第22卷第3期平原大學(xué)學(xué)報(bào)2005年6月Vol.22 No. 3JOURNAL OF PINGYUAN UNIVERSITYJune.2005RNA干涉技術(shù)鄧小莉(平原大學(xué)應(yīng)用生物系，河南新鄉(xiāng)453003 )摘要:RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的、序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，自1998年發(fā)現(xiàn)至今已有很大進(jìn)展。本文綜述了RNA干涉的分子機(jī)理及其應(yīng)用研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞: RNAi ;共抑制;功能基因組; dsRNA ; siRNA ;基因沉默中圖分類號:Q781文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1008一3944(2005)03- 0104- 06收稿日期:2005-02 - 28作者簡介:鄧小莉(1962-),女,副教授,主要從事遺傳學(xué)和作物育種學(xué)的研究。RNA干涉(RNA interference ,RNAi) 是指雙RNA和雙鏈RNA分別導(dǎo)入蟲體后，作為對照的鏈RNA(double一strand RNA , dsRNA)在細(xì)胞有義核酸，雖不能與活性基因或mRNA結(jié)合，卻內(nèi)特異性地誘導(dǎo)與之同源互補(bǔ)的mRNA的降解，同反義核酸有相似的阻抑效應(yīng)，與反義RNA技術(shù)使相應(yīng)基因的表達(dá)關(guān)閉,從而引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄后水平的傳統(tǒng)機(jī)制相違背;而令人驚奇的是,雙鏈RNA被沉默的現(xiàn)象。攝入機(jī)體細(xì)胞后，可特異性阻抑相應(yīng)同源基因的表1 RNAi的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展達(dá)，而且其效應(yīng)較單鏈RNA至少高2個數(shù)量級，1990年,RichJorgensen等人對矮牽牛(petu-這種現(xiàn)象被稱為RNAi[4。 由此就揭開了研究nias)進(jìn)行了研究,嘗試加深花朵的顏色。他們將一RNAi的序幕。個能產(chǎn)生色素(chalconesynthase)的基因前加上一人們在進(jìn)-步的研究中，相繼在植物5-6]、真?zhèn)€強(qiáng)的啟動子后,轉(zhuǎn)入矮牽牛中，結(jié)果沒有看到期待菌57]線蟲4、錐蟲[8]、渦蟲9]、果蠅[0]、水螅[1、小的深紫色花朵,多數(shù)花朵成了花斑甚至白色。因?yàn)槭骩12]和哺乳動物細(xì)胞[*](如人胚腎細(xì)胞Hela,細(xì)胞導(dǎo)入的基因和其內(nèi)源基因同時(shí)都被抑制.所以Jor-等)中都發(fā)現(xiàn)有這一現(xiàn)象。這說明RNAi可能是生gensen將這種現(xiàn)象命名為協(xié)同抑制“co-suppres-物體中存在的一種普遍現(xiàn)象，代表了一個古老的細(xì)sion”[1]。開始認(rèn)為這種現(xiàn)象是矮牽牛特有的,后來胞反應(yīng)通路。近幾年隨著研究的深入,已經(jīng)從多種發(fā)現(xiàn)在其他許多植物,甚至真菌中也有類似情況。生物中分離到參與RNAi的一些關(guān)鍵基因,對于1994年,Cojin把合成類胡蘿卜素的基因(albi-RNAi產(chǎn)生的基本機(jī)制有了比較深入的了解，同時(shí)no-1或albino-3)轉(zhuǎn)入野生型粗脈孢霉(Neurospo-發(fā)現(xiàn)RNAi與最初在植物中發(fā)現(xiàn)的共抑制(co-sup-racrassa),發(fā)現(xiàn)大約30%轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)源性al-1或pression),以及真菌中存在的基因壓制(qelling)al-3基因的表達(dá)水平反而大大減弱,當(dāng)時(shí)稱這種現(xiàn).現(xiàn)象具有相似的基本機(jī)制,因而現(xiàn)在也習(xí)慣于將其象為壓制“quelling"[2]。統(tǒng)稱為RNAi。最近發(fā)現(xiàn)dsRNA除了可以誘發(fā)1995年.美國康耐爾大學(xué)的研究人員Guo和RNAi之外,在生命活動中還有其他重要的生理功Kemphues等在研究秀麗隱桿線蟲par-l基因時(shí)能。因此,RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),已被認(rèn)為是近幾年生(par-1的失活會破壞線蟲的第--次卵裂的不對稱命科學(xué)研究中的重要成果。性)，發(fā)現(xiàn)反義RNA和有義RNA也有類似的阻抑中國煤化工子機(jī)制效應(yīng)，而兩者的作用竟是相互獨(dú)立的并且機(jī)制也不2.1MHCNMHG-樣[3。為了進(jìn)一步了解內(nèi)外RNA結(jié)構(gòu)及其引起盡管在不同的有機(jī)體內(nèi)有些細(xì)節(jié)上是不同的，.效應(yīng)差異的本質(zhì)，1998年Fire等在研究秀麗隱桿但RNAi的作用機(jī)制是高度保守的。其基本原理是線蟲基因沉默機(jī)制時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將反義RNA、有義將dsRNA裂解為21~25個核苷酸組成的小的干●104涉RNA ( SiRNA)以其作為介導(dǎo)子,引起相同序?yàn)榱姿峄?3'端為羥基,且有2個突出的單核苷酸的列特異性的mRNA的降解13]。21~23個核苷酸(由于Dicer差異,片段大小略有差2.2促使dsRNA裂解的酶別)的小片段。這些小片段RNA稱為小干涉RNA .促使dsRNA裂解的酶主要來自細(xì)胞中的核糖(small interfering RNA, siRNA)14。研究表明，核酸酶II家族(RNase II)。RNase III是目前已Dicer定位于胞漿，說明RNAi發(fā)生于自核內(nèi)移出后知的唯-能在特定位點(diǎn)降解dsRNA成固定長度片的成熟mRNA[15]?，F(xiàn)認(rèn)為21~23個核苷酸大小在段的核酸酶。RNase II按照結(jié)構(gòu)域的不同分為三3'末端帶有2~3個堿基(dTdT或UU)懸端的類:第一類為細(xì)菌的RNaseII,包括單一結(jié)構(gòu)域和siRNA誘導(dǎo)的RNAi效應(yīng)最強(qiáng)[16]。因?yàn)?1~23個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域;第二類是以果蠅為代表的核苷酸的RNA片段識別其同源互補(bǔ)序列的特異性Drosa家族核酸酶包括兩個RNase III結(jié)構(gòu)域和一最佳。如果短了會減弱siRNA的識別特異性,太長個dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域;第三類家族以線蟲則較易引起與靶序列的不完全匹配,擴(kuò)大了siRNAK12H4.8基因編碼的蛋白為代表,包括兩個攻擊靶目標(biāo)的范圍[17]。而3'懸末端則能增強(qiáng)基因RNase II結(jié)構(gòu)域、一個螺旋酶結(jié)構(gòu)域和一個PAZ沉默的效應(yīng)。此過程還有以下作用:siRNA還能增結(jié)構(gòu)域。其中第三類RNA酶，即Dicer家族,是加細(xì)胞內(nèi)小片段體積克分子濃度,使其有效擴(kuò)散;dsRNA特異性的核酸內(nèi)切酶,Dicer在進(jìn)化上高度Dicer酶將dsRNA降解成片段將不可逆的切斷病保守,廣泛存在于各種生物中[13]。毒基因組,因此排除了RNAi效應(yīng)能引發(fā)的病毒播2.3RNAi分子機(jī)制散的任何可能性;siRNA能與核酸酶有效的形成復(fù)近年來，雖然許多科學(xué)家運(yùn)用遺傳學(xué)和生物化合物,增加細(xì)胞內(nèi)小片段體積。學(xué)的方法來探索RNAi的機(jī)制,但RNAi是由dsR-2.3.2效應(yīng)階段NA誘導(dǎo)的多步驟、多因素參與的過程,其真正的機(jī)首先,生成的siRNA雙鏈結(jié)合一個核酸酶復(fù)合理尚未明了,可能分為以下幾個階段進(jìn)行(見圖1)。物,形成了RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),具有序列特異性的核酸內(nèi)a切酶活性,能特異性地降解與siRNA同源的靶mR-DicerNA。雖然核酸酶復(fù)合物與Dicer 共有PAZ區(qū),但實(shí)MDLAINDM驗(yàn)證明Dicer過程與RISC過程之間是獨(dú)立的18]。接著激活RISC,這是一個需要ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程,也是RNAi作用過程中消耗的第2個ATP。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mR-NA轉(zhuǎn)錄本上,siRNA變性,雙鏈解開,正義鏈與mR-RISCNA正義鏈互換,反義鏈?zhǔn)筊ISC與同源的靶目標(biāo).ActvatonmRNA結(jié)合,在核酸內(nèi)切酶的作用下,距siRNA 3'端by ATP12個堿基的位置將靶mRNA切斷,從而阻斷了該基m7GAAAAAAA因的表達(dá)。Target mRNA靶序列識別具有高度特異性，但并不是siRNAsubstrate反義鏈.上所有的堿基都對靶序列識別起相同的作用。由于降解過程首先發(fā)生在與siRNA相應(yīng)的中央位置,如果這些堿基位點(diǎn)發(fā)生錯配，就會阻止靶mRNA的降解。而5'末端對靶mRNA斷裂位點(diǎn)的決定性大于3'末端。此外,在引導(dǎo)RISC與靶mR-NA結(jié)合時(shí),3'末端倒數(shù)第2個堿基起了較為重要圖1 RNA1 作用機(jī)制的作中國煤化工錯配現(xiàn)象[151。2.3.1起始階段.3YHCNMHG當(dāng)雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)達(dá)一定量時(shí)，dsRNA與SIJ EN T等[1°]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中有些siRNA并非Dicer結(jié)合,形成酶一dsRNA復(fù)合體,在ATP作用來源于dsRNA的降解，而是直接源于細(xì)胞內(nèi),在下,Dicer先將dsRNA解旋,接著將其切割為5'端RNA介導(dǎo)的RNA聚合酶(RdRP)的作用下的●105●PCR反應(yīng),這個反應(yīng)以siRNA中的一條鏈為引物,3.6長度依賴性以靶mRNA為模板,擴(kuò)增靶mRNA,產(chǎn)生新的siR-大量資料顯示，長的dsRNA比短的dsRNA介NA亞群(secondary siRNA ,也稱為二級siRNA)，導(dǎo)的RNAi更有效,但是這種活性作用與dsRNA二級siRNA表現(xiàn)出明顯的極性(反義鏈5'至3')。長度的增加之間沒有嚴(yán)格的正比關(guān)系21.27-28]。而這些二級siRNA又能繼續(xù)反作用于靶mRNA，RNAi對dsRNA長度的依賴性可能是細(xì)胞內(nèi)RNA令其降解1720。這是一個RNAi的循環(huán)擴(kuò)增過程，分子間局部堿基互補(bǔ),形成較短的dsRNA后避免解釋了為什么在線蟲中很小劑量的dsRNA就能誘由此而引起異常RNAi的重要基礎(chǔ)。發(fā)強(qiáng)烈的基因沉默效應(yīng)。4 RNA 干涉的功能及應(yīng)用目前進(jìn)-步研究植物中siRNA在轉(zhuǎn)錄后基因RNAi是生物體在進(jìn)化中形成的-種內(nèi)在基因沉默和各種形式轉(zhuǎn)錄水平沉默中的功能。發(fā)現(xiàn)siR-表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。就目前的研究來看,RNAi的功NA可能不僅誘導(dǎo)同源mRNA被核酸內(nèi)切酶破壞，能和應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾個方面:且可誘導(dǎo)核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變或DNA的甲基4.1病毒防御化[13]。RNAi具有抑制外源基因入侵的功能。最早在3RNAi的分子生物學(xué)特性轉(zhuǎn)基因矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的PTGS現(xiàn)象可以說是該功3.1高特異性能最有力的證據(jù),正是由于外源基因的誘導(dǎo)才有白RNAi的最大特點(diǎn)就在于高特異性。dsRNA色矮牽牛的出現(xiàn)。同時(shí),RNAi還有抑制病毒入侵特異地抑制干擾RNA同源序列的靶基因表達(dá)，而的作用.有研究表明在植物葉子，上接種病毒可以使對不相關(guān)序列的表達(dá)無干擾作用,這是由siRNA的接種部位周圍的細(xì)胞免疫?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)動物病毒可反義鏈與mRNA同源區(qū)互補(bǔ)配對所決定的21-22]。編碼一個RNA干擾的抑制子,支持關(guān)于在動物中siRNA除正義鏈3'端的兩個堿基在序列識別中不RNAi可能具有抗病毒功能的概念。從共同進(jìn)化起主要作用外,其他單個堿基改變就可能使RNAi的角度來分析,說明RNAi也具有抗病毒功能。在失效,而針對同源基因共有序列的RNAi則導(dǎo)致同哺乳動物中的研究發(fā)現(xiàn)大于30bp的dsRNA能激源基因共同失活([23]。發(fā)干擾素誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，盡管這一過程是非特3.2高速性異性的，但它同樣證實(shí)RNA i的抗病毒作用。Da-Yang等[24] 將dsRNA注入細(xì)胞后10分鐘即可vid等研究也發(fā)現(xiàn)RNAi是-種古老的抗病毒機(jī)制,產(chǎn)生siRNA ,30 分鐘內(nèi)其靶mRNA水平可下降30它可能在轉(zhuǎn)錄后水平抵抗病毒感染[29]。倍左右。4.2抑制轉(zhuǎn)座子移動的功能3. 3高穩(wěn)定性在c. elegans中,參與RNAi的基因發(fā)生突變,siRNA分子是3'端有突出的非配對堿基的雙將直接導(dǎo)致其傳代系中多種轉(zhuǎn)座子元件的激活,說鏈分子，在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3~4天，半衰期遠(yuǎn)明RNAi具有抑制轉(zhuǎn)座子在子代基因組中重組擴(kuò)散長于反義寡聚核苷酸451;另外,RNAi還具有對靶的功能[530]。mRNA的切割位點(diǎn)準(zhǔn)確和高穿透性等。4.3調(diào)節(jié)基因表達(dá)3.4高效性目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣泛存在于生物內(nèi)的siR-只需少量dsRNA的引入便可抑制濃度是幾倍NA/miRNA主要通過兩種方式直接調(diào)節(jié)基因表達(dá):甚至幾十倍的mRNA的降解41。許多生物學(xué)和1)通過與靶mRNA3'UTR結(jié)合抑制其翻譯;遺傳學(xué)證據(jù)發(fā)現(xiàn)RNAi過程有新的siRNA合成,這2)通過RNAi途徑降解靶mRNA。也有證據(jù)種合成是以mRNA為模板,以siRNA為引物,在表明內(nèi)源siRNA可以通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的凝集而調(diào)RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下產(chǎn)生新的節(jié)基因表達(dá):a.裂殖酵母中的內(nèi)源siRNA可以介dsRNA.dsRNA再被切割為21-23nt的小片段,繼導(dǎo)著絲粒區(qū)的染色質(zhì)凝集,從而使凝集區(qū)的基因發(fā)續(xù)發(fā)揮靶向降解目的mRNA作用,使RNAi能長時(shí)生轉(zhuǎn)錄水平的沉默。b. 植物中dsRNA可以通過與間存在并保持較高效能[26]。啟中國煤化工導(dǎo)致基因沉默31。3.5可傳播性和遺傳性4.4:MYHCNMHGRNAi的效應(yīng)不僅僅局限于單個細(xì)胞內(nèi)，還可RdRP可以催化細(xì)胞內(nèi)的畸變RNA轉(zhuǎn)變成.在細(xì)胞之間相互傳遞和維持效應(yīng)，甚至可以傳遞給dsRNA,后者進(jìn)入RNAi途徑被降解。子一代([25]?！?064.5參與基因組重排技術(shù),一次設(shè)計(jì)并注射多個基因的dsRNA ,則可以在四膜蟲接合(conjugation)過程中,siRNA可實(shí)現(xiàn)對多個基因的沉默;能通過與染色體上的特異序列的結(jié)合導(dǎo)致染色體的2)可對多基因家族的功能進(jìn)行研究:傳統(tǒng)方法斷裂和DNA的缺失,這一過程可能與重組區(qū)域組不能有效地對多基因家族進(jìn)行敲除，RNAi技術(shù)則蛋白的甲基化有關(guān)[31]。可以利用同一基因家族的多個基因的高度保守序4.6用于基因組功能研究列,設(shè)計(jì)針對這一保守序列的dsRNA ,注射這一隨著越來越多生物全基因組序列的公布，了解這dsRNA分子即可產(chǎn)生多基因家族中多個基因同時(shí)些基因在生長和發(fā)育中的作用越來越受到人們的關(guān)剔除的表型;注。人類已進(jìn)入后基因組時(shí)代,需要大規(guī)模高通量的3)方法簡單、方便:dsRNA分子既可通過基因研究基因的功能。由于RNAi能高效特異的阻斷基轉(zhuǎn)化，也可通過注射，甚至喂飼轉(zhuǎn)錄dsRNA的細(xì)菌因的表達(dá),因而RNAi成為研究基因功能的很好的強(qiáng)將dsRNA轉(zhuǎn)入到目標(biāo)生物中，得到高效的RNA干有力工具。例如: Fraser等和Gonczy等構(gòu)建了1個涉表型,而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在線蟲第1.第2號染色體上基因的細(xì)菌文庫,用表達(dá)目標(biāo)生物發(fā)育的任意時(shí)期327dsRNA的細(xì)菌喂飼線蟲幼蟲,分別使第1染色體上4.7用于生物遺傳改良90%.第2染色體上96%基因沉默，通過表型分析RNAi方法在植物遺傳及發(fā)育等研究領(lǐng)域同樣和序列分析,了解了第1染色體上13.9 %的基因功得到了廣泛的用。A rabidop sis thaliana 是植物遺能,識別了許多染色體動力學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、特異轉(zhuǎn)錄和傳和發(fā)育研究領(lǐng)域很重要的模式生物，Cioppa等人信號傳導(dǎo)所需基因以及第2染色體上133個在早期用煙草的mosaic病毒導(dǎo)入了幾千種不同的遺傳序胚胎發(fā)育不同階段所需要的基因。列,系統(tǒng)地進(jìn)行基因敲除來篩選有用的性狀，如抗Hanazawa等將RNAi與SSH技術(shù)相結(jié)合,研病或耐旱。Gutterson 等人敲除了康乃馨的一種激究與線蟲精子發(fā)育相關(guān)的基因。他們將具有差異表素,使花期延長。多聚半乳糖醛激酶在西紅柿成熟達(dá)的168克隆cDNA通過PCR擴(kuò)增,再用T3RNA時(shí)消化細(xì)胞壁，Zenera 實(shí)驗(yàn)室將它敲除后，西紅柿多聚酶和T7RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄分別轉(zhuǎn)錄成dsR-可晚一些采摘，味道變得更為鮮美NA,然后,將dsRNA分別注射到線蟲的內(nèi)腸中,分4.8用于基因治療,抑制有害基因的表達(dá)析各個體的表型。鑒定了15個引起個體不育的基從理論上講，針對有害基因序列設(shè)計(jì)dsRNA,因,其中8個與卵子發(fā)育有關(guān),3個涉及到卵母細(xì)胞將dsRNA導(dǎo)入生物體內(nèi)或讓dsRNA在生物體內(nèi)發(fā)育，4個與精子發(fā)育相關(guān)。Misuitta等通過注射轉(zhuǎn)錄,利用dsRNA引發(fā)其同源內(nèi)源有害基因的nautilus dsRNA于果蠅胚胎中,發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)型與沒mRNA序列的降解,從而可達(dá)到抑制該有害基因表有nautilus表達(dá)的細(xì)胞表型相似，肌肉不能形成,從達(dá)的目的532]。而確立了nautilus在果蠅胚胎肌肉形成中的功4.9用于緩解或消除腫瘤能[58]。與此同時(shí),哺乳動物中非特異性RNAi效應(yīng)大多數(shù)腫瘤的發(fā)生與基因改變有關(guān),主要表現(xiàn)的克服和新型表達(dá)載體的問世,將RNAi技術(shù)用于在癌基因的突變、擴(kuò)增、過度表達(dá)以及抑癌基因的突哺乳動物的基因功能的研究推上了應(yīng)用的前沿。當(dāng)變、失活等方面。傳統(tǒng)技術(shù)誘導(dǎo)的單個癌基因的阻前,利用RNAi技術(shù),人們已在多種哺乳動物細(xì)胞斷往往不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的生長,因(CHO、Hela、293、293T、T細(xì)胞)中成功地降低此也很難達(dá)到預(yù)期的治療效果,而RNAi技術(shù)則不( Knockdown)了靶基因的表達(dá),這些被降低了的基同,它能夠同時(shí)抑制多個不同的基因,而且抑制效果因范圍廣泛,既有結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因,也有催化蛋白互不干擾。RNAi可以利用基因家族中多個基因具編碼基因,而靶基因降低的幅度則高達(dá)85%一有-段同源性很高的保守序列這-特性,針對這一99 %[33]區(qū)段序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的dsRNA分子,dsRNA分子產(chǎn)利用RNAi進(jìn)行基因功能研究具有許多傳統(tǒng)方生方式可以采取體外人工化學(xué)合成和構(gòu)建在體內(nèi)表法所不具備的優(yōu)點(diǎn):達(dá)中國煤化工< short harpin RNA .1)高效性:RNAi引起相應(yīng)基因沉默的頻率比shR:fYHC N MH G只需要注射一種dsR-傳統(tǒng)的方法要高出10倍甚至上百倍;同時(shí),傳統(tǒng)的NA分子即可產(chǎn)生多個基因同時(shí)剔除的表現(xiàn);當(dāng)然.基因敲除技術(shù)和DNA/RNA嵌合分子介導(dǎo)的基因也可以同時(shí)注射多種dsRNA而將多個序列不相關(guān)轉(zhuǎn)變技術(shù)，一次只能研究一個基因，而利用RNAi的基因同時(shí)剔除[55]。4.10用于信號傳導(dǎo)通路的研究versible co-suppression of homologous genes in trans綜合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可[J]. plant cell. 1990,(2) :279 - 289.以確定復(fù)雜信號傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)[2] JORGENSEN R A，CLUSTER P D，NAPOLICA.Chalcone synthase co一suppression phenotypes in petu系。Clemensy等應(yīng)用RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中nia flowers : comparison of sense vs. antisense constructs胰島素信號傳導(dǎo)途徑,取得了與已知胰島素信號傳and single - copy vs. comeplex T - DNA sequences[J]. .導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上他們還分析了Plant Mol B ol, 1996 ,(31):957- 973.DSH3PX1與DACK之間的關(guān)系，證實(shí)了DACK[3] 雷迎峰. RNAi研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶[31]。[J]， 2002 , 24 (4) : 196-199.4.11藥物篩選[4] Fire A，XuS，Montgomery MC et all Potent and spe-cific genetic interference by doublestranded RNA inRNAi在藥物開發(fā)中也大有作為,可作為鑒定.Caenorhabditis elegans ，Nature , 1998，391 : 806-藥物靶位及藥物篩選的工具。RNAi極大地縮短了811.從鑒定靶基因到認(rèn)識其功能的時(shí)間,促進(jìn)了藥物發(fā)[5] Waterhouse P M, Graham M w, Wang M B1 Virus re-現(xiàn)過程中對已知靶基因功能的高通量分析。已有人sistance and gene silencing in plants can be induced by將RNAi技術(shù)與基因表達(dá)譜相結(jié)合,用于藥物特異simultaneous expression of sense and antisense RNA1性及其作用機(jī)制的評估,以期在藥物開發(fā)過程中能Proc Natl Acad Sci USA，1998 ，95 : 13959 - 13964.[6] Vander KrolA R，F(xiàn)lavonoid genes in petunia : addition較快地鑒定出更好的侯選分子[33]。of a limited number of gene copies may lead to a sup-5展望pression of gene expressionl Plant Cell，1990，2，291雖然傳統(tǒng)的功能基因篩選方法能產(chǎn)生可保存的突變體，但基因定位克隆又慢又費(fèi)力。而基于[7] Cogoni G, Macino G1 Gene silencing in Neurospora cas-RNAi篩選的優(yōu)點(diǎn)(尤其是細(xì)菌文庫的優(yōu)點(diǎn))，它將sa requires a protein homologous to RNA- dependentRNA polymerase1Nature，1999 ,339 : 166- 169.會被越來越多地使用。在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用siR-NA的報(bào)道雖不多，但也證明siRNA具有特異性抑[8] Ngo H，Tschudi C，Gull Ket all Double - strandedRNA indeuces mRNA degradation in Trypanosoma bru-制基因表達(dá)的作用。已有證據(jù)表明siRNA介導(dǎo)的ceil Proc Natl Acad Sci USA，1998 ，95 : 14687RNAi能特異性抵御病毒等病原生物的入侵，拮抗14692.植物腫瘤發(fā)生作用。RNAi 技術(shù)作為反向遺傳學(xué)技[9] Sanchez 一Alvarado A，Newmark P A，Double術(shù)已經(jīng)越來越受到廣泛的重視，解決了技術(shù)上的難stranded RNA specifically disrupts gene expression dur-題，RNAi技術(shù)便可以用于產(chǎn)生大量的缺陷型個ing planarian regenerationl Proc NatlAcad Sci USA1999 , 96 : 5049- 5054.體，并對大量的表型突變體進(jìn)行分析，從而更進(jìn)-[10]Pal - Bhadra U , BirchlerJ A . Cosuppression of non-步運(yùn)用到研究果蠅體內(nèi)許多基因，特別是一些看守homologous transgenes inDrosophila involves nutuallyu基因的研究以及更為深層的組織系統(tǒng)如神經(jīng)系統(tǒng)等related endogenous sequences ,Cell ，1999，99 : 35-的研究。RNAi和siRNA的發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一種新的功能基因組研究策略，可見RNAi在后基因組時(shí)代[11] LohmannJ U，EndlI，Bosch T C，Silencing of de-velopmental genes inHydral Dev Biol，1999 , 214 :規(guī)模性基因功能研究中具有廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)211-214.還有可能研究出基于RNAi的基因治療藥物。盡管對RNAi的研究有一個良好的開端，但還[12] Wianny F，Zernicka G M1 Specific interference withgene function by doublestranded RNA in early是有大量的問題有待科學(xué)家們?nèi)ソ獯?。如在?xì)胞漿mouse developmentlNat Cell Biol ,2000 ，2(2) :70內(nèi)發(fā)生的、轉(zhuǎn)錄后的RNAi是否與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄沉默一75有某種聯(lián)系，RNAi是否與轉(zhuǎn)錄水平相偶聯(lián)，RNA[13]岳楓,馬文麗，鄭文嶺、RNAi的不同沉默機(jī)制及其應(yīng)逆向信息傳遞反作用于DNA，生命的信息是否起用[J].生物技術(shù)通報(bào),2004,(3):5-7.源于RNA,如何更有效地將siRNA導(dǎo)入哺乳動物[14] NICHOLSON R H ,NICHOLSON A W. Molecular char-中國煤化Iencoding Dicer ,a ribonucle-細(xì)胞，進(jìn)行基因功能研究以及疾病基因治療。DHCNMH G. interference[J] . 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Evidence thatTechnology of RNA InterferenceDENG Xiao-li(Department of applied Biology, Pingyuan University, Xinxiang, Henan 453003 China)Abstract : RNA interference (RNAi) is the process of sequence- specific post- transcriptional gene si-lencing in animals and plants initiated by double-stranded RNA (dsRNA). It advanced at a miraculous pacesince it was discovered in 1998. Here the mechanism and application of RNAi are reviewed.Key words: RNA interference; co- suppression; functional genomics; double- stranded RNA ( dsR-NA); small interfering RNA (siRNA); gene silencing.中國煤化工MHCNMHG