第62卷第10期化工學報VoL. 62 No 102011年10月CIESC JournalOctober 2011研究論文聚乙二醇修飾重組人干擾素o的過程優(yōu)化潘紅春,劉紅,程永剛2,彭力2,徐波2,楊紅濤2(西南大學藥學院,重慶400716;2太極集團西南藥業(yè)股份有限公司,重慶400038)摘要:采用分子量20000直鏈單甲氧基PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯( mPEG-SS)對畢赤酵母表達的重組人干擾素( rhINO)進行氨基化學修飾,以期獲得抗原性降低及穩(wěn)定性增加的單鏈PEG修飾產(chǎn)物( PEG-rhIFNo)。建立了PEG修飾 rhIFNω的反應體系,考察了修飾反應各因素對單修飾產(chǎn)物得率的影響,優(yōu)化修飾工藝條件為:反應體系起始pH值8.5,rhFN/PEG摩爾比1:7, rhINO濃度0.75mg·m2,磷酸鹽緩沖液濃度50mmol·L-,于25℃振蕩反應4h,用30%冰醋酸終止反應。在優(yōu)化條件下,單鏈 PEG-rhIFNo含量和修飾率分別達到0.25mg·ml-·和34.63%。純化后的單鏈 PEG-rhIFNo具有典型PEG修飾蛋白的特性,體外抗病毒活性保留了天然 rhINO抗病毒活性的15%。關(guān)鍵詞:重組人干擾素ω;聚乙二醇;過程優(yōu)化;抗病毒活性DoI:10.3969/j.issn0438-1157.2011.10.028中圖分類號:TQ031.2;TQ021.8文獻標志碼:A文章編號:0438-1157(2011)10-2876-09Processing parameters optimization of pegylation ofrecombinant human interferon omegaPAN Hongchun', LIU Hong, CHENG Yonggang, PENG Li, XU Bo, YANG HongtaoSchool of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, ChinaSouthwest Pharmaceuticals Company Limited liability, Taiji Group, Chongqing 400038, China)Abstract: In order to reduce the antigenicity and enhance the stability of the recombinant human interferonomega (rhIFNo) expressed in Pichia pastoris, the amino group modification of rhIFNw with mono-methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate (mPEG-SS, 20000)was investigated. It was foundthat the optimized reaction conditions for the highest modification yield of mono PEG-rhIFNw were asfollows: in 50 mmol I and pH 8. 5 phosphate buffer, concentration of rhIFNo 0 75 mg. ml-, molarratio of rhIFNo to Peg 1:7, and reaction time 4 h at 25C. Under the optimized conditions, the contentand modification yield of mono PEGrhIFNo reached 0. 25 mg.ml-I and 34. 63%, respectively. Thepurified PEG-rhlFNw had the characteristics of typical PEGylated protein. The experiments showed thatthe antiviral activity of prepared PEG-rhIFN could retain about 15% of the antiviral activity of the nativerhINOKey words: recombinant human interferon omega (rhIFN); PEGylation; process optimization; antiviralactivity2011-01-07收到初稿,2011-05-29收到修改稿。聯(lián)系人:劉紅。第一作者:潘紅春(I966-),女,博士,教中國煤化工6.cm授級高級工程師CNMHG第10期潘紅春等:聚乙二醇修飾重組人干擾素c的過程優(yōu)化·2877·引言二極管陣列檢測器, SHIMADZU2410紫外分光光度計, Phast- System全自動水平電泳儀,Bio重組人干擾素a( recombinant human inter- Rad680型酶標儀feron omega, rhINO)是一種多功能細胞因子hINO原液,由畢赤酵母表達,純度大于它可在細胞表面與特殊受體結(jié)合而發(fā)揮抗病毒、抗98%,抗病毒活性1.81×10IU·ml-1,比活性細胞增殖口和免疫調(diào)節(jié)作用2,尤其對肝炎病882×107IU·(mg蛋白)-1,西南藥業(yè)股份有限毒、SARA病毒、多種腫瘤細胞∽有很強的抑制公司提供;單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯作用,臨床上有望開發(fā)成一種有效的抗病毒抗腫瘤 mPEG-SS),直鏈,分子量20000±3000,純度藥物。然而, rhINO依然存在天然蛋白藥物的體98%, Sigma公司出品。單鏈 PEG-rhIFNo原液內(nèi)半衰期短、免疫原性強等諸多不足,使其應用開純度大于98%,抗病毒活性2.79×10°IU·ml-,發(fā)速度受限。目前,有關(guān)克服 rhIFN局限性的研比活性1.51×10uU·(mg蛋白)1,本所自制;究報道較少,僅有美國 Intarcia Therapeutics公司 rhINO標準品,CHO表達,購于WHO,編號為利用 DUROSO微滲透泵技術(shù)實現(xiàn)了 rhINO的皮94/754,活性單位200001U·安瓿-。下脈沖緩釋給藥51.2 rhINo的PEG修飾和純化聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG)化學將適量純度98% rhINO原液加入到一定pH修飾技術(shù)已成為改善蛋白質(zhì)、多肽、抗體、值和濃度的磷酸緩沖液中,使 rhINO達到需要的基因治療等藥物臨床療效的重要手段,在提高藥濃度,按照預先確定的 rhINO/PEG摩爾比加入物穩(wěn)定性、延長半衰期、降低免疫原性、提高藥物PEG,混合均勻后于一定溫度下、200r·min-振水溶性等方面具有廣闊的應用前景。迄今,至少已蕩反應確定時間,然后加入適量30%冰醋酸溶液有8種PEG修飾的蛋白和多肽類藥物被批準應用終止反應。利用 Sepharose離子交換層析和 Super于臨床疾病治療,且有更多正在經(jīng)歷臨床實驗。dexG凝膠過濾層析組合,先除去 rhINO,再除PEG修飾蛋白分子是一個極其復雜的過程,修飾去多鏈 PEG-rhIFNo副產(chǎn)物。效果受到諸多因素的影響,如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、修飾方1.3PEG修飾 rhINO過程中pH值變化自動監(jiān)式、PEG分子結(jié)構(gòu)、分子量大小、修飾條件等。測和控制近年來,PEG修飾技術(shù)呈現(xiàn)出一些新趨勢0,已將pH電極置入放大反應體系中,用能自動監(jiān)開發(fā)出許多針對某些氨基酸側(cè)鏈或末端氨基進行選測和控制pH值的發(fā)酵控制系統(tǒng)自動監(jiān)測反應體系擇性修飾的修飾劑。pH值變化,從而獲得PEG修飾 rhIFNω過程的本文作者針對 rhiNO蛋白分子中游離賴氨酸pH值變化曲線。通過該控制系統(tǒng),用酸堿溶液控側(cè)鏈e氨基和N末端氨基,用分子量20000的直制反應體系pH值在需要范圍內(nèi),以促進PEG化鏈單甲氧PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯( mono-me學修飾反應進行thoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate,1.4 PEG-rhIFN含量測定mPEG-SS)對 rhiNo分子中的游離氨基進行選擇采用 RP-HPLO法同時測定反應混合液中單鏈性化學修飾,以期獲得高單鏈PEG修飾率和少位 PEG-rhIFNo和殘留 rhIFNω含量。色譜柱為Wa-置異構(gòu)體。通過PEG修飾條件優(yōu)化、分離純化、ters公司 Symmetry300c4反相柱(250mm結(jié)構(gòu)表征、位置異構(gòu)體、理化性質(zhì)等研究,發(fā)現(xiàn)純4.6mm,30nm,5μm),流動相A為水:TFA=化的單鏈 PEG-rhlFNo僅含2種位置異構(gòu)體。本990:10(pH2.2),流動相B為100%乙氰,流速文將著重報道PEG修飾 rhINO過程中各修飾條為1.0ml·min-。線性梯度洗脫和等度洗脫相結(jié)件優(yōu)化的研究結(jié)果以及單鏈PEG化 rhINE合,流動相用前均經(jīng)0.45μm尼龍膜過濾、脫氣,( PEGrhIFNo)的體外抗病毒活性。檢測波長280nm,柱溫30℃,每次進樣301實驗1.5PEG修飾塞的計篁根據(jù)反中國煤化工量和反應初始1.1儀器與試劑體系 rhIFNCNMHGIEN修飾率,Waters2695高效液相色譜儀, Waters2996其中包括單鏈PEG修飾和多鏈PEG修飾產(chǎn)物。計2878·化工學報第62卷算公式為體系殘留總PEG修飾率一換算后反應體系初始濃度濃度x100mPEG-O--C-HC-CH+rhINO(1)mPEG-succimimidyl succinate根據(jù)單鏈 PEG-rhiFNa含量和反應初始體系incubatehINO含量,計算單鏈 PEG-rhIFNo修飾率,計算公式為單鏈PG修飾率=反應體系單鏈 PEG-rhIFNomPEG-O—C-H2C-CH2C-HN一thNa+OHPEGylated rhIFNoo(2)圖1PEG修飾 rhINO的化學反應式1.6抗病毒活性測定Fig 1 Reaction scheme of synthesis of PEGylated參照2010年版中國藥典三部附錄XC“干擾recombinant human interferon omega (rhIFN)素生物學活性測定”中WISH細胞法測定,結(jié)果(A linear polyethylene glycol(PEG)-succinimidyl用IFNa標準品進行校正。succinate yields an amide linkage withar or e-amino group of rhIFNo)2結(jié)果與討論確定單鏈 PEG-rhIFNa僅包含2個位置異構(gòu)體21 mPEG-SS選擇性修飾 rhiNO的或g氨基推斷單鏈 PEG-rhIFNa的修飾位點為Lys(33)或人干擾素ω一級結(jié)構(gòu)中賴氨酸含量較少,僅Lys(167)和Lys(46)或Lys(52)或Lys(152)第33、46、52、134、136、137、152和167位為2.2pH值對PEG修飾 rhIFN的影響賴氨酸,且第3位半胱氨酸(Cys)與第101位用25 mmol. L-1Na2HPO4-KH2PO4緩沖液Cys以及第31位Cys與第141位Cys殘基結(jié)合形調(diào)節(jié)反應體系寬起始pH值4.0~10.0及窄起始成2個二硫鍵1,因此, rhINO分子的N末端pH值7.30~8.70進行實驗,維持反應體系a氨基及部分賴氨酸側(cè)鏈c氨基不易暴露,用rhNa濃度05mg·ml1, rhINO/PEG摩爾比mPEG-SS針對游離氨基進行選擇性化學修飾,有1:7,溫度25℃,搖床轉(zhuǎn)速200r·min-1,總體望減少單鏈 PEG-rhIFNo位置異構(gòu)體的形成。其積0.5ml。反應4h后各加20pl30%冰醋酸溶液化學反應式見圖1。通過對純化的單鏈PEG結(jié)束反應,用HPLC測定單鏈 PEG-rhIFNo含量,rhINO進行毛細管電泳、等電點和肽圖分析,可結(jié)果見圖2。01670.05000.140.110.I240.000.10100initial pH value中國煤化工CNMHG圖2起始pH值對單鏈 PEG-rhIFN含量的耳Fig 2 Influences of initial pH value on PEG-rhIFN content第10期潘紅春等:聚乙二醇修飾重組人干擾素的過程優(yōu)化·2879·圖2(a)結(jié)果表明,反應體系起始pH值低于飾率和濃度,并可使 rhINO得到充分利用,但因6.0時,PEG修飾 rhIFNω的反應不發(fā)生,起始PEG修飾劑價格昂貴,為 PEG-rhIFNo主要成本pH值8.0~9.0時,有利于PEG修飾 rhINO,來源,故PEG修飾工藝研究過程更應重點考慮單鏈 PEG-rhIFNo濃度達到0.11~0.12mg·PEG修飾劑的充分利用。此外,SDS凝膠電泳圖ml1,總修飾率為47%~50%,單鏈PEG譜顯示, rhINO/PEG摩爾比達到1:10,多鏈rhIFNω修飾率最高可達25.17%。圖2(b)結(jié)果表 PEG-rhIFNω條帶顯著增強。因此,綜合考慮修飾明,PEG修飾 rhINO反應進行的最適合起始pH率、修飾劑成本以及分離純化成本,選擇 rhINO/值為834,此時,單鏈 PEG-rhIFNo濃度為0.112PEG摩爾比為1:5進行下面的研究。mg·ml-,總修飾率為55.7%,單鏈PEG2.4反應時間對PEG修飾rhFN的影響rhINO修飾率達23.40%。因此,控制反應體系控制起始pH8.3, rhINO/PEG摩爾比1的起始pH值8.0~8.5為宜。反應pH值是PEG5,其他反應條件不變,研究反應時間對PEG修飾化蛋白的最重要影響因素之一,除影響修飾反應速 rhINO的影響。分別于反應1、2、3、4和6h時率外12],還影響修飾位點的專一性,導致單鏈取樣測定單鏈 PEG-rhIFNo的含量,結(jié)果見圖4PEG蛋白位置異構(gòu)體比例的變化1]。隨著反應時間延長,單鏈 PEG-rhIFNa含量逐漸23 rhINO/PEG摩爾比對PEG修飾hNo的影響增加;當反應時間達到4h時,單鏈 PEG-rhIFNo控制反應體系 rhINO/PG摩爾比為1:1、含量達到最高為0.100mng·ml,單鏈PEG1:5、1:10、1:15和1:20,起始pH為83,hFNa修飾率和總修飾率分別為20.77%和其他反應條件同上,結(jié)果示于圖3,由圖可知,35.80%6。因此,PEG修飾 rhINO的反應時間以rhINO/PEG摩爾比為1:15時,反應液中單鏈4h為宜。PEG-rhIFNo含量最高達0.173mg·ml-,單鏈25磷酸緩沖液濃度對PEG修飾 rhIFNoo的影響PEG-rhIFNa修飾率最高達35.94%; rhINO/控制起始pH8.3, rhINO/PEG摩爾比1:PEG摩爾比為1:20時,單鏈 PEG-rhIFNω修飾5,反應時間4h,其他反應條件不變,研究磷酸率下降,而總修飾率達到最大為90.8%緩沖液濃度對PEG修飾 rhINO的影響。分別控PEG修飾蛋白藥物過程中,蛋白/PEG摩爾比制磷酸緩沖液濃度為12.5、25、50、100和200的選擇因蛋白種類、PEG種類、修飾位點等而各mmol·L,測定單鏈 PEG-rhIFN含量,結(jié)果不同1,范圍在(1:1)~(1:250)。高見圖5。隨著磷酸緩沖液濃度的增加,單鏈PEQGrhINO/PEG摩爾比雖有高單鏈 PEG-rhIFNo修r(nóng)hIFNω含量呈逐漸降低趨勢,但磷酸緩沖液濃度不宜太低,以25~50mmol·L為宜。因此,選0.180.l6700E0.14E0.1230.0008200402201:1ThIFNo/PEG molar ratio0040圖3 rhINO/PEG摩爾比對 PEGrhIFNu含量的影響Fig 3 Influences of rhIFNo/PEG molar ratioTYHCNWIHGon PEgrhIFNo contentFig 4 Influences of reaction time on PEG-rhIFNw content·2880·化工學報第62卷0.15045140.135008030言0.250.12020.l0.10010008rhIFNe concentration/mgml"buffer concentration/mmol L圖6 rhIFN濃度對 PEG-rhIFNo含量的影響圖5緩沖液濃度對 PEG-rhIFNy含量的影響Fig 6 Influences of rhIFNo concentrationFig 5 Influences of buffer concentrationon PegrhIFNo contenton PEgrhIFNo contenth,反應總體積0.5ml,反應振蕩轉(zhuǎn)速200r擇磷酸緩沖液濃度25mmol·L進行下面的min-1,反應終止液30%冰醋酸20μl。確定表1研究。所示的各因素和水平,選用表2所示的L(34)2.6 rhINO濃度對PEG修飾 rhINO的影響正交表安排實驗,共進行9組實驗,每組3個平行控制磷酸緩沖液濃度25mmol·Ll,起始樣,實驗結(jié)果取其平均值,以單鏈 PEG-rhIFNωpH8.3, rhINO/PEG摩爾比1:5,反應時間4和殘留 rhIFNω含量為測定指標,以單鏈PEGh,其他反應條件不變,研究 rhINO濃度對 Peg rhINO修飾率為評價指標。正交實驗結(jié)果見表2。修飾 rhINO的影響。分別控制 rhINO濃度為衰1正交實驗各因素和水平0.125、0.25、0.5、1和2mg·ml-1,測定單鏈Table 1 Factor and level of orthogonal desigPEG-rhIFNo含量,結(jié)果見圖6。隨著 rhINO濃Factor度的增加,體系中PEG濃度也按摩爾比1:5同比Initial ph Molar ratiohIFNBuffer增加,致使反應體系中單鏈 PEG-rhIFNo和多鏈value of rhIFNo/ concentration concentrationPEG(B) /mgml-1() /molL-(D)PEG-rhIFNo均隨 rhINO濃度增加而增加。當0.500.03rhINO濃度為2mg·ml-1時,體系中單鏈PEGhINO濃度可達0.422mg·ml-1。修飾率計算結(jié)果顯示,單鏈 PEG-rhIFNa修飾率隨 rhINO濃度直觀分析上述實驗結(jié)果,各因素和水平對應的增加的變化幅度不大,而總修飾率呈現(xiàn)先逐漸增K、k和極差R值見表2。比較各因素極差R值大加,后降低并趨于穩(wěn)定的變化趨勢,當 rhINO濃小,確定各因素主次順序為B>C>D>A。因素A度為0.5mg·ml-時,總修飾率為最高達對單鏈 PEG-rhiFNo修飾率影響小,且適當提高74.24%。因此,綜合考慮,選擇 rhIFN濃度為體系pH值有利于加快反應速度,選取A3;因素0.5mg·ml-較適宜。C的水平2和水平3差別不大,且 rhINO濃度越2.7PEG修飾 rhINO的正交實驗高副產(chǎn)物多鏈 PEG-rhIFN生成越多,選取C2;根據(jù)上述各單因素對PEG修飾的影響程度,對于因素B,雖然 rhINO/PEG摩爾比1:7可能選取起始pH值、 rhINO/PEG摩爾比、磷酸緩沖偏小,但綜修飾秈的成本和利用率,液濃度和反應體系 rhINO濃度4個因素進行正交不再進行更中國煤化工選取B3。確實驗,以考察各因素相互變化的綜合效果。其他實定優(yōu)化SHaCNMHG工藝條件驗條件分別為:控制反應溫度25℃,反應時間4為B3C2D2A3第10期潘紅春等:聚乙二醇修飾重組人干擾素a的過程優(yōu)化2881·表2L(3)正交實驗設(shè)計與結(jié)果衰3驗證實驗結(jié)果Table 2 Arrangement and results of L,(3)Table 3 Results of verification experimentorthogonal experimentby HPLC determinationPEG-rhIFN,PEGylation rate/%FactorExperimentrate of monomonoPEG (mono+ poly)PEG-rhIFNong. mrhIFNo PEG-rhIFNoABCDoptimized experiment0.24614.75No. 3 experiment0.22431.0459.382345671112223333.01修飾 rhINO均可獲得良好的修飾效果,前者略優(yōu)1233122于后者,前者可使反應液中單鏈 PEG-rhIFN含27.0830.73量達到0246mg·ml-1,單鏈 PEG-rhIFNo修飾22.12率達到34.17%,總修飾率為6203%。正交實驗優(yōu)化的PEG修飾條件可用于后續(xù)研究和放大研究89KKK32.182.8溫度對PEG修飾 rhINO的影響78.9853.6665.9274.0174.6078.7480.1984.07在上述優(yōu)化實驗條件下,選擇5℃、25℃和74.7495.9282.2170.2440℃進行PEG修飾 rhinO的溫度實驗,反應中k26.32717.88721.97324.670定時取樣測定,結(jié)果見圖8。溫度顯著影響PEGk224.86726.24726.73028.023k324.91331.97327.40323.413修飾 rhIFNω的速率,溫度越高反應速度越快。1.46014.0865.4304.6105℃下,3h前單鏈 PEG-rhIFNo含量隨反應時間延長而快速增加,3h后則緩慢增加;3h和24h確定PEG修飾 rhINO反應體系的優(yōu)化條件單鏈 PEG-rhIFNo的含量分別為0.157mg·ml-1為:起始pH值8.5, rhIFN/PEG摩爾比1:7和0.24mg·ml1,修飾率分別為21.81%和rhINO濃度0.75mg:ml,磷酸緩沖液濃度5031.06%25℃和40℃下,3~4h時單鏈PEGmmol·L',溫度235℃,反應時間4h,反應總體 rhIFNω含量達到最大,隨后呈緩慢降低趨勢;單積05ml,反應振蕩轉(zhuǎn)速200r,min,30%冰鏈 PEG-rhIFN含量最大值分別為0.227mg醋酸反應終止液20lml-1(4h)和0.260mg·ml(3h),修飾率最大用正交實驗優(yōu)化的PEG修飾hFNa反應條值分別為31.56%(4h)和36.17%(3h)。件和正交實驗結(jié)果最好的3號實驗組條件進行驗證SDS凝膠電泳分析結(jié)果表明,溫度越高反應實驗,各組實驗3個平行樣,單鏈 PEG-rhIFNo速度越快,單鏈 PEG-rhIFNo含量越高,然而多含量和修飾率以及總修飾率結(jié)果見表3,SDS凝膠聚 PEGrhIFNo副產(chǎn)物也會隨之增加,同時蛋白電泳圖譜見圖7。在優(yōu)化和3號實驗條件下,PEG藥物也會失去更多生物活性,甚至使目標產(chǎn)物失去marker030poly- PEG-thIFNe40℃830×103620×103mono- PEG· rhINO25℃020475×103325×1030.10250×103hINO0圖7驗證實驗 SDS-PAGE分析中國煤化工Fig 7 SDS-PAGE analysis of verification experimentIuCNMH影響1--optimized experiment: 2-No. 3 experimentFig 8 Influences of temperature on PEG-rhIFNo content·2882·化工學報第62卷應用價值。 rhINO的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果表明,放大實驗,考察修飾工藝的可放大性,便于純化工40℃下熱穩(wěn)定性較差,25℃下熱穩(wěn)定性相對較好,藝、質(zhì)控方法和質(zhì)量標準、單鏈 PEG-rhIFNo特低溫下熱穩(wěn)定性最好。綜合考慮PEG修飾反應速性等研究工作的開展。按每批100 mg Peg修飾劑度、 rhIFNω熱穩(wěn)定性、大生產(chǎn)可操作性等因素,進行0801、0802和0803三批放大實驗研究。表選擇PEG修飾 rhINO的適宜溫度為25℃。結(jié)果表明,獲得的優(yōu)化修飾工藝條件具有很好的穩(wěn)2.9PEG修飾 rhINO反應過程的pH變化和控制定性和可操作性。三批放大實驗的平均單鏈PEGPEG修飾 rhINO會使反應體系的pH降低。 rhINO含量、單鏈 PEG-rhIFNo修飾率和總修飾用全自動發(fā)酵罐pH自動控制系統(tǒng)監(jiān)測PEG修飾率分別為0.25mg·m1-1、34.63%和69.20%。hIFN反應過程的體系pH發(fā)現(xiàn),起始pH8.5的張琛等u1利用單甲氧基聚乙二醇(mPEG)化學修飾反應體系,反應1h后體系pH降至8.2,2h修飾中性蛋白酶的總修飾率為41.7%,楊宇峰后體系pH穩(wěn)定至8.1左右。結(jié)合圖4分析,盡管等用單甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亞胺(SPA反應體系pH降低很快,但修飾反應仍在繼續(xù),單mPEG2000修飾重組人于擾素alb的單點修飾鏈 PEG-rhIFNo濃度和修飾率逐漸增加,直到4h率為33%。因此,本研究結(jié)果已達到并超過文獻時達到最高。報道的結(jié)果。針對上述問題,利用該pH自動控制流加酸堿表4放大實驗結(jié)果體系,開展PEG修飾 rhINO反應體系pH的過Table 4 Resalts of amplification experiments程控制研究,控制反應過程體系pH維持8.5PEG-rhIFNo(8.4~8.6),每半小時取樣測定,結(jié)果見圖9。1mono-PEG (mono+h內(nèi)單鏈 PEG-rhIFNo含量達最大,隨后呈逐漸降rhINOPEG-rhIFNoo低趨勢;SDS凝膠電泳分析結(jié)果顯示,1h后多鏈0.25269.1508020.23532.6470.02PEG-rhIFNω呈逐漸增多趨勢0.26168.440.18日0162. 11 PEG-rhIFNo的抗病毒活性測定0801、0802和0803三批 PEG-rhIFNo原管8品色0.14液的抗病毒活性和蛋白濃度,計算出比活和比活殘留率,見表5。 PEG-rhIFNo原液的比活均大于0.I01.00×10IU·(mg蛋白)-1,與 rhINO的比活8.82×10IU·(mg蛋白)1比較, PEG-rhIFNa008的比活有較大幅度降低,約保留 rhINO比活的0060354015%左右。PEG修飾蛋白主要考慮修飾物在體內(nèi)reaction time/h外殘留生物活性和腎臟清除率兩個因素,佩樂能圖9控制pH8.5時 PEG-rhIFN含量的變化Fig 9 Change of PEG-rhIFNa content at pH 8. 5表5 PEG-rhIFNoo原液的蛋白質(zhì)含量、抗病毒活性和比活Table 5 Protein concentration antiviral and實驗結(jié)果表明,控制反應過程體系pH8.5有specific activities of PEG-rhlFNo利于修飾反應啟動,但不利于單鏈 PEG-rhIFNo穩(wěn)定,有助于多鏈 PEG-rhIFNo生成。有關(guān)反應AntiviralProteinactivityBatch No, activity concentrationactivitypH值過程的研究還需要更加深入細致,但圖9結(jié)/ug.mI-I /IUmg-1 residue果已預示,要獲得更高單鏈 Peg-rhIFNa含量和protein level@/%08012.79×101.51×10717.12修飾率,可控制反應體系略低pH或分階段控制不08022.37×105173l.37×107同pH,同時,反應體系放大時應加強反應pH值08032.82×101.49X10的過程控制。(IU·m-1)/prot2.10PEG修飾 rhINO的放大實驗residue level(%)H中國煤化工 antiviral activityCNMHSpecific activitspecific activty對優(yōu)化和驗證的PEG修飾 rhINO工藝進行 of rhIFN×100%潘紅春等:聚乙二醇修飾重組人干擾素a的過程優(yōu)化883( PEGIFNo2b,12000直鏈)和派羅欣(PEGproteins at consistent rate continuously for 3 to 12 monthsIFNa2a,4000支鏈)上市以來取得的喜人臨床U]. Journal of Diabetes Science and Technology, 2008. 2(3):461-467應用效果,說明修飾物體外生物活性的保留程度并[6] Jevsevar S, Kunstel] M, Porekar V G. PEGylation of不與體內(nèi)療效有直接的對應關(guān)系,還與腎臟清隙率therapeutic proteins [J]. Biotechnology Journal, 2010,5有關(guān)。佩樂能和派羅欣的體外抗病毒活性僅分別保(1):113-128留天然蛋白的28%1和7%。[7] Pasut G, Veronese F M PEGylation for improving the[].3結(jié)論(Barc),2009,45(9):687-695[8] Lu Y, Harding S E, Turner A, Smith B, Athwal D S,針對 rhINO的賴氨酸c氨基和N末端氨基,Grossmann J G, Davis KG, Rowe A J. Effect of PEGylation用直鏈琥珀酸琥珀酰亞胺酯類mPEG進行選擇性on the solution conformation of antibody fragments [J].化學修飾。研究了反應體系起始pH值、 rhINO/Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 97(6):PEG摩爾比、 rhINO濃度、緩沖液濃度、溫度等20622079對PEG修飾 rhINO的影響,并用通過正交實驗[9] Eto Y, Yoshioka Y, Ishida T, Yao X, Morishige T,Narimatsu s, Mizuguchi H, Mukai Y, Okada N, Kiwada優(yōu)化了PEG修飾 rhINO過程的反應條件,通過H, Nakagawa S Optimized PEGylated adenovirus vector因素實驗和正交實驗優(yōu)化了PEG修飾 rhINO的reduces the anti-vector humoral immune response against條件,控制反應體系起始pH值8.5、 rhINO/adenovirus and induces a therapeutic effect againstPEG摩爾比1:7、 rhiNO濃度0.75mg:ml和metastatic lung cancer [J]. Biological Pharmaceutical磷酸緩沖液濃度50mmol·L1,于25℃振蕩反應Bulletin,2010,33(9):1540-1544[10] Hu J, Duppatla V, Harth S, Schmitz W, Sebald WSite-4h,用30%冰醋酸終止反應,可使反應體系中單specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2鏈 PEG-rhIFN含量、單鏈 PEG-rhIFNa修飾率cysteine analogues [J]. Bioconjugate Chemistry, 2010, 21和總修飾率分別達到025mg·ml、34.63%和(10):1762-177269.20%。純化后的單鏈 PEG-rhIFNw具有典型[] Adolf G R, Fruhbeis B, Hauptmann R, Kalsner I,MaurPEG修飾蛋白的特性,體外抗病毒活性大幅降低,Fogy 1, Ostermann E, Patzelt E, Schwendenwein R保留了天然 rhINO抗病毒活性的15%。Sommergruber W, Zophel A Human interferon omega ltisolation of the gene. expression in Chinese hamster ovaryReferencesells and characterization of the recombinant protein [J].Biochimica et Biophysica Acta, 1991, 1089: 167-174[1] Tiefenthaler M, Geisen F, Schirmer M, Konwalinka G. A [12] Nojima Y, Iguchi K, Suzuki Y, Sato A. The pH-dependentcomparison of the antiproliferative propertiesformation of PEGylated bovine lactoferrinhuman IFN-a2 and IFN-u in human bonepolyethylene glycol (PEG)-N-hydroxysuccinimide (NHS[]. Journal of Interferon Cytokine Research, 1997,17active esters [J]. Biological Pharmaceutical Bulletin,(6):327-3292009,32(3):523-526[2] Adolf G R Human interferon omega review [JJ.[13] Wylie D C, Voloch M, Lee S, Liu Y H, Cannon-Carlson S,MSclerosis, 1995, 1 (suppL. 1):344-547Cutler C, Pramanik B. Carboxyalkylated histidine is a pH[3] Buckwold V E, Wei J, Huang Z, Huang C, Nalca A, Wellsdependent product of pegylation with SC-PEG [J].], Russell J, Collins B, Ptak R, Lang W, Scribner CPharmaceutical Research, 2001. 18(9): 1354-1360Blanchett D, Alessi T, Langecker P. Antiviral activity of [14] Qin Haina, Xiu Zhilong, Zhang Daijia, Bao Yongming, LiCHIell-derived human omega interferon and otherXiaohui, Han Guozhu. PEGylation of hirudin and analysishuman interferons against HCV RNA replicons and relatedof its antithrombin activity in vitro [J]. Chinese Journalviruses [J]. Antiviral Research, 2007, 73(2): 118-125of Chemical Engineering, 2007, 15(4): 586-590[4] Chen P F, Fu G F, Zhang H Y, Xu G x, Hou Y Y[15] Gomez A, Wang L, Straub M, Patch M G, Stevens RLiposomal plasmid DNA encoding human thymosin aI andC. Toward PKU enzyme replacement therapy: PEGylationinterferon wt potently inhibits liver tumor growth in ICRwith activity retention for three forms of recombinantmice [J]. Journal Gastroenterology and Hepatology中國煤化工ar Therapy, 20042006,21(10);1538-1543[5] Catherine M R, Thomas R A, Bing Y, Janice D, John PC, [16] ZhangCNMHG,ucha(李春Scott D L DURoS technology delivers peptides and如), Ying Ming(應明), Bai Yang(白楊), Wang Longfei·2884化工學報第62卷(E R ) Modification of neutral protease with [18] Grace M, Youngster S, Gitlin G, Sydor W, Xie Lmonomethoxypolyethylene glycol [J ]. Chin. JourneWestreich L, Jacobs S, Brassard D, Bausch J, bordensbiologicals(中國生物制品學雜志),2010,23(1):7982R Structural and biologic characterization ofated[17] Yang Yufeng(楊宇峰),LuYu(路熳), Shi Wei(石瑋),recombinant IFN-alpha2b [J]. Journal of Intera xianghu(馬相虎), Qin Jie(秦潔), Zhu Wei(朱威),Cytokine Research, 2001, 21 (12): 1103-1115Lou Jueren (&% A). Preparation and properties of [19] Ryan S M, Mantovani G, Wang X, Haddleton D MPEGylated recombinant human interferon alb [J]. chin.Brayden D J. Advances in PEGylation of important biotechJournal biologicals(中國生物制品學雜志),2010,2molecules: delivery aspects [J]. Expert Opinio(6):615-618Delivery,2008,5(4):371-383∈ceee∈∈e∈cc信息與交流22222232323232012年《聚氨酯工業(yè)》征訂啟事(郵發(fā)代號28-344)《聚氨酯工業(yè)》創(chuàng)刊于1986年,由中國聚氨酯工業(yè)協(xié)會和江蘇省化工研究所有限公司主辦,國內(nèi)唯一公開發(fā)行的聚氨酯行業(yè)專業(yè)性科技刊物,現(xiàn)已成為中國科技核心期刊和中文核心期刊。被美國化學文摘(CA)和國內(nèi)多家期刊數(shù)據(jù)庫收錄。國際標準連續(xù)出版物刊號: ISSN I005-1902;國內(nèi)統(tǒng)一連續(xù)出版物刊號:CN32-1275/TQ?！毒郯滨スI(yè)》主要報道聚氨酯制品及其原料等方面的科技成果與發(fā)展動態(tài),以刊登行業(yè)專題綜述、研究報告、生產(chǎn)應用和技術(shù)交流、分析測試方法以及生產(chǎn)設(shè)備技術(shù)進展為主,同時還刊登國內(nèi)外聚氨酯技術(shù)及行業(yè)動態(tài)。適合涉及高分子合成材料特別是聚氨酯材料研制、應用及管理的科技人員閱讀,創(chuàng)刊以來,受到國內(nèi)外聚氨酯行業(yè)專家學者、企事業(yè)單位、生產(chǎn)技術(shù)人員以及高等院校的高度重視和一致好評,是從事聚氨酯行業(yè)人士的必備刊物?！毒郯滨スI(yè)》為雙月刊,全年訂價80元,郵發(fā)代號28344訂閱者也可通過以下單位訂閱《聚氨酯工業(yè)》發(fā)行部:南京市北京西路72號郵政編碼:210024;電話:025-83755190,85664648全國非郵發(fā)報刊聯(lián)合征訂:天津市大寺泉北里別墅17號,郵政編碼:300385電話:022-23962479,23973378;中國化工倍息中心期刊田書聯(lián)合征訂部:北京安外小關(guān)街53號,郵政編碼:100029;電話:010-6444415,64444113如需開具正式發(fā)票,請另加4元郵寄費,用于掛號郵寄發(fā)票。為慶祝《聚氨酯工業(yè)》創(chuàng)刊二十周年,本刊隆重推出《聚氨酯工業(yè)》二十周年(1986~2006)期刊合集(DVD光盤)歡迎致電本刊發(fā)行部垂詢。歡迎訂鬩!歌迎投稿!歌迎刊登廣告!通過本刊發(fā)行部訂閱辦法:銀行匯款開戶行:中國工商銀行南京市草場門支行賬號:4301016309001017389戶名:江蘇省化工研究所有限公司2.郵局匯款地址:南京市北京西路72號中國煤化工編:210024收款人:《聚氨酯工業(yè)》編輯部CNMHG