研究報告中國釀造2011年第3期總第228期·35生物法制備乙醇酸的研究尹秀蓮!,游慶紅12,蔣中海(1淮陰工學(xué)胱生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,江蘇淮安223001;2南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院,江蘇南京210009)摘要:目的:對氧化葡萄糖酸桿菌生物轉(zhuǎn)化乙二醇生產(chǎn)乙醇酸的工藝進行研究,方法:首先采用單因素試驗優(yōu)化了氧化葡萄糖酸桿菌生物轉(zhuǎn)化乙二醇生成乙醇酸的工藝在此基礎(chǔ)上通過正交試驗對轉(zhuǎn)化工藝進行了進一步探討。結(jié)果:氧化葡萄糖酸桿菌生物轉(zhuǎn)化乙二醇生成乙醇酸的最優(yōu)工藝為12.6%靜息細胞56%乙二醇維持pH584轉(zhuǎn)化48h,乙二醇單體轉(zhuǎn)化率可達60886%·結(jié)論:應(yīng)用氧化葡萄糖酸桿菌生物轉(zhuǎn)化乙二醇生產(chǎn)乙醇酸的工藝的切實可行關(guān)鑣詞:氧化葡萄糖酸桿菌;乙二醇:乙醇酸;單因素試驗中圖分類號:TQ9206文獻標識碼:A文章編號:0254-5071(2011)03003503Preparation of glycolic acid by biotransformationYIN Xiulian ', YOU Qinghong ", JIANG Zhonghai(1. College of Life Sciences and Chemical Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huai'an 223001, China; 2. College of Food Scienceand Light Industry, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China)Abstract: Objective: Study on transformation technology of ethylene glycol to glycolic acid by Gluconobater oxydans. Methods: Biotransformationom ethylene glycol to glycolic acid by G. oxydans was optimized with single factor experiments and further study with orthogonal experiment. Re-sults: the optimum conditions for ethylene glycol transformation were as follows: concentration of resting cells 12. 6%, ethylene glycol 5.6%, pH 5.84,48h. Transformation rate reached 60886% under the optimum conditions. Conclusion: biotransformation of ethylene glycol to glycolic acid by G.oxydans is practicableKey words: Gluconobacter oxydans, ethylene glycol; glyingle factor experiments乙醇酸又稱羥基乙酸、甘醇酸在自然界尤其是甘蔗、而應(yīng)用生物法合成乙醇酸,不但產(chǎn)品質(zhì)量高,而且反應(yīng)條甜菜以及未成熟葡萄汁中存在,可用于制備生物醫(yī)用材料件溫和,產(chǎn)物易于分離。試驗對利用氧化葡萄糖酸桿菌轉(zhuǎn)和生物可降解新材料等諸多領(lǐng)域,但其含量較低,且與其化乙二醇生產(chǎn)乙醇酸的工藝進行了初步研究,為乙醇酸的他物質(zhì)共存難于提純分離。目前乙醇酸的生產(chǎn)方法主要生產(chǎn)開拓一條新的可能途徑。有氯乙酸水解法、羥基乙氰水解法、乙二醛氧化法、草酸電1材料與方法還原法等化學(xué)方法,但此類方法大多存在需要使用有毒有1.1材料害原料,產(chǎn)物分離純化困難,難以得到純品等缺點近年11.1菌種及主要試劑來,醫(yī)藥和化妝品行業(yè)對高純度乙醇酸的需求越來越大,氧化葡萄糖酸桿菌( Gluconobater oxydans,GOX,本收稿日期:2010-1207基金項目:江蘇省科技計劃(BE0093084);淮陰工學(xué)院青年科學(xué)基金項目(HGC0918)作者簡介:尹秀蓮(1978),女,講師研究方向為生物催化及天然活性成分提取分離萄糖含量不是很高的情況下,麥麩和玉米粉2種天然的營床轉(zhuǎn)速),可使得菌絲產(chǎn)量提高。由于木霉真菌T68對環(huán)境養(yǎng)物質(zhì)能夠為木霉的生長提供全面的營養(yǎng)因子。一方面,的廣適性和低要求,使木霉在我國的生防菌劑中占有重要在培養(yǎng)基中少加些葡萄糖,可以大大降低生產(chǎn)用成本;另地位,該試驗可為今后研制開發(fā)木霉菌劑提供理論依據(jù)方面,玉米粉和麩皮是一類來源廣泛易得的原料,而通過試驗可知,玉米粉的含量對木霉菌絲體干重的影響最為參考文獻:顯著,含量過低將不能滿足木霉生長的要求:同時,麥麩劉梅,徐同木的背養(yǎng)生長及發(fā)酵條件門云南農(nóng)業(yè)大學(xué)報,除含有豐富的有機氮外還含有多種營養(yǎng)因子和無機元素2]吳克劉斌等木冪T6木聚糖酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)研究小食品與(如生物素、磷等),可促進菌體的生長。二者作為培養(yǎng)基發(fā)酵工業(yè),200027):9-12對木霉進行工業(yè)化發(fā)酵,投入成本將可大大較低3]王英姿祁之秋等綠色木冪蔭固體發(fā)醇培養(yǎng)基優(yōu)化組合正交篩選迄今為止,對木霉真菌防治各類植物病害的研究多集[植物保護,2007(33):6163中在木霉生防機制方面對木霉真菌的發(fā)酵條件研究較少。岡林元山張曙光等綠色木霉固態(tài)發(fā)酵稻草秸稈產(chǎn)纖維素酶的研究湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(93):4648該試驗結(jié)果表明,木霉真菌T68生長要求的溫度和pH值范③吳克敬民,等木霉南株T6木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)圍較廣,且選擇適宜的營養(yǎng)因素和發(fā)酵條件(如溫度、搖研究[門麟物系統(tǒng)2001(20):191-1952011No3·36· Senal No228China BrewingResearch Report實驗室保存;乙二醇(分析純)。因為隨著細胞濃度增大,相應(yīng)地催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶量也增1.1.2培養(yǎng)基加了,從而加快了酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率;此后隨著細胞濃度斜面培養(yǎng)基:6%山梨醇,3%酵母粉,0.3%KHPO,0.1%進一步增大,轉(zhuǎn)化率有所降低,這可能是由于較高的細胞MgSO47HO,0.1%味精2%瓊脂。濃度造成細胞的破裂以及內(nèi)含物釋放,污染反應(yīng)系統(tǒng),降種子培養(yǎng)、基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:6%山梨醇,3%酵母粉,低轉(zhuǎn)化率;因此靜息細胞濃度選擇120g/L,即12%(wv)細0.3%KHPO,0.1%MgSO7HO,0.1%味精,pH6.0。胞濃度1.1.3主要儀器HP1100系列高效液相色譜儀,HP6890 Series氣相色譜儀,離心機(M304781),手提醫(yī)用蒸氣壓力滅菌鍋DsX280B),搖床(KYC-11),超凈工作臺(SWCJ-2F)。12方法斜面培養(yǎng):將保藏斜面菌種轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)3d。種子培養(yǎng):將斜面蔭種轉(zhuǎn)接到含15mL發(fā)酵培養(yǎng)基的GOX濃度(g·L")150mL搖瓶中,28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h田1不同靜息細胞濃度對轉(zhuǎn)化率的影響基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng):按10%的接種量接入含150mL發(fā)酵培Figure 1. Effect of resting cell concentrations on molar conversion養(yǎng)基的500mL搖瓶,28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)。靜息細胞的制備:發(fā)酵液8000min離心10min,棄上2.1.2不同底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響清液,收集菌泥用無菌蒸餾水洗滌2遍,得靜息細胞底物濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)有一定影響,以211的優(yōu)化為基底物轉(zhuǎn)化培養(yǎng):配好底物轉(zhuǎn)化液,滅菌,接入適量靜息礎(chǔ)考察了不同乙二醇底物濃度對反應(yīng)的影響,結(jié)果見B細胞,28℃、220r/min搖床培養(yǎng)48h分析方法:采用HPLC分析乙醇酸方法。樣品預(yù)處理:取1mL~2mL轉(zhuǎn)化液800min離心10min,045μm濾膜過濾,超純水稀釋一定倍數(shù)制成待測液。色譜條件:色譜柱: Agilent ZoRBSX SB-Aq(5μm,46mmx250mm);流動相:0.1%的磷酸溶液(pH25);檢測波長:2l0m;流速:04 mL/min:進樣量:10μL:柱溫:30℃。氣相色譜(GC)分析乙二醇方法:乙二醇檢測方法采底物濃度(g·L")用GC,具體方法見文獻[4]不同底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化:將適量靜息細胞懸浮于一定pH值Fgue2 Effect of substrate concentrations of on molar conversion的0lmoⅥ磷酸鹽緩沖液中,加入適量底物乙二醇,250mL搖瓶裝液30mL振蕩培養(yǎng)48h,中間取樣lmL,離心,測定上由圖2可知,當乙二醇濃度低于6%時,反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為清液中乙二醇及乙醇酸的量62%左右,隨著底物濃度的增加,轉(zhuǎn)化率明顯下降,在底物乙二醇轉(zhuǎn)化率的計算:濃度為100g/L時轉(zhuǎn)化率僅為37%,這說明過高濃度的底乙三醇轉(zhuǎn)化率二轉(zhuǎn)花隔反應(yīng)液中乙柳摩東數(shù)0物會對反應(yīng)產(chǎn)生強烈的抑制作用,不利于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進行,高濃度的底物不適合轉(zhuǎn)化反應(yīng)綜合考慮,研究選擇6%底2結(jié)果與分析物濃度2l氧化葡萄糖酸桿菌轉(zhuǎn)化乙二醇生成乙醇酸的單因素2.13不同pH值對轉(zhuǎn)化率的彩響研究由于GOX轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中不斷生成酸導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化過211不同靜息細胞濃度對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響程中pH值會逐步降低,導(dǎo)致偏離起始pH值,以2.1.2優(yōu)化結(jié)許多因素會影響產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率其中采用全細胞轉(zhuǎn)化時果為基礎(chǔ)分別采用控制不同pH值的方法考察了其對轉(zhuǎn)化靜息細胞的濃度對反應(yīng)有較大影響在底物濃度為6%轉(zhuǎn)率的影響?；^程中控制pH值為60時,分別考察不同靜息細胞濃度對由圖3可知控制不同pH值轉(zhuǎn)化率影響較大,當pH產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖1。值<60時轉(zhuǎn)化率隨pH值增大而快速增加:當pH>60時,由圖1可知,起初轉(zhuǎn)化率隨著靜息細胞濃度增大而迅轉(zhuǎn)化率隨pH值增大而逐步降低:若控制pH值為60,轉(zhuǎn)化速增加,靜息細胞濃度為120g時轉(zhuǎn)化率可達60%;這是率可達65%,這可能是因為pH值影響了轉(zhuǎn)化反應(yīng)相關(guān)酶系2011年第3期研究報告中國釀造總第228期·37的性質(zhì),從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率的變化。失擬項反映的是試驗數(shù)據(jù)與模型不相符的情況,p0.293表明失擬不顯著因此模型選擇正確;同時由回歸分析得出R=99.35%也充分說明了回歸方程的可靠性:因此,可以利用該冋歸方程確定最佳提取工藝條件表3響應(yīng)面回歸分析結(jié)果Table 3. Results of anovA自由度平方和校正平方和校正均方F96L20176120176.80029.150.00055055606570線性31.0525105250.35086.150023平方354.8942548942182981320.6200003不同pH值對轉(zhuǎn)化率的影響交互作用352550525501.751730690000Figure 3. Effect of pH value on molar conversion殘差誤差70.3995039950.0571失擬30.227502275007581.76029322GOX轉(zhuǎn)化過程的響應(yīng)面優(yōu)化純誤差40.17200.172000430在21單因素試驗的基礎(chǔ)上選擇直接影響轉(zhuǎn)化效果的1661.6012靜息細胞濃度、底物濃度轉(zhuǎn)化pH值3個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化以反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為指標,確定最佳轉(zhuǎn)化條件,試驗因素根據(jù)回歸分析結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖,以確認靜與水平設(shè)計見表1,響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2息細胞濃度、底物濃度、轉(zhuǎn)化p值3因素對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖表1響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 1. Factors and levels of RSM analysis水平x細胞濃度/(g·100mLx底物濃度%XpH值126.060表2轉(zhuǎn)化反應(yīng)響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果X細胞濃度/Table 2. Experimental design and resutts of RSM驗轉(zhuǎn)化率57.7566605686.523456789012345670000:5756.1X細胞濃度/%01:11000055.960.0根據(jù)表2的試驗結(jié)果,通過Mnab軟件處理確定回歸圖4各因素交互作用對轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Figure 4. Response surfaces and contours of Y=f(X, X M(a)方程:Y=6094+0.1625X02875X015X1-1.95X-1845X2Y-t(X,, x)(b). Y=f(X,xXc)207X3005XX-0675XX0.925XX。對表2進行方差分析,結(jié)果見表3。從方差分析表3)中可知,二次項和交互項由各因素對響應(yīng)值的影響(圖4)可知底物濃度(X2)對響應(yīng)值的影響極顯著,而一次項對響應(yīng)值的影響不明顯,對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡:而靜息2011No3·38· Serial No228China BrewingResearch Report清香型大曲及酒醅中擬內(nèi)孢霉的分離鑒定劉志磊凵2,曹健3,王德良砷,王旭亮2,胡建華←(1河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州450001;2中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京1000273中原工學(xué)院,河南鄭州45007;4北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠,北京101301)摘要:從某清香型大曲及酒醅中分離出80株酵母類微生物對其初步分類后通過平板分離培養(yǎng)、顯微鏡形態(tài)觀察和分子生物學(xué)實驗等綜合分析,鑒定出其中1株為肋狀擬內(nèi)抱霉。該研究克服了酵母微生物形態(tài)相似生理生化特征相近,傳統(tǒng)方法難以鑒定的缺點擬內(nèi)胞霉的鑒定提供參考關(guān)鑣詞:清香型白酒:微生物:擬內(nèi)孢霉;分子鑒定中圖分類號:TS261.1文獻標識碼:A文章編號:02545071(2011)030038-03Isolation and identification of Saccharomycopsis fibuligera from Fen-flavor Daqu and fermented grainsLIU Zhilei", CAO Jian", WANG Deliang WANG Xuliang, HU Jianhua?(1. Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China; 2. China National Research Institute of Food & FermentationIndustries, Bejing 100027, China; 3. Zhongyuan University of Technology, Zhengzhou 450007, China;4. Niulanshan Distillery, Shunxin Agriculture Co, Ltd., Bejing 101301, China)Abstract: Eighty yeasts strains were isolated from Fen-flavor daqu and fermented gains in distillery. One strain was finally identified as Saccharomycopsis fibuligera through comprehensive biology experiments of morphology and molecular. The morphology of yeasts microorganism and theirphysiological and biochemical characteristics are similar, it is difficult to identify yeasts with the traditional method. The morphological characteris-tics and molecular identification of Saccharomycopsis fibuligera were studied in this experiment. It could provide some references for Saccharomycopsis fibuligera identificationKey words: Fen-flavor; microorganisms; Saccharomycopsis fibuligera, molecular identification擬內(nèi)孢霉是大曲中的主要上霉微生物,在酒醅發(fā)酵過程中廣泛存在叫一般認為擬內(nèi)孢莓主要起糖化作用收稿日期:20101124基金項目:國家科技支撢計劃(2008BA163B06作者簡介:劉志磊(1985)男河南南樂人,碩士研究生研究方向為食品微生物:王德良高級工程師通訊作者細胞濃度CX)與轉(zhuǎn)化pH值(X)次之,表現(xiàn)為曲線相對平3結(jié)論與展望滑,且隨其數(shù)值的增加或減少反應(yīng)轉(zhuǎn)化率變化相對較小。3.1以乙二醇單體轉(zhuǎn)化率為指標,在單因素試驗的基礎(chǔ)上底物濃度和轉(zhuǎn)化pH值之間的交互作用最為明顯:靜息細胞應(yīng)用響應(yīng)面分析對GOX轉(zhuǎn)化乙二醇生產(chǎn)乙醇酸的轉(zhuǎn)化條濃度和轉(zhuǎn)化pH值交互作用次之;靜息細胞濃度與轉(zhuǎn)化pH值件進行了研究結(jié)果表明最佳轉(zhuǎn)化工藝為采用126%靜交互作用最不顯著其對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響規(guī)律并不會隨息細胞濃度、56%乙二醇濃度在pH584的條件下轉(zhuǎn)化48h著另一因素的改變而有明顯變化乙二醇單體轉(zhuǎn)化率可達60.886%根據(jù)所得到的回歸模型分別對x、X2、X求偏導(dǎo)數(shù)32乙醇酸是一種有重要應(yīng)用的產(chǎn)品,盡管試驗開發(fā)了其并解方程組,可知當X0.0463256,X0.0715739,X產(chǎn)一條新的生產(chǎn)途徑,但由于成本等因素制約了其在工業(yè)0.0277932時反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為6056%;即穩(wěn)定狀態(tài)下的最生產(chǎn)上的應(yīng)用,今后,如能通過進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝降低優(yōu)工藝是細胞濃度1256%底物濃度為557%6pH值5.833,生產(chǎn)成本必將會推動我國乙醇酸產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。在此條件下反應(yīng)轉(zhuǎn)化率理論上可達60956%23驗證試驗參考文獻:為了驗證預(yù)測結(jié)果是否真實有效根據(jù)以上預(yù)測進行[U田克勝,王保偉乙醇酸的合成及應(yīng)用天然氣化工,200,31(6了近似驗證試驗,考慮到操作方便,將最佳工藝條件修正為:細胞濃度126%底物濃度為56%H值584:在此條2王端好,張小里氧化葡萄糖殷桿酯培養(yǎng)及生物轉(zhuǎn)化性能的研究件下進行3次平行試驗結(jié)果轉(zhuǎn)化率分別為6086%60.89%食品科學(xué),2007,28(10):332-3356091%平均轉(zhuǎn)化率為60886%,與理論預(yù)測值相比相對3]盧立涅陶建偉陸慶寧,等反相高效液相色譜測定在乙醇酸和草酸誤差僅為0.1%,較好地證明了此模型能模擬和預(yù)測試存在下的乙醛酸含量門理化檢驗·化學(xué)分冊,2006,42(8):6446464]陳亞飛,孫字宋玉娟等氣相色譜法測定羥乙基淀粉中乙二醇的驗結(jié)果殘留量[門中國藥事2007,21(5):327-329