沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,201006,41(3):2099303Joumal of Shenyang Agricultural University, 2010-06, 41(3): 299-303鎘對土壤脲酶動力學特征的影響張昀,可欣2,關連珠1*,顏麗1(1沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院,沈陽10866;2沈陽航空航天大學遼寧省清潔能源重點實驗室,沈陽110136)摘要:采用室內模擬培養(yǎng)的方法,對鎘污染土壤脲酶動力學特征進行了研究。結果表明:脲酶活性隨著培養(yǎng)時間的增加而降低,并在第6天達到最大抑制率;同一培養(yǎng)時間內,隨著鎘濃度的增加,土壤脲酶活性呈現(xiàn)降低的趨勢;兩種模型擬合結果表明模型yrc(l+axy(14+bx)擬合效果較好,說明鎘對土壤脲酶活性的抑制為部分抑制;隨著鎘濃度的增加K值不變,V-和V/K。呈降低趨勢,說明鎘對土壤脈酶的作用為非競爭型抑制,即抑制作用為部分非競爭型抑制。關罐詞:鎘;脲酶;酶動力學;土壤污染中圖分類號:S1542文獻標識碼:A文章編號:1000-1700(2010)03-0299-05Effect of cadmium on Kinetic characteristics of soil ureaseZHANG Yun! KE Xin GUAN Lian-zhu* YAN Li'(1. College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2 Shenyang AeroSpace University, Liaoning KeyLab of Clean Energy, Shenyang 110136, ChinaAbstract: The kinetic characteristics of soil urease were studied. The results showed that soil urease was remarkable inhibitedwith the concentration of Cd adding. While the maximum inhibtion ratio was attained in the sixth incubation day, the relationshipbetween the concentration of Cd+ and soil urease was described by two models, and the model y=c(1 +ar (1 +bx)was moresuitable. This means that the inhibtion of Cd on soil urease was part of inhibition. The K. was not effected, but the V andVK, were lowed while Cd adding. This results showed that the enzymatic reaction mechanism was noncompetion-inhibitorybetween soil urease and cadmiumKey words: Cadmium; soil urease; enzyme kinetic; soil contamination鎘Cd)是危及人類健康的有毒重金屬之一,在美國毒物管理委員會( ATSDR)黑名單上名列第六位常隨著工業(yè)三廢的排放及農(nóng)藥、施肥等農(nóng)事活動進人到土壤生態(tài)系統(tǒng)中,并最終通過遷移、富集等過程進入食物鏈,對植物微生物、動物及人類產(chǎn)生威脅。我國土壤鎘污染面積約為13300hm2,土壤鎘含量在1-5ng·kg,最高可達10mg-kg。土壤酶是土壤中重要的生物大分子,作為養(yǎng)分循環(huán)、有機質形成、能量代謝等過程的催化劑,近年來被應用于土壤污染研究領域。由于土壤脲酶動力學特征不僅可以顯示土壤脲酶含量的高低,而且反映了土壤脲酶與底物、土壤有機-無機復合體等之間結合的緊密程度和作用過程,因此被廣泛關注嗎。近年來,在污染物和抑制劑與土壤酶之間關系的研究中,土壤酶動力學方法已逐漸開始被采用,但關于鎘對棕壤脲酶動力學特征影響的報道較少。因此開展此方面研究具有重要的理論和實際意義。本研究釆用室內模擬培養(yǎng)方法,對鎘污染土壤的脲酶特征進行分析,以探討二者關系及作用機理,為環(huán)境監(jiān)測提供相關依據(jù)。1材料與方法11供試土壤供試土壤為典型棕壤采自沈陽農(nóng)業(yè)大學天柱山田間試驗區(qū),為未受污染土壤,采樣時先去除0~5cm表面土樣,然后五點法釆集5-20cm土樣,供試土壤均勻風干后挑除植物殘體,過2mm尼龍篩備用。用常規(guī)方法測定土壤理化性質。供試土壤基本理化性質見表1中國煤化工收稿日期:2010-03-19CNMHG基金項目:遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目(20081151)作者簡介:張畇(197-),女,沈陽農(nóng)業(yè)大學講師,博士研究生,從事環(huán)境土壤學研究?！ねㄓ嵶髡?Corresponding author:美連珠(1958-),男,沈陽農(nóng)業(yè)大學教授,博士,從事土壤環(huán)境研究沈陽農(nóng)業(yè)大學學報第41卷喪1供試士壤基本理化性質Table 1 Some physical and chemical properties of tested soil陽離子「機質交換量速效鉀全氤全磷堿解氮有效確全量鎘Avail.KTotal PCECs-Avail K Total NAvail P/gkg/g*kg/col.K/mg kg/mg·kg1.2方法將過2mm篩的土壤樣品500g,裝入培養(yǎng)缽中加水至田間持水量的65%,于28℃下培養(yǎng)1周,加入不同濃度的cdC2溶液,使土壤鎘濃度分別為10,30,50,100,200 d".kg",于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),各處理均重復3次,每天稱重以保持土壤含水量不變,并攪拌土壤,保持土壤通氣性,分別于培養(yǎng)的1,3,6,10,15,30d進行取樣分析,測定土壤脲酶活性嗎。分別稱取上述不同培養(yǎng)時間的土樣500g,加入1mL甲苯15min后添加10mL不同濃度(001,0.025,0.05,0.1,0.2molL)尿素溶液和20mLpH67檸檬酸緩沖液,37℃培養(yǎng),培養(yǎng)結束后,濾液中被脲酶水解成的氨氮用靛酚蘭比色測定脈酶活性,并計算脲酶動力學參數(shù)。13模型的建立和數(shù)據(jù)處理131動力學參數(shù)的計算米氏方程:v=mSL式中:V為酶促反應初始濃度;v=為最大反應速度;S為底物濃度;Kn是為米氏常數(shù)。方程經(jīng)過數(shù)學變換,變形為:用 Sigmaplot軟件進行擬合即可求得K和V=。132模擬方程 SPEIR從米氏動力學方程推導出砷抑制土壤酶活性的兩種模型:(1)y=/(1+bx)和(2)y=c(1+ax)(1+bx)(圖1),可以用來擬合外源污染物(x)與土壤酶活性(y)之間的關系,兩種擬合方程分別賦予其重要的信息,即反映的作用機理分別為完全抑制(包括完全競爭抑制或完全非競爭性抑制)和部分抑制(包括部分競爭抑制和部分非競爭性抑制)mac+c。b作用:其中a,b,c為在一定底物濃度下受到抑制常數(shù)K、最大反應速度和米氏常數(shù)以及抑制類型等共同作用下形成的復合參數(shù),c為污染物濃度為0時土壤酶活性理論值,a,b,c均為正數(shù),且b>d1。由兩種模型的擬合方程可計算生態(tài)劑量( ecological dose,ED)EDo、ED、ED值,其分別代表土壤酶活性被抑制10%、圖1分別用模型(1)-)和模型(2)(……表示土壤50%和90%時所需要的污染物濃度或劑量。通常人們將EDs酶活性(v)與污染物濃度(i)之間的關系作為土壤污染的一個臨界濃度。由模型(1)計算的EDo為土壤 Figure 1 Relationships between enzyme(v)酶活性理論值(c)降低到50%時的污染物濃度,即ED=1;模 activies and inhibitor concentration (i)descri型(2)中土壤酶活性沒有降低到0,而是降低到漸進值(平行于x軸,但在x軸之上),因此由模型(2)計算的EDs為土壤酶活性降低到理論值(c)與漸進值之間的一半時的污染物濃度,即ED=(1-ab)/(b-a)。13.3土壤酶活性的影響率的計算為了定量描述不同濃度鎘對土壤酶活性的影響,采用土壤酶活性影響率對其進行描述土壤酶活性的影響率=CUYH中國煤化工CNMHG式中:U為各處理土壤酶活性3次重復平均值;U為對照(鎘濃度為0mgkg4的處理)土壤酶活性為3次重復平均值。土壤酶活性的影響率包括兩種:如果其值為正,則為激活率;如果為負,則為抑制率。第3期張昀等:鎘對土壤脲酶動力學特征的影響2結果與分析襄2不同培養(yǎng)時間不同濃度鎘處理土壤脲酶活性Table 2 Soil urease of different Cd concentrations in21鎘對土壤脲酶活性的影響different incubation time由表2可見,在整個培養(yǎng)期間內對照處理的土壤脲酶活性 Soil urease脲酶活性無明顯變化,添加鎘的各處理脲酶活性3d6d10d均隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,并在第6天出現(xiàn)一個最低峰,各處理的土壤脲4.14C408E3013.854c455C454C酶活性分別為301,242,2.04,171,1,26μg·g同0003953.574242403.25:3963.96培養(yǎng)時間內,隨著鎘濃度的增加,土壤脲酶活性3.83301c204c3.I1k3.793.78呈現(xiàn)降低的趨勢,到培養(yǎng)結束時,各處理的土壤脲27211.729183.283.28A酶活性趨于穩(wěn)定262673.163.6注:小寫字母表示p005水平差異顯著大寫字母表示p<001水平差異顯2.2鎘對土壤脲酶影響率的動態(tài)影響著同一列中相同字母表示各處理間差異不顯著,不同字母表示各處理為了定量描述不同濃度鎘對土壤脲酶活性的間差異顯著。影響,采用土壤脲酶活性影響率對其進行描述(圖 Note little letters indicated significant diference af005 level, big letters indi-2)。添加10,30,50,100,200mg·kg2鎘的處理在試cated significant diference at 0.01 level, the different letters in same驗培養(yǎng)期間內對土壤脲酶活性的抑制率分別為columns indicate significant difference between means.0.72%-42.09%,447%~52.24%,8.23%~60.88%培養(yǎng)時間Ineubation time d1146%-67.29%,1063%-7539%。且均表現(xiàn)為在第6天達到對土壤脲酶活性的最大抑制作用,不同濃度鎘處理的抑制率分別為4209%、5224%60.88%、6729%、7539%,隨后各處理土壤脲酶活性逐漸恢復?？?0分別用模型(1)y=c(1+bx)和模型(2)y=c(130ax)(1+bx)兩種模型進行擬合(表3),由擬合方程可口100計算生態(tài)劑量( ecological dose,ED) EDoEDs、ED值,其分別代表土壤酶活性被抑制10%、50%和圖2不同濃度鎘對土壤脲酶的影響率90%時所需要的污染物濃度或劑量。通常人們將 Figure2 The effect ratio of different Cd concentrations onEDx作為土壤污染的一個臨界濃度。soil neutral phosphatase表3土壤脲酶活性與不同濃度鎘的模擬方程Table 3 The fit models betweeen concentration of Cd and soil urease型參數(shù)培養(yǎng)時間 Incubation time/dModel模型(1)00069002700002700031y=c/(1+bx)4.080846934457214.56160927142986113050007100259001200122y=c(l+ar(1+bx) b4.70345.106451415485574.834709870.99208853.668中國煤化工332.397漸進值 Asymptote2296aL,.CNMHG7Z2 2.756注:*表示P0.05水平差異顯著表示R001水平差異顯著,漸進值為土壤酶活性譯世為對于模型沒有意義的數(shù)值Note:* indicated significant diference at 0.05 level, **indicated significant diference at 0.01 level, Asymptote values are presentde as maximum(unin-hibited)activity;-indicates no fit of the date to the model沈陽農(nóng)業(yè)大學學報第41卷由模型(1)擬合的決定系數(shù)為0623-0927,而由模型(2)擬合的決定系數(shù)為0893~0992,模型(2)的決定系數(shù)大于模型(1)的決定系數(shù)模型(2)比模型(1)更能表示不同培養(yǎng)時間不同濃度鎘與土壤脲酶活性之間相關關系。從側面表明了鎘對土壤脲酶的作用為部分抑制,其中包括部分競爭抑制和部分非競爭性抑制由模型(2)計算出的EDo值在5-263mg·kg之間,而由模型(1)計算出的EDs在37-1429mg·kg4之間,由模型(2)計算出的EDs明顯小于由模型(1)計算出的EDsEDo值表征土壤受到了極為嚴重污染時的濃度,此時土壤已經(jīng)基本喪失了生產(chǎn)的功能,由模型(2)計算出的ED為432mgkg2,此時,土壤就達到了極其嚴重污染的程度,從土壤生化角度來講,土壤已經(jīng)不能完成物質轉化、能量代謝等功能。23鎘對土壤脲酶動力學參數(shù)的影響在試驗培養(yǎng)期間,各處理土壤脲酶的K值基本保持不變(表4),鎘的加入并未使土壤脲酶的K。值增大無明顯影響,并沒有隨著鎘濃度的加大,土壤脲酶的Kn值增大,說明鎘的加入沒有影響酶與底物的親和力減小,屬于典型的非競爭性抑制。在試驗培養(yǎng)期間,各處理土壤脲酶的V。值呈現(xiàn)升高-降低的趨勢(圖3a),并在培養(yǎng)的3-6d出現(xiàn)一個最高峰,鎘加入使土壤脲酶的V。降低,并隨著鎘濃度的加大,土壤脲酶的V值逐漸減少,說明鎘的加入,減弱了酶-底物復合體形成產(chǎn)物的能力。表4不同濃度鎘處理在不同培養(yǎng)時間下K。值Table 4 Effect of different of Cd concentrations on soil urease K, in different incubation days鎘濃度/ mg.kgd concentration0.03500340037峽100036003803300340.035M在試驗培養(yǎng)期間,各處理土壤脲酶V。/K的變化趨勢與V的變化趨勢相似,即呈現(xiàn)升高-降低的趨勢圖3b),并在培養(yǎng)的3~d出現(xiàn)一個最高峰,鎘加入使土壤脲酶的V-/K降低,隨著鎘濃度的加大,土壤脲酶的V。/K值逐漸減少,說明鎘的加入,減弱了土壤脲酶在催促反應過程中的催化強度。ng·k圖3不同濃度鎘對土壤脲酶V和v。Kn的影響Figure 3 Effect of different of Cd concentrations on soil urease Va and V-K, in different incubation days3結論與討論中國煤化工本研究結果表明,脲酶活性隨著培養(yǎng)時間的增加而降低,THCNMH同一培養(yǎng)時間內隨著鎘濃度的增加,土壤脲酶活性呈現(xiàn)降低的趨勢,這與胡著邦等的研究結果較為相似。目前國內外公認的重金屬對土壤酶活性的抑制機理可能包括兩個方面:一方面,重金屬加入土壤后與酶分子中的活性部位巰基和含第3期張昀等:鎘對土壤脲酶動力學特征的影響303·咪唑的配位體等結合形成較穩(wěn)定的絡合物,產(chǎn)生了與底物的競爭性抑制作用鳴;另一方面,重金屬抑制了土壤微生物的生長和繁殖減少微生物體內酶的合成和分泌,最后導致土壤酶活性下降鎘對土壤脲酶活性的抑制作用隨時間的變化先增加而減小,可能與鎘的形態(tài)轉化有關,并且土壤具有保護酶的能力,且這種保護容量常是一相對恒定的值。也有學者發(fā)現(xiàn)“抗性酶活性”現(xiàn)象認為當重金屬在土壤中達到一定濃度時,大部分微生物死亡而一小部分微生物在有毒物質污染下能生存下來,自行繁殖從而產(chǎn)生抗性酶活性,表觀上酶活性值降低后又增大兩種模型擬合結果表明模型y=c(1+ax)1+bx)擬合效果較好,說明鎘對土壤脲酶活性的抑制為部分抑制。從土壤性質分析,由于土壤酶受到有機質和粘粒的保護作用,所以在一個較寬的污染物濃度范圍內,其酶活性的變化一般不會總是以直線形式改變,而游離態(tài)酶有可能是以直線形式變化因此從這個角度來講模型y=c(1+ax)(1+bx)計算得到的生態(tài)劑量更合理。隨著鎘的增加Kn值不變,V—和V。/K呈降低趨勢,說明鎘對土壤脲酶的作用為非競爭型抑制,即抑制作用為部分非競爭型抑制。研究表明,K。受土壤粘粒含量和有機質含量影響較大,一般粘粒和有機質含量高的土壤Kn較大,本研究中有機質含量和粘?？梢砸暈楣潭ú蛔?由于V-值是總酶量的量度,其值減小說明重金屬鎘對脲酶活性的抑制作用習,從而進一步驗證了前面的結論。參考文獻[l]楊勁松張文昌鎘對細胞信號轉導系統(tǒng)干擾作用研究進展門福建醫(yī)科大學學報,20064065}537-538[2] STUMM W, MORGAN J J. 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