遺傳繁育中國(guó)畜牧獸醫(yī)2007年第34卷第2期RNAi技術(shù)的應(yīng)用王軍張以芳張曄云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院昆明650201)摘要將雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)會(huì)引起與其同源的基因的沉默這種現(xiàn)象稱為RNA干擾( rNA interference rNai)〉作者從RNAi技術(shù)的歷史、作用機(jī)制、應(yīng)用以及前景4個(gè)方面其中主要就其應(yīng)用方面的研究作一綜述。關(guān)鍵詞雙鏈RNA;RNAi中圖分類號(hào)78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼∶文章編號(hào):671-72362007)2007603Guo等(1995)于試圖阻斷線蟲( C elegans)中這些片段可與該核酸酶的 dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合par1基因的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象:并且作為模板來辨識(shí) target mRNA;識(shí)別之后,此他們本來利用anti- sense rna技術(shù),可達(dá)到特異性mRNA與 dsRNA sense chain發(fā)生鏈互換原先dsR阻斷par-基因的表達(dá)同時(shí)亦在其對(duì)照組試驗(yàn)中,NA中的 sense chain被mRNA代替,而從 enzyme注射 sense rna到線蟲體內(nèi)預(yù)期可能觀察到此基 dsRNa complex中釋放出來,mRNA則位于原先因表達(dá)的增強(qiáng)。但得到的結(jié)果竟是二者都切斷了 sense chain的位置。同時(shí)此核酸酶亦在同樣位置對(duì)par-l基因的表達(dá)途徑。這與傳統(tǒng)上對(duì)anti- sense mRNA進(jìn)行切割,這樣又產(chǎn)生了21~23bp長(zhǎng)的RNA技術(shù)的解釋竟是正好相反。研究小組一直沒 dsRNA小片段再度與核酸酶形成復(fù)合物繼續(xù)對(duì)能把這個(gè)意外結(jié)果予以合理的解釋。直到1998年 target mRNA進(jìn)行切割從而使目的基因沉默,無法2月華盛頓卡耐基研究院的 Andrew和馬薩諸塞大作用進(jìn)而產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象學(xué)醫(yī)學(xué)院的 craig才首次揭開這個(gè)懸疑之謎。通過2RNAi的應(yīng)用大量艱苦的工作他們證實(shí)、Guo等遇到的 sense2.1高通量研究基因功能基因功能研究現(xiàn)在已RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象,以及過去的anti- sense經(jīng)明確雙鏈RNA干擾(RNAi)技術(shù)不僅可抑制體RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷都是由于體外轉(zhuǎn)錄所外細(xì)胞中特定基因的表達(dá)而且也可抑制體內(nèi)特定得的RNA中污染了微量雙鏈RNA( dsRNA)而引起基因的表達(dá)。在功能基因組研究中需要對(duì)特定基的。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注因進(jìn)行功能喪失或降低突變以確定其功能?？梢陨渚€蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)基因抑制效應(yīng)變得十分微弱而經(jīng)過預(yù)見RNAi作為一種快速靜默基因的途徑將會(huì)越純化的雙鏈RNA卻正好相反其能夠高效特異性阻來越多地用于哺乳動(dòng)物基因研究。將功能未知的基斷相應(yīng)基因的表達(dá)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA因的編碼區(qū)(外顯子)或啟動(dòng)子區(qū),以反向重復(fù)的方T#i RNA interference RNAi)式由同一啟動(dòng)子控制表達(dá)。這樣在轉(zhuǎn)基因個(gè)體內(nèi)轉(zhuǎn)隨后在短短一年中RNA現(xiàn)象被廣泛發(fā)現(xiàn)于錄出的RNA可形成 dsrnA產(chǎn)生RNA干擾使目的真菌、阿拉伯芥水螅( Lohman等1999渦蟲、錐基因沉默從而進(jìn)一步研究目的基因的功能。根據(jù)蟲斑馬魚mha等2001)等多數(shù)真核生物中。這所選用序列的不同可將其分為編碼區(qū)RNA和啟種存在機(jī)制揭示了RNA很可能出現(xiàn)在生命進(jìn)化的動(dòng)子區(qū)RNA早期階段。隨著研究的不斷深入RNAi的機(jī)制正逐由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達(dá)因步被闡明同時(shí)亦成為功能基因組研究領(lǐng)域中的有而RNA成為研究基因功能的很好工具。 Gonczy等力工具RNAi也越來越為人們所重視(2000和 fraser氰2000)利用RNAi手段分別進(jìn)行1RNAi的作用機(jī)制了這方而的學(xué)討C灬w等堅(jiān)線蟲3號(hào)染色體2232當(dāng)dRNA導(dǎo)入細(xì)胞后,可被一種dRNA特個(gè)基中國(guó)煤化工并注射到線蟲性腺異的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割成21~23bp的小片段內(nèi)CNMHG出現(xiàn)的異常表型結(jié)果發(fā)現(xiàn)了133個(gè)基因與細(xì)胞分裂異常有關(guān)其中104收稿日期200607-26個(gè)基因以前沒有發(fā)現(xiàn)有這種功能找到了6個(gè)與已作者簡(jiǎn)介汪軍1982-)男江蘇人碩士生主要從事動(dòng)物微通你石與免疫學(xué)方向的研究。知的與早期胚胎細(xì)胞分裂相關(guān)的基因(共7個(gè))這個(gè)試驗(yàn)結(jié)果證明了RNA方法的有效性與可靠性中國(guó)畜牧獸醫(yī)2007年第34卷第2期遺傳繁育Fraser等將線蟲1號(hào)染色體上的2416個(gè)基因?qū)?yīng)及正常細(xì)胞。隨著這一研究結(jié)果近日的公布另一個(gè)的 dsRNA構(gòu)建到細(xì)菌文庫(kù)中,然后將細(xì)菌喂給線小組的研究人員正設(shè)計(jì)這一技術(shù)在世界上的第1次蟲觀察形態(tài)學(xué)的異常、性別比例的變化、不孕的情臨床試驗(yàn)將在一組艾滋病患者中進(jìn)行。由于雙鏈況結(jié)果將與這些表型有關(guān)的基因從70個(gè)增加到RNA干擾通過使有害的基因靜默”而奏效因而科378個(gè)。這2個(gè)研究小組的研究極大地?cái)U(kuò)展了對(duì)線學(xué)家認(rèn)為可用其來靜默感染的病毒基因或已轉(zhuǎn)為惡蟲基因組中已知序列但功能未知的基因的認(rèn)識(shí)同性的腫瘤細(xì)胞從而使他們變得無害。時(shí)研究提示在進(jìn)化中保守的基因更傾向于具有2.4基因改造據(jù)報(bào)道英國(guó)劍橋大學(xué)分子病毒學(xué)RN蛀ⅰ相關(guān)的表型而43%具有RNAi表型的線蟲基家泰利與蘇格蘭羅斯林研究所的桑博士進(jìn)行有關(guān)研因在果蠅中找到了同源序列這無疑也將為不同物究證明雞只細(xì)胞可通過注入少量基因物質(zhì)產(chǎn)生抵種中同源基因的研究工作提供重要的參考資料抗禽流感的能力。研究小組目前使用3個(gè)方法同步研究人員對(duì)該技術(shù)在植物中旳應(yīng)用亦開始探索進(jìn)行研究其中一種是制造細(xì)小的核糖核酸分子利其可能性。加州理工大學(xué)的 Chuang等使用此技術(shù)用RNAi技術(shù),影響病毒的正常運(yùn)作。除了H5N研究擬南芥"的AG、CLV3、 API PAN4個(gè)與開花型禽流感這種方法還可以防范其它傳給人類的禽相關(guān)的基因。結(jié)果表明:使用RNAi技術(shù)可以產(chǎn)生流感病毒例如2003年導(dǎo)致荷蘭一個(gè)農(nóng)場(chǎng)爆發(fā)疫情功能喪失或降低的突變體而其表型與以前使用其的H7型病毒,它方法鑒定的突變體類似。使用RNA原位雜交方2.5基因敲除早期,雖然傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)被式可表明在RNAi突變體的 target mRNA顯著降廣泛用于一些功能基因的研究但在實(shí)際應(yīng)用中存在低。該結(jié)果說明RNAi技術(shù)亦可成為植物功能基因一些不容忽視的問題①它不利于在短期內(nèi)研究數(shù)量組研究中的有力工具。較多的基因若希望一次性敲除2個(gè)或多個(gè)基因?qū)?.2研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由于RNAⅰ能高效特異于傳統(tǒng)的基因敲除非常困難若希望研究某一突變的阻斷基因表達(dá),它成為研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好致死基因在特定胚胎發(fā)育階段的功能傳統(tǒng)的基因敲工具。在線蟲體內(nèi)胰島素和受體結(jié)合后可以活化除無法滿足研究的需要因?yàn)榕咛タ赡茉谠缙诰鸵驗(yàn)镈sorl他是Mek的類似物, Dsorl活化后可以激活缺失此基因而死亡③3在某些制造基因敲除動(dòng)物模型EekA他是ERK的類似物。用以 Sort為靶目標(biāo)的分困難或因倫理學(xué)原因根本不可能進(jìn)行的物種中dsRNA可以阻斷Dorl的表達(dá)雖然總的FkA表達(dá)(如大型動(dòng)物及人)傳統(tǒng)的基因敲除也無法應(yīng)用(陳不受影響但由于υsorl表達(dá)被抑制從而胰島素受吉?jiǎng)偟?004 )o RNAi可以有效地彌補(bǔ)傳統(tǒng)基因敲除刺激后ErkA不能活化。的上述缺點(diǎn)它可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行研2.3基因治療用RNAi特異性地抑制如艾滋病究。對(duì)于哺乳動(dòng)物RNAi能在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中達(dá)病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相關(guān)基因或突到基因敲除的效果對(duì)于一些敲除后的小鼠在胚胎時(shí)變基因的過度表達(dá)使這類基因保持在靜默或休眠就會(huì)死亡的基因,可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用狀態(tài)從而有望用這種新的手段治療各種病毒性疾RNA技術(shù)研究它的功能。 Elbashir等2001)使用21病和惡性腫瘤等疑難病癥。而腫瘤是多基因、多因 bp dsrna避免了干擾引起的細(xì)胞非特異性應(yīng)激反素疾病單個(gè)癌基因的抑制往往很難達(dá)到治療效果。應(yīng)實(shí)現(xiàn)了在一系列哺乳類細(xì)胞系中包括人類宮頸但RNAi技術(shù)能夠同時(shí)抑制多個(gè)不同基因而且抑癌細(xì)胞及胚胎性腎細(xì)胞系293中 dsRNA對(duì)特定基因制效果互不干擾。此外RNAi識(shí)別可以精確到一個(gè)表達(dá)的抑制作用。目前腺病毒是體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的常用核苷酸對(duì)由野生型點(diǎn)突變形成的癌基因,如ras、載體Ⅻia等(2002)用腺病毒作載體在體內(nèi)和體外p53等能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確有效的封閉效果野生型基因表達(dá) dsrNa并成功陽斷了基因的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)了則不受影響。試驗(yàn)結(jié)果證明bcl-2、CDK-2、PIK-1和成體動(dòng)物的基因敲除p53等腫瘤相關(guān)基因的RNAi能夠使人類宮頸癌細(xì)2.6基因表達(dá)調(diào)控 Bender等(2002)發(fā)現(xiàn)RNAi胞Hela)增生速度減慢惡性程度降低凋亡加快。在實(shí)肝瘋Hep3B)非小細(xì)胞肺癌H2頭頸部鱗狀胚胎中國(guó)煤作扮演重要角色。實(shí)驗(yàn)達(dá)的改變而基因的細(xì)胞癒(C33A)骨肉瘤(U20s)及前列腺癒(LN編碼CNMH控的一種類型是染色CaP)白血病等細(xì)胞系中的試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)類似效應(yīng)。體的改變通過改變?nèi)旧w的形狀(更緊或是更此外將RNAi應(yīng)用于 Wilson病等先天遺傳性疾病的松)決定那一個(gè)基因表達(dá)。但什么促進(jìn)了染色體體外試驗(yàn)也獲得令人滿意的成果?？茖W(xué)家采用這項(xiàng)形狀的改變以前并不清楚。 siRNA( small interfering技術(shù)完全清徐棼羅長(zhǎng)在試管中的所有癌細(xì)胞而未傷RNA)在染色體形狀的改變中起著非常重要的作遺傳繁育中國(guó)畜牧獸醫(yī)2007年第34卷第2期用。這樣RNAi能永久的關(guān)閉基因表達(dá)而不僅僅是短期的抑制它。通過在發(fā)育過程中關(guān)閉或開放基參考文獻(xiàn)因的表達(dá), siRNA可能指導(dǎo)著細(xì)胞的定向分化。I Bender J. Plant epigenetics[ J ]. Curr Biol -2002, 12( 12): 412RNAi已被證實(shí)能引導(dǎo)植物干細(xì)胞分化因而研究者認(rèn)為RNAi也可能參與指導(dǎo)人的干細(xì)胞分化。由于2 Elbashir S M, Harboth J Lendeckel W,tl., Duplexes o21 nucleo-RNAi在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用對(duì)RNAitide rNAs mediate rNa interference in cultured mammalian cells微小的干擾就可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。J] Nature2001411(6836)a93問題與展望Fraser A G, Kamath R S Zipperlen P, et al. Functional genomic a-nalysis of C. eleans chromosome I by systematic RNA interference雖然此技術(shù)在非脊椎動(dòng)物中的應(yīng)用已取得一些[J]. Nature2000408(6810)325-330重要的成果但在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用才剛剛起步。4 Gonczy P Echeverri C Oegema K,eta. Functional genomic analysis在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNAi并不能完全阻斷基因的表of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosomelll達(dá)特別是表達(dá)異常高的基因淇次RNAi并不適應(yīng)J] Nature2000A08(6810)331-336所有的基因如 dsRNA對(duì)一些在神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮功Guo SKemphues K J. Par-1 a gene required for establishing polaritin C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is能的基因抑制作用不明顯湯外運(yùn)載體系一直是體asymmetrical distributed[ J ]. Cell 1995 81(4)611-620內(nèi)基因治療的瓶頸如何將雙鏈RNA高效特異的轉(zhuǎn)6 ohmann J U Endl I Bosch TO. Silencing of developmental genes入體內(nèi)仍是一個(gè)難題。但RNA技術(shù)的運(yùn)用對(duì)生命drtJ] Dey biol999214(1)211-~214.科學(xué)的深遠(yuǎn)影響將不會(huì)低于PCR技術(shù)(胡迎春7 Xia H B ,Mao Q W Paulson H L et al. Si- RNA mediated gene silen-2004)RNAi技術(shù)體系的建立為人類基因功能研ing in vitro and in vivo[ J ]. Nat Biotechnol 2002, 20: 1006-1010究和疾病基因治療開辟了一個(gè)革命性的新領(lǐng)域。我8 Zhao Z Cao Y,LM,tal. A Double- stranded RAN injection pr們相信,該技術(shù)以其較其他多種技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)和duces nonspecific defects in zebrafish[ J]. Dev Biol 2001 229(1)在各領(lǐng)域中的突出優(yōu)勢(shì)在未來將會(huì)有更多更廣闊的發(fā)展前景。The Application of RNA InterferenceWANG Jun, ZHANG Yi-fang, ZHANG YeCollege of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 ChinaAbstract: Putting double-stranded RNA into cell could cause homologous genes silencing. This phenealled rNa interference. In this paper, the history mechanism of action application and perspective of RNA interference were summarized. Espe-cially summarized from the application of RNA interferenceKey words: double-stranded RNA RNA interference不同年齡和性別的快速生長(zhǎng)雞氮維持需要和氮沉積潛能的研究Samadi等著劉蓓一周秋燕摘譯施壽榮校摘要本試驗(yàn)是為了估測(cè)不同年齡和性別的快速生長(zhǎng)雞毎日的氮維持需要NMR)和毎日氮沉積澘能( NDmaxt)在氮平衡試驗(yàn)中用144只公雞和144母雞在4個(gè)連續(xù)的生長(zhǎng)期做了相應(yīng)的研究(Ⅰl0~25d;Ⅱ30~45d;Ⅲ50~65d;I085d)。試驗(yàn)日糧由高蛋白質(zhì)大豆和氨基酸晶體作為蛋白質(zhì)來源又各設(shè)了6個(gè)梯度的蛋白質(zhì)水平(N1=6.6%N2=13.0%N3=19.6%N4=25.1%N3=31.8%N=37.6%)。通過食入氮和總氮排出量的指數(shù)函數(shù)來確定氮維持需要。氮維持需要的平均值22 emg N/BW,d)用于進(jìn)一步計(jì)算NDmT即為食入到中國(guó)煤化工本試驗(yàn)采用SPS.5Levenberg- Marquardt algorithm模型估測(cè)閾值相對(duì)應(yīng)的得出公雞4個(gè):CNMHG分別為359.27231702、1386mgN/BWa,d母雞的分別為3452、2604、1501、1286mgN/BN仔出的楔型李數(shù)是估測(cè)氨基酸需要的前提而估測(cè)氨基酸需要主要以氮利用指數(shù)模型為基礎(chǔ)再由生產(chǎn)性能和日糧氨基酸利用率而定。這個(gè)程序?qū)?huì)在隨后的文章中得到進(jìn)一步的完善和應(yīng)用。關(guān)鍵詞氮維持需要生長(zhǎng)潛能氮沉積生長(zhǎng)雞漒白質(zhì)代謝模型原載予有款據(jù)1:mc20105421-12