包含10種飽32.90mg/mL,這說明EEB與α-葡萄糖苷酶有很高的親和和脂肪酸,6種不飽和脂肪酸以及3種芳香族脂肪酸。性。之后進一步利用Caco-2細胞模型發(fā)現(xiàn),EEB以麥芽其中不飽和脂肪酸含量最高,達6.86%。杜仲多糖對四糖為底物時對細胞內(nèi)a-葡萄糖苷酶有較強抑制率。EEB氧嘧啶致糖尿病小鼠有一定的降血糖作用。苦瓜多糖抑制a-葡萄糖苷酶活性隨著EEB質(zhì)量濃度升高而升高,和蘆薈多糖都有降血糖的作用,而苦瓜多糖主要由阿拉ICs值為0.57mg/mL。對比常用降血糖藥物-阿卡波糖在伯糖、半乳糖和鼠李糖等構(gòu)成;蘆薈多糖以甘露糖、阿020mg/mL時對a-葡萄糖苷酶活性抑制率為6792%,同拉伯糖等構(gòu)成。本實驗發(fā)現(xiàn)EEB含有的單糖類化合物等質(zhì)量濃度的杜仲葉乙醇提取物抑制率達到了5757%。相對含量為13.25%,其中吡喃甘露糖含量相對較高葡萄糖吸收過程中主要涉及鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體1為2.37%;阿拉伯呋喃糖含量為1.46%;呋喃半乳糖為( sodium/ glucose cotransporter-1,SGLT-1)、葡萄1.81%。茶多酚對a-葡萄糖苷酶有較強的抑制活性且延緩糖協(xié)助擴散轉(zhuǎn)運載體2( glucose transporter2,GLUT-2)小腸對糖的消化吸收起到降糖作用。EEB中兒茶素含兩種跨膜轉(zhuǎn)運載體蛋白(28。其中位于小腸細胞黏量為088%。除此,EEB中還檢測到百里酚、3,4二羥基膜表面上的SGLT-1起主導(dǎo)作用,其在細胞基底膜苯丙烯酸、4-羥基-3-甲氧基苯乙二醇等酚類物質(zhì)。海帶NaK-ATP酶作用下逆№濃度差,消耗能量,主動轉(zhuǎn)運葡萄中提取得到的D甘露醇與丙酮合成的二異亞丙基甘露醇糖。因此,腸道葡萄糖的跨膜吸收主要涉及SGLT1、可抑制a-葡萄糖苷酶活性。EEB中可分離得到5種醇類GLUT2和Na-KATP酶共3種蛋白。Caco-2細胞模型成分(327%)。EEB中內(nèi)酯類化合物的相對含量最高,中,EEB除可抑制α-葡萄糖苷酶活性外還可抑制葡萄糖為1675%,其中DL-異檸檬酸內(nèi)酯的相對含量最高,達到攝取吸收,1.00mg/mL時抑制率26.25%。針對EEB抑1379%。此外,EEB中還檢測出2種氨基酸(17%)制℃aco-2細胞中葡萄糖吸收的具體機制尚不清楚。但研分別為5-氧代脯氨酸和4羥基脯氨酸。L-羥基脯氨酸能使究表明,茶葉提取物可通過竟?fàn)幮砸种艭aco-2細胞膜上正常小鼠進食量明顯增加時而不增加體質(zhì)量增長速率,減SGLT-I、GLUT-2、GLUT-5等葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的活性來少營養(yǎng)性肥胖模型大鼠的體質(zhì)量馴。根據(jù)以上成分結(jié)構(gòu)鑒抑制細胞對于葡萄糖的吸收。夏枯草提取物可能通過定,本實驗發(fā)現(xiàn)EEB含有兒茶素、百里酚、吡喃甘露糖、抑制SCLT-1、GLUT-2及Na'-K‘-ATP酶在mRNA水平上的2,6二羥基-苯甲酸,3,4二羥基-苯丙烯酸和DL-異檸檬酸表達,抑制轉(zhuǎn)運蛋白生成量,從而降低葡萄糖吸收量。內(nèi)酯等成分,含量最高可達13.79%。推測這些成分可以抑因此,EEB可能通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的活性或者抑制a-葡萄糖苷酶活性,為測定其在杜仲葉中的含量以及進制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白在mRNA水平上的表達,從而實現(xiàn)對步研究它們對a葡萄糖苷酶的抑制作用奠定了基礎(chǔ)。葡萄糖吸收的抑制。在本實驗基礎(chǔ)上,可通過繼續(xù)實驗研究在Caco-24結(jié)論細胞模型上EEB對于蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖等其他二糖酶的抑制效果,研究其對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的影本實驗發(fā)現(xiàn),杜仲葉乙醇提取物降血糖效果主要是響,以便于進一步研究EEB的降血糖機制。綜上可通過抑制α-葡萄糖苷酶活力,減少葡萄糖吸收,降低餐得,EEB可通過抑制a-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖吸收后高血糖實現(xiàn)的。本實驗從糖的消化轉(zhuǎn)運途徑闡明了杜起到降血糖的效果。仲葉降血糖保健功效的原理,為杜仲葉治療糖尿病的開藥用植物中,具備抗a-葡萄糖苷酶活性的有效成分發(fā)利用打下了理論基礎(chǔ)。主要由多酚、黃酮及黃酮苷、生物堿、三萜及其苷類、肽類、酯類、酸類等組成。GCMS分析EEB主要成參考文獻分含有酸類、單糖類、多酚、酯類、氨基酸等物質(zhì)。有]王華.糖尿病藥物治療的研究進展U]臨床合理用藥雜志,2010研究發(fā)現(xiàn),利用高效液相色譜法分離杜仲茶甲醇提取物3(3):123-124.可得到5種α-葡萄糖苷酶抑制劑分別為:槲皮素、兒茶[2]季芳,肖國春,董莉,等.藥用植物來源的a葡萄糖苷酶抑制劑研究進展U中國中藥雜志,2010,35(12):16331640素a(78-bc)-44(34二羥基)a(3HD吡喃糖、兒B李玉萍,白冰,葉軍,等,a葡萄糖苷酶抑制劑的制備和活性研究進茶素-a(7,8-b.c)4B-(3,4二羥基)-a(3H)葡萄糖展門食品科學(xué),2008,299):617-62※營養(yǎng)衛(wèi)生良品利享2014,W.35,No.172034】] 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