第11卷第2期生物技術Vol.11 ,No.22001年4月BIOTECHNOLOGYApr 2001thus the increase of its stability.It is found that chymotrypsin remained up to 97% of initial catalytic ac-tivity when there have50%( v/v )glycerol and the moderate pressure of 50 MPa in reversed micelles .Key words :kchymotrypsin ,reserved micelles icatalytic and stability iffeet of pressure itemperature iglyc-中圖分類號:Q814.9文獻標識碼:A文章編號:1004-311X 2001 )02 - 0023-03酶法測定甲醇酵母發(fā)酵液中甲醇濃度黃秀東'楊紅2張高峽'李樹剛' ,于廷和3( 1.重慶雨水生物醫(yī)藥研究所重慶4000602.重慶大學生物工程學院重慶400044 ;3.重慶醫(yī)科大學醫(yī)學超聲工程研究所重慶400016)摘要:用醇氧化酶-過氧化氫酶聯(lián)合的酶促反 應法測定甲醇酵母發(fā)酵誘導階段變化的發(fā)酵液中甲醇濃度建立一種能夠快速測定發(fā)酵液中甲醇濃度的方法。測定的最佳濃度范圍是0.5% ~ 5%。關鍵詞發(fā)酵;甲醇酵母;甲醇醇氧化酶甲醇酵母( Pichia pastoris )發(fā)酵的誘導階100ml0. 1M磷酸鹽緩沖液( pH7.0 )溶解4C段甲醇濃度的控制非常關鍵通常只有配備保存?zhèn)溆?。酶電極才能監(jiān)控發(fā)酵液中甲醇濃度的變化,1.1.2 酚溶液:苯酚( AR )200mg ,100ml蒸餾但是酶電極價格昂貴,使用壽命有限。而目水溶解。前用于測定酒類甲醇含量的國標方法1.1.3 工作液:臨使用前將上述1.1.1和( GB5009.48- 85 ),不論是氣相色譜法還是1.1.2試劑(酶酚)等體積混合。亞硫酸品紅比色法均需要昂貴或復雜的儀1.1.4 甲醇標準溶液器并且還要對樣品進行預處理不適合對動甲醇水溶液:用蒸餾水配制一系列不同態(tài)發(fā)酵過程監(jiān)測。濃度梯度的甲醇( AR溶液。我們采用醇氧化酶-過氧化氫酶聯(lián)合的甲醇發(fā)酵液將甲醇(工業(yè)級)加入未誘酶促反應法(簡稱AOX- CTR法) ,能對成分導階段的甲醇酵母發(fā)酵上清液中,配制同甲復雜而又不斷變化的發(fā)酵液中甲醇濃度進行醇水溶液相應濃度梯度甲醇發(fā)酵液溶液。跟蹤測定。無需對發(fā)酵液進行預處理,在甲1.1.5 儀器:HP8453型分光光度計。醇濃度為0.5% ~ 5%范圍內(nèi),可對其濃度進1.2 方法行快速測定。1.2.1 原理:甲醇等低級醇經(jīng)醇氧化酶( AI-cohol Oxidase AOX )催化,生成相應的醛及過1材料與方法氧化氫而后者在過氧化氫酶( Catalase .CTR )作用下，分解出原子態(tài)氧將無色還原型4-氨基安替比林與苯酚,偶聯(lián)氧化縮合成紅色1.1 材料醌亞胺類化合物(最大吸收峰322nm和1.1.1 酶試劑:醇氧化酶( Biozyme Laborato-508nm)_醌亞胺類溶液的顏色深淺在一定范ries )1200IU過氧化氫酶(_上海生工)12001U ,圍內(nèi)與甲醇濃度成正比,可用分光光度法定4一氨基安替比林30mg ,疊氮鈉100mg ,用量(圖1)AOX(1)R-CH2-OH +O; +H20R-CHO + H2OzCH,"C=C . NHzCH3-C=C-N=>=02H202+ CH,-N C=0+0HCTR. CH,-N G=0+ 4H,O (2)醌亞胺(紅色)收稿日期2000-11-15)男副研究員碩士從事生作者簡介黃秀車19-物技術研發(fā)五悄數(shù)據(jù)24生物技術第11卷第2期1.2.2標準曲線:A0X-CTR法分別測定蒸用1%(v/v)甲醇發(fā)酵液作標準溶液。取誘餾水及發(fā)酵液中甲醇濃度,研究本方法的可導階段的發(fā)酵液,離心收集上清。按1.2.2行性。按下表中步驟加樣,混勻,37C水浴方法中所述方法進行測定其相應的Aso值,20min 508nm波長測比色繪制標準曲線。按如下公式計算:待測發(fā)酵液中甲醇濃度%( v/v )=待測樣As08/1%甲醇標準液As08 x0.181.0%。0.150.123討論專0.09醇氧化酶( AOX )屬黃素氧化酶類,俗稱0.06●水溶液乙醇氧化酶,FAD是它的輔助因子。該酶能發(fā)酵液0.03以一系列低級醇、不飽和醇為底物但對支鏈0.00醇及多元醇不起作用。( 1 )中的R - CH2OH0 123456789101112可以是甲醇、乙醇、丙醇等,但是以催化甲醇甲醇濃度(%,VIN)的效率最高。( 2 )中的過氧化氫酶也可用過氧化物酶( Peroxidase ,POD )來代替,雖然特異圖1水溶液和發(fā)醇液中甲醇濃度 與醌亞胺類Asxg吸收值關系性略有改變,但對測定影響不明顯。在甲醇曲線酵母發(fā)酵過程中使用的是工業(yè)級的甲醇發(fā)加入物ml)空白管待測甲醇酵中最關鍵的是甲醇等誘導物的濃度控制,標準溶液即使含有雜醇，這些雜醇大都可以起誘導作用所以測到的雖然不是甲醇的精確量但基蒸餾水/未誘導時發(fā)醇上清液0.02本上可反映誘導物的實際濃度。從濃度-吸甲醇標準液% w/v)光度曲線可知發(fā)酵液中的其他成分不對測定工作液3.0. 1.2.3 甲醇濃度的實際測定:取發(fā)酵液離結果產(chǎn)生顯著影響。心收集上清用于測定按下表加樣，方法同發(fā)酵時誘導階段甲醇的最適濃度隨工程菌而異,一般在0.5%_ ~ 3%之間,這正是1.2.2。AOX-CTR法測定的理想范圍。需說明的甲醇標準溶液待測是,AOX-CTR測得是以甲醇為主的低級醇加入物ml )空白管( 未誘導發(fā)酵液加甲醇至1% )濃度不是甲醇的濃度,它不能取代目前測甲醇濃度的氣相色譜法和亞硫酸品紅比色法。未誘導時的發(fā)酵上清液0.02附醇氧化酶的制備及活力單位( I∪)標甲醇標準液1% w/v) /定醇氧化酶是甲醇酵母等微生物在以甲醇待測發(fā)醇液/為唯一碳源時大量合成的一種酶,Pichia pas-0.3toris.酵母產(chǎn)生的醇氧化酶在該空間結構上有缺陷所以活力較低( 6IU/mg~ 10 IU/mg酶蛋2.結果白),它是以大量合成該酶來實現(xiàn)對甲醇的大量利用的。如果不能購買到商品化的該酶,2.1標準 曲線可以嘗試從GS115 Mut+型工程菌或宿主菌根據(jù)散點圖選擇甲醇濃度為0.5% ~誘導后的菌體中大量提取AOX這種自提取5%的范圍的6組數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。的AOX可用于本方法,同購買Biozyme的甲醇水溶液組iy =0.0195x + 0.0036 r=AOX沒有明顯差別。具體提取及活力標定0.990 p<0.001 ;方法可參考美國專利(專利號:4430427、甲醇發(fā)酵液組y =0.0328x + 0.0049 r=4540668、4619898、4956290 )0.987 p<0.001。參考文獻:;代表甲醇體積百分比濃度值(% ,v/[1羅平.飲料分析與檢驗[M]北京:中國輕工業(yè)出版社,v),y代表對應的Aso值。1992 ,101- 103從.上面的吸收曲線上可見,甲醇濃度在[2于海波劉慶河都波.酒類、飲料、食品及其原料分析0.5% ~ 5%的范圍內(nèi),本法測定的線性關系方法注解M].北京:輕工業(yè)標準出版委員會,1991 ,78 .良好，,由反應終產(chǎn)物醌類的量可對樣品(水溶[3安乙敏主編.生化檢驗學[ M]成都:四川科學技術出液或發(fā)酵液)中甲醇濃度進行準確測定發(fā)酵版社 ,1990 68-72.液中的其他成分對該方法的測定不構成顯著[ 4 ]Hopkins. Red absorbing combination of alcohol oxidase and anazide compounC P ] United States Patent 4430427. 1984- 02影響。-07.2.2誘導階段發(fā)酵液中甲醇濃度的測定及[5 ]Hopkins. Alohol oxidase from Pichia - type yeastC P ]. United計算States Patent 4540668. 1985- 09- 10.[6 ]HoAlcohol oxidase from Pichia - type yeast:[ P ]. United用誘導煎的發(fā)酵液上清液作空白對照并JHopkinsStates Patent 4619898. 1986- 10- 28.[ 7 ]Harrison Jr ,et al . Large scale process for the purifiction of al-第11卷第2期生物技術Vol.11 ,No.22001年4月BIOTECHNOLOGYApr 2001colhol oxidase[ P ]. United States Patent 24956290. 1990-09 -Colorimetric assay of methanol in fermentation broth of Pichia pastorisHUANG Xiu- dong' ,YANG Hong- ZHANG Gao- xial LI Shu- gang' ,YU Ting- he'( 1. Chongqing Rain Biotech Institute Chongqing 400060 2. Bioengineering Institute ofChongqing University ,Chongqing 400044 3. Institute of Utrasound Engineering inMedicine Chongqing Medical University Chongqing 400016 )Abstract :It was very important to control methanol concentration in broth of Pichia pastoris ,which iscomplicated and incessant changed. A colorimtric assay was established in this study based upon com-bined catalysis of alcohol oxidase and catalase . The results showed linear relationship was excellent within0.5% ~5% .It was an acceptable method and could determine methanol concentration rapidly .Key words :fermentation ; Pichia pastoris ;methanol alcohol oxidase中圖分類號564文獻標識碼A文章編號:1004- 311X( 2001 )02- 0025 -03維生素C二步發(fā)酵的新組合菌系仲崇斌! ,于海2呂主奎2馮樹1張忠澤'( 1.中科院沈陽應用生態(tài)所遼寧沈陽110015 2.東北制藥總廠遼寧沈陽110026)要_:以擲孢酵母作為伴生菌與氧化葡萄糖酸桿菌組成新混菌體系對其產(chǎn)酸性能和特點進行了研究。實驗室搖瓶結果顯示新菌系混菌狀態(tài)不同產(chǎn)酸不同，以KGA含量為4.8小菌/擲孢酵母為31:1種液接種時最有利于產(chǎn)酸增加接種生物量可提高產(chǎn)酸速度縮短發(fā)酵周期,但不影響最終產(chǎn)酸量。相同條件下新菌系產(chǎn)酸能力高于現(xiàn)有菌系酸量增加5mg/ml~7mg/ml發(fā)酵周期縮短6h~8h酸轉化率提高3%~4%最高產(chǎn)酸點pH值下降約0.5表現(xiàn)出較大的產(chǎn)酸潛力和可修飾性。關鍵詞:VC二步發(fā)酵2-酮基- L-古龍酸擲孢酵母氧化葡萄糖酸桿菌維生素QVc)二步發(fā)酵的第二步為混菌1.2培養(yǎng)基:采用擲孢酵母、氧化葡萄糖酸發(fā)酵使L-山梨糖合成Vc前體2-酮基- L桿菌及巨大芽孢桿菌適合培養(yǎng)基{3]。一古龍酸(KGA)最初篩選的混菌體系為氧1.3 分析方法化葡萄糖酸桿菌與條紋假單孢桿菌的組合,1.3.1生長曲線的測定光密度法(4]。前者為產(chǎn)酸菌(俗稱小菌)后者不產(chǎn)酸,但可1.3.2 2-酮基-L-古龍酸含量的測定:碘促進前者產(chǎn)酸，也稱伴生菌寧文珠以巨大量法[5]。芽孢桿菌代替條紋假單孢桿菌獲得成功后1.3.2 殘?zhí)堑臏y定蒽酮試劑法(6。經(jīng)不斷改進,目前生產(chǎn)上大多使用的混菌體系為巨大芽孢桿菌和小菌的組合,使糖酸轉2結 果與討論化率已由最初的39.7%(糖濃度7% ,6d )提高到79.5%[2。本文以擲孢酵母為伴生菌2.1新組合菌系產(chǎn)酸性能和特點與小菌組成新菌系具有較強的抗酸能力酸將擲孢酵母與小菌按適當比例混合接轉化率提高發(fā)酵周期縮短表現(xiàn)出較大的產(chǎn)種28°振蕩( 180r/min 培養(yǎng)_每4h取樣測定酸潛力和可修飾性。菌濃、酸量、殘?zhí)呛蚿H值,得新菌系混菌生長代謝曲線(圖1》_由圖可見接種后二菌1材料與方法均有一個適應期發(fā)酵前20h內(nèi),KGA合成較慢_相應的L-山梨糖下降速度也很慢這時1.1 菌株，擲孢酵母( Sporoblomyces roseus ),二菌均處于適應期和指數(shù)前期;發(fā)酵20h后,1.1.1L-山梨糖下降速度加快,KGA的積累速度Y44,由中科院生態(tài)研究所菌種室提供。也加快這時小菌處于指數(shù)期;64h 左右兒二1.1.2 巨大芽孢桿菌( Bacillus megaterium )山梨糖濃度降到最低水平,KGA積累量達最和氧化葡萄酸桿菌( Gluconobacter oxydans ),高,以后合成速度變慢基本趨于停滯。發(fā)酵2980 ,由東北制藥總廠提供。過程中pH值由開始的6.5升到7.8左右隨KGA的大量產(chǎn)生,pH值又開始下降,直至收稿日期2000- 08 - 05 ;修回日期2001-03-085.4左右。作者簡介仲崇斌9每一),女，講師碩士現(xiàn)在沈陽農(nóng)將新組合菌系與現(xiàn)有菌系發(fā)酵特性進行業(yè)大學生物科技學院師事生物技術研究。