中華醫(yī)學(xué)雜志2002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4論著宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組織中端粒酶的活性及其與凹空細胞分型的關(guān)系冷冰卞美璐孫靄萍范慕貞陳慶云【摘要】目的研究宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CⅣN)宮頸癌的組織和脫落細胞中端粒酶的活性變化探索端粒酶激活與凹空細胞分型及人乳頭狀瘤病毒HV感染之間的關(guān)系。方法采用端粒酶重復(fù)擴增技TAP)檢測24例正常宮頸、34例宮頸炎癥、78例CIN及16例宮頸癌的宮頸組織和脫落細胞中端粒酶的活性。同時采用雙盲法檢測上述宮頸病變組織中凹空細胞的分布并將其分為Ⅰ型和Ⅱ型。結(jié)果組織中端粒酶陽性率分別為正常宮頸組織為16.7%(4/24)炎癥組織為17.6%(6/34)CIN組織為51.6%(16/31)CN2組織為72.0%18/25)CIN3組織為86.4%(1922)宮頸癌組織為100%(1616)端粒酶陽性率CN明顯高于正常宮頸及炎癥組織卩<0.01)宮頸癌組織明顯高于CIN組織P<0.05)xN3高于CN(P<0.05)而正常宮頸與炎癥組織比CN1與CIN2比CN2與CN3比較差異均無顯著意義P>0.05)相應(yīng)的宮頸脫落細胞中端粒酶陽性率同組織標本比差異無顯著意義(P>0.05)含Ⅰ型、Ⅱ型凹空細胞的宮頸病變組織中端粒酶陽性率分別為66.7%和100%兩者差異有顯著意義P<0.01)結(jié)論(1)端粒酶的激活與宮頸癌及CIN的發(fā)展有密切關(guān)系端粒酶可作為宮頸癌及ⅣN的標志物。(2)宮頸脫落細胞可以替代組織標本進行端粒酶活性檢測。(3端粒酶的激活與Ⅱ型凹空細胞的出現(xiàn)及HPV6/18感染有密切關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變;宮頸腫瘤;端粒末端轉(zhuǎn)移酶;乳頭狀瘤病毒人Telomerase activity in cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia and its correlation toclassification of koilocytosis LENG Bing, BIAN Meilu, SUN Aiping, FAN Muzhen, CHEN QingyunDepartment of Obstetrics and Gynecology, China-Japan Friendship Hospital Beying 100029, Chin(Abstract] Objective To investigate the telomerase activity in cervical tissues and exfoliated cells inpatients with cervical intraepithelial neoplasia CIN )and cervical carcinoma, and to study the correlation betweentelomerase activativity and koilocytotisis classification and between telomerase activity and human papillomavirus(HPV ) infection. Methods Telomeric repeat amplification protocol TRAP bvas used to determine the telomeraseactivity in cervical tissues and exfoliated cells in 24 women with normal cervix 34 patients with cervitis 78 patientswith CIN and 16 patients with cervical carcinoma. The patients with CIN were classified into 3 subgroups accordingto the abnormality of cervical cells( 31 CIN, cases 25 CIN, cases and 22 CIN3 cases ) The presence andclassification of koilocyte in cervical tissues was examined by microscopy with double blind method. The telomeraseactivity in koilocytes of different types was investigated. Results The telomerase positive rate was 16.7%(4/24in normal cervical tissue 17 6%(6/34 )in cervitis tissue .1.6%(16/31)in CIN, tissue 72.0%( 18/25 )inCIN2 tissue 86.4%( 19/22 )in CIN, tissue, and 100%(16/16)in cervical carcinoma tissue respectively.Thetelomerase positive rate in Cin cases was significantly higher than those in normal cervix and cervitis case( all P<0.01 )and the telomerase positive rate was significantly higher in cervical carcinoma than in CIN P<0.01 ). Itwas also significantly higher in CIN3 than in CIN, P< 0.05 ), while no significant difference was found in thetelomerase positive rate between normal cervix and cervitis, CIN, and CIN2 and CIN2 and CIN,( P>0.05). Nesignificant difference of telomerase positive rate was found between the cervical tissue and exfoliated cells in thesame case tod P>0.05 ) Koilocytes were found in sixty-four out of the 154 samples of cervical lesions. Amongthem koilocytes were found in 54 out of 94 samples of cervicaland CIN tissues( koilocytes of type I in 18cases and type II in 36 cases ) The telomerase positive rate was 100% in tissues of CIN and cervical carcinomawith type I koilocytosis significantly higher than that in tissues with type I koilocytosis( 66.7%, P<0.05)telomerase is closely associated with progression of CIN and cervical carcinoma andtelomerase might be a useful marker for cervical carcinoma and CIN. (2 Cervical exfoliated cells may be used as中華醫(yī)學(xué)雜志002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4263the substitute of cervical tissues in determining telomerase activity. 3 )Activation of telomerase is correlated withtype I koilocytosis and HPV 16/18 infection[ Key words Cervical intraepithelial neoplasia Cervix neoplasms; Telomerase: Papillomavirus近年來大量研究表明腫瘤組織中端粒酶活性凍后研磨將粉末轉(zhuǎn)至試管中加入預(yù)冷的清洗液達67%-100%12。人乳頭狀瘤病毒HPV撼染與800l[10mmo/LpH8.0 EPES-KOH,1.5mmol/L宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MgCl,0mmol/ L 1 mmol/L二硫蘇糖釀DT)],那么在宮頸癌變過程中端粒酶的激活與HPV感染充分混勻冰浴5minA℃、2000r/min離心5min有何關(guān)系?我們通過比較含Ⅰ型、Ⅱ型凹空細胞的棄上清加入預(yù)冷的裂解液200μ[10mmol/LpH7.5宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變CN織中端粒酶iHC4 mmol/L mocl2,1mmo/乙二醇雙B乙的活性變化探討端粒酶激活與凹空細胞分型及胺醚)四乙酸5moJ/L二巰基乙醇,.5% CHAPS,HPV感染之間的關(guān)系。10%甘油]冰浴30min期間震蕩搖勻數(shù)次A℃、1對象與方法500r/min離心30min將上清分裝于預(yù)冷的試管中其中的一管用Ioww法行蛋白測定其余數(shù)管凍存對象于-70℃冰箱。(2涫頸脫落細胞端粒酶的提取在1.宮頸組織標本:199年4月~2001年4月,試管內(nèi)加入1mlPB無RNA酶)將新采集的宮頸在中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科門診行計算機輔助細胞檢測拭子放入試管內(nèi)沖刷幾下2000r/min離心5min,( computer-assisted cytologic technique, CCT)結(jié)果異常棄上清沉淀中加入預(yù)冷的清洗液80oμd涂咸1的患者在陰道鏡下取活檢組織共128例將一部(3)宮頸鱗癌細胞系HLa)細胞端粒酶的提取作分組織送病理檢查另一部分凍存于-70℃冰箱備為陽性對照):用0.5%的胰酶消化培養(yǎng)的Hela細用。經(jīng)病理學(xué)檢查證實,其中急、慢性炎癥34例,胞用RPM-1640細胞培養(yǎng)液將Hela細胞沖洗下來例根據(jù)細胞異常程度將CIN分為3級其中并轉(zhuǎn)移至試管中2000r/min離心5min棄培養(yǎng)液131例CN25例CIN322例包括原位癌3例),加入1mlPB(無RNA酶重懸細胞再次離心棄上浸潤癌16例。另取24例經(jīng)病理學(xué)檢査證實為正常清加入預(yù)冷的清洗液800μ余同(1的宮頸組織作為對照。2.RT-PCR擴增端粒DNA將含5{g蛋白的提2.宮頸脫落細胞標本:所有取組織標本的患取液加到20dPCR液中20 mmol/L pH8.3Ti者均在手術(shù)前取其宮頸拭子。方法將無菌棉拭子HC,1.5mmol/ L MgCl2,63mmo/LKCl,1mmol/L繞宮頸鱗柱交界處擦拭2周。FGTA0.005% Tween-2050mol/L4種脫氧核苷三二、Ⅰ型、Ⅱ型凹空細胞的檢測磷酸dNTP),1ggT4基因32蛋白A0.2 pg TS引物對活檢組織標本進行凹空細胞的檢測和分型,(5′ AATCCGTCGAGCAGAGTT3')]混勻20℃保溫30端粒酶檢測和凹空細胞分型采用雙盲法進行。根據(jù)min90℃放置3min加入5Utaq酶、0.21CX引物文執(zhí)3]將凹空細胞按核表現(xiàn)分為兩類:Ⅰ型凹空(5′ CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTAA3′)覆蓋2滴石細胞和Ⅱ型凹空細胞。Ⅰ型凹空細胞的特點為:核蠟油混勻,進行PCR循環(huán)。循環(huán)參數(shù):94℃45s增大但不超過底層細胞核的1倍核形不規(guī)則染50℃45s,72℃60s共35個循環(huán)結(jié)束后72℃延伸色深結(jié)構(gòu)不清可見雙核馮見病理性核分裂相即mi。試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心。以放大400倍為高倍視野病理性核分裂相1~2個3.PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺(PACE澱凝膠電泳和/5個高倍視野。Ⅱ型凹空細胞特點為核為底層細銀染取15μlPR產(chǎn)物加入1dl上樣緩沖液混勻胞核的2~3倍,可見雙核、多核、畸形核或巨核有后在0.5×Tris硼酸-EDA電泳緩沖液TBE)用的核結(jié)構(gòu)清晰,可見核仁,有的染色質(zhì)濃聚呈團塊12%PAGE、400V電壓電泳1h,然后取下凝膠銀狀結(jié)構(gòu)不清核膜增厚不連續(xù)核漿比例失調(diào)常染。當在50b處岀現(xiàn)第1個條帶,并有多個遞增見病理性核分裂相1~6個/5個高倍視野。的間隔為6bp的條帶出現(xiàn)時端粒酶為陽性。TRAP法檢測端粒酶活性四、統(tǒng)計學(xué)處理中華醫(yī)學(xué)雜志2002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4正常宮頸、宮頸灸癥、CIN1、CIN、CIN3及宮頸癌結(jié)果患者的宮頸脫落細胞端粒酶陽性率分別為:16.7%宮頸癌及CN組織中端粒酶活性的變化(4/24)17.6%(6/34)54.8%(17/31)76%(19/經(jīng)病理證實的正常宮頸、宮頸炎癥、CIN1、CIN2、25)86.4%(1922)及93.7%(15/16),與相應(yīng)組織CⅠN3及宮頸癌組織標本共152例其端粒酶陽性率標本中端粒酶的陽性率比較差異均無顯著意義校分別為167%(4/24)17.6%(6/34)51.6%(16/正x2或x2分別為0、0、0.0650.104、0,P>0.0531)72%(18/25)86.4%(19/22)及100%(16/16)見表1圖2其中CⅣN共78例53例端粒酶呈陽性,占67.9%CN端粒酶檢出率高于正常對照組和炎癥組x2=34.40,P<0.01)浸潤癌端粒酶檢出率高于CN組(校正x2=544,P<0.05)CN同CN比較x2=8.40P<0.05洏而炎癥組同正常對照組相比,CIN同CN2比CN2同CN比差異均無顯著意義校正x2或x2分別為02.002.41,P均>0.05)見表1圖1。1. Markert(PBR322DNA/HaeⅢ);2.端粒酶裂解液陰性對照3.正常宮頸拭子A5.CIN的宮頸拭子為7.CIN2的宮頸拭子表1宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組織與脫落8、9.CIN3的宮頸拭子0、11.宮頸癌的宮頸拭子;2.Hela細胞細胞中端粒酶檢出情況裂解液陽性對照組織標本脫落細胞圖2宮頸脫落細胞中端粒酶活性的檢澉TRA法,PR產(chǎn)物組別總例數(shù)端粒酶例數(shù)%)用性例數(shù)率%)的聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染結(jié)果)正常對照2416.716.7炎癥17.6宮頸癌及CIN組織中端粒酶活性與凹空細胞分型的關(guān)系3151.6152例宮頸組織標本中64例有凹空細胞其中72.094例宮頸癌和CN組織中54例檢出凹空細胞,I型浸潤癌15凹空細胞18例,Ⅱ型凹空細胞36例端粒酶陽性率注與相應(yīng)組織標本比較'x2或校正x2=0-2.41,P>0.05xN分別為66.7%(12/18廂100%(3636)兩者比較差與正常組及父癥組比較x2=3.4,<00漫潤癌與CN組比異有顯著意義校正x2=10.34,P<0.01)見表2,較個校正x2=54,P<001與CIN組比較=840,P<0.05:圖3ACIN1、CN2及CN3分別為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變1、2及3級1011121314表2宮頸病變組織中I、Ⅱ型凹空細胞分布及其端粒酶的陽性情況I型凹空細胞型凹空細胞組別總例數(shù)例數(shù)陽性例數(shù)例數(shù)端粒酶日性例數(shù)正常組織40炎癥CINy04750CIN012121. Markey(PBR322DNA/Hae)2.端粒酶裂解液陰性對照;3.宮頸癌正常宮頸斗.宮頸炎;、6.CN標本門78.CN2標本;-11注CIN、CIN、CIN3分別為宮頸上皮內(nèi)瘤樣變1、2及3級CN3標本(10、11為原位癌)12、13.宮頸癌標本4.Hela細胞提取液陽性對照圖1宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組織中活性的檢測討論假RA法PR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染結(jié)果)宮頸癌及CIN中端粒酶檢出率的變化中華醫(yī)學(xué)雜志002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4立一種快速、有效的端粒酶測定方法。但就宮頸脫落細胞是否能代替組織標本進行端粒酶檢測研究人員有不同的觀點。 Wisman等131將宮頸拭子檢測同組織檢測相比指出用宮頸拭子檢測端粒酶活性敏感度低不適用于宮頸癌篩查。有一些研究人員、、5認為用宮頸拭子檢測端粒酶的活性是可行的1451我們的結(jié)果也表明宮頸脫落細胞可以替代組織標本進行端粒酶活性檢測。宮頸癌及CN組織中端粒酶活性同凹空細胞分型及HPV感染的關(guān)系HPV感染特別是高危型病毒HPV6/18)的感染在宮頸癌前病變及宮頸癌發(fā)病中的重要作用已基本得到了公認68那么端粒酶的活性同HPV感染是否有一定的關(guān)系呢? Kawai等1探討了宮頸癌組織中端粒酶的活化同HPV感染的關(guān)系結(jié)果表明端粒酶激活同宮頸病變中HPV感染關(guān)系密切。我們可以設(shè)想激活端粒酶可能是高危型HPV致宮頸癌的一個途徑。然而仍有不同的觀點, Yashima圖3A凹空細胞的形態(tài)。圖3為I型凹空細胞HE等認為宮頸病變中端粒酶的活性同HPV的感400圖4為Ⅱ型凹空細胞HE×400染無明顯的關(guān)系;Wimn等13的研究表明宮頸冰凍組織中端粒酶的活性與特異的HPV類型無關(guān)。度為5-15k其主要功能包括保護染色體的由于大家的看法并不一致這個方面的研究仍是當末端防止染色體復(fù)制時末端丟失決定細胞的壽前的熱點命56。近幾年大量文獻報道在絕大部分惡性腫在我們以前的研究中3根據(jù)凹空細胞的核異瘤和無限增殖的細胞系中可檢測到端粒酶的活性。型程度將其分為Ⅰ型和Ⅱ型。PCR法對照研究結(jié)這揭示端粒酶可能是一個廣泛的腫瘤標志物在惡果表明含Ⅱ型凹空細胞的HPV感染APV1618占性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用78。我們86.0%含I型凹空細胞的HPV感染HPV16/18占比較了正常宮頸、宮頸炎癥、CIN宮頸癌組織中端粒16.7%HPV6/11占20%。因此,當宮頸組織中、表酶的活性結(jié)果顯示CN同正常宮頸及富頸父癥組層出現(xiàn)Ⅱ型凹空細胞時可以推測有HPV16/1感織檢測相比富頸癌同cN相比端粒酶活性的陽性染。而1型凹空細胞的HP6/1和HV16/8感染率差異有顯著意義P<0.01)N端粒酶陽性率率差異無顯著意義P>0.05)本研究中我們特也高于CIN(P<0.05可以看出隨著宮頸癌前別關(guān)注含I型、Ⅱ型凹空細胞的宮頸癌及CN組織病變向?qū)m頸癌的進展端粒酶的陽性率逐漸增高這中端粒酶檢出率是否有差異即端粒酶檢出率同凹表明端粒酶的激活同宮頸癌及CIN的發(fā)展有密切關(guān)空細胞分型的關(guān)系發(fā)現(xiàn)含Ⅱ型凹空細胞的組織端系。本研究中CN端粒酶活性比例即達51.6%,粒酶陽性率為10%而含1型凹空細胞的組織端CIN3端粒酶陽性率可達86.4%這提示端粒酶在癌粒酶陽性率為66,7%兩者差異有顯著意義(P<前病變中就有相當數(shù)量的表達端粒酶的激活可能0.05)這表明端粒酶激活同Ⅱ型凹空細胞有密切是宮頸癌發(fā)生的早期事件因而可作為判斷宮頸癌關(guān)系。進一步表明宮頸癌及CN中端粒酶活化與及癌前病變發(fā)生的有用標志物。本結(jié)果同大多數(shù)人HPV16/18感染可能有密切關(guān)系的研究一致90二、宮頸脫落細胞中端粒酶活性的檢測I Sajm M, Westra WH, Chen H, et al. Telomerase activity in the組織標本中端粒酶活性檢測具有滯后性,且方differential diagnosis of papillary carcinoma of the thyroid. Surgery中華醫(yī)學(xué)雜志2002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4ell carcinoma of the uterine cervix. Am J Clin Pathol, 1998, 109: 153-biomarker for( pre )neoplastic cervical disease in scrapings and frozenpatients with abnormcal smear. J Clin Oncol 1998袁莉云,卞美璐羅杰,子宮頸濕疣的病理變化與人乳頭狀瘤病162238-2245,毒的檢測,中華婦產(chǎn)科雜志99934354314 Kyo S Takakura M, Ishikawa H ret al. Application of telomerase assay4 Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS, et al. A highly conservedfor the screening of cervical lesions. Cancer Res 1997 57: 1863-1867repetitive DNA 5eμ uence C TTAGGGλ, present at the telomeres o15張夢真喬玉環(huán)史惠蓉,人宮頸癌脫涪細胞端粒酶活性檢測的human chromosomes, Proc Natl Acad Sci USA 1988 85 16622-6626意義,中國婦產(chǎn)科臨床5 Rhyu MS. Telomeres telomerase and immortality. 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Telomerase activity as a本文編輯瀏小梅)醫(yī)學(xué)新聞心力衰竭患者死亡時間上存在性別差異孫寧玲馬志毅2001年11月,在美國心臟病學(xué)會(AHA) Scientific患者僅在清晨的幾個小時里最為危險sessions會議上報道男性致死性充血性心力衰竭以下簡稱Fahn認為“心衰在男性通常比女性更為危險。心衰的心衰)者絕大多數(shù)死于午夜或黎明但女性患者則在黎明某些臨床特點可能影響24h生物節(jié)律男女之間激素分泌常見模式的差異也可能與這些發(fā)現(xiàn)有關(guān)。但我們對這些差異仍圣保羅醫(yī)學(xué)院的巴西心臟中心醫(yī)學(xué)博士 Jose Fabri報知之甚少"。軀體每日都有許多周期性的變化這些變化可道∵我們觀察到許多充血性心衰的住院患者的死亡均發(fā)生能增加心臟事件的危險。如受心率、血壓以及心臟收縮力等于早晨并觀察到了死亡的時間分布,了解了是否在一天當因素影響氧需求在上午70時和中午達到高峰。血漿中中的某些時段其發(fā)生率更高。而從中我們獲得了意想不到去甲腎上腺素和腎素活性(兩者均協(xié)助血管收縮樣在此的性別上的差別”。這種死亡時間分布的機制可能源于毎日時達高峰。既往研究已表明充血性心衰患者的血壓、心率激素水平的生物性變化,即機體的24h生物節(jié)律。早先有在24h周期中存在異常。通常心率與血壓在夜間下降但關(guān)未住院患者的研究表明心臟事件及猝死在晨起醒來后的心衰患者常無此表現(xiàn)。幾個小時內(nèi)達到高峰。而根據(jù)該項研究充血性心衰患者在進一步的研究應(yīng)致力于闡明心衰死亡患者24h周期異夜間尤為危險同時首次發(fā)現(xiàn)在24h節(jié)律上性別間存在差常的機制,并研制出新的藥物以校正其周期異常。例如BHAI the beta- blocker heart attack trial)發(fā)現(xiàn)阻滯劑可使心Fabri等研究了508例死亡病例男308例女200例年衰患者清晨的心源性猝死發(fā)生率下降44%。但β阻滯劑并齡令14~93歲平均59歲,以終末心衰住院。根據(jù)病情給予沒有普遍在心衰患者中應(yīng)用新近的研究表明此類藥物可能每位患者標準化治療包括臥床休息、飲食和血管緊張素轉(zhuǎn)有助于心衰治療換酶抑制劑、利尿劑、地高辛治療。研究發(fā)現(xiàn)男性患者更易收稿日期2001-12-27)死于黎明50~659時和午夜的230~2359時而女性(本文編輯李群)