軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊2005年8月第29卷第4期Bull Acad Mil Med Sci , Aug 2005 ; Vol 29 No4333聚乙二醇不同修飾度對水蛭素活性和半衰期的影響于愛平,劉玉英,蔣中華,董春娜,鐘根深,吳祖澤(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所北京100850 )[摘要]目的通過優(yōu)化聚乙二醇( PEG )對水蛭素的化學(xué)修飾反應(yīng)條件得到具有生物學(xué)活性、半衰期延長的修飾產(chǎn)物。方法通過改變化學(xué)反應(yīng)中聚乙二醇與水蛭素的比例獲得不同修飾度的產(chǎn)物;采用SDS-PAGE分析產(chǎn)物的修飾度;TH發(fā)色底物法分析聚乙二醇修飾前、后水蛭素的活性;用凝膠過濾層析對水蛭素的PEG修飾產(chǎn)物進(jìn)行分離純化采用部分活化凝血酶時(shí)間( APTT )鑒定PEG修飾水蛭素在動物體內(nèi)延長半衰期的效果。結(jié)果化學(xué)反應(yīng)中PEG與水蛭素摩爾比超過3:1時(shí)水蛭素被修飾后抗凝活性明顯下降。凝膠過濾層析方法分離得到不同修飾程度的水蛭素?；钚苑治霰砻鬟B接1個(gè)和2個(gè)聚乙二醇分子的水蛭素保持了原有活性并可不同程度地延長體內(nèi)半衰期連接3個(gè)以上PEG的水蛭素活性明顯降低。結(jié)論通過控制PEG對水蛭素的修飾反應(yīng)條件,得到了具有生物學(xué)活性、體內(nèi)半衰期延長的修飾產(chǎn)物。[關(guān)鍵詞] 水蛭素聚乙二醇化學(xué)修飾半衰期[中圖分類號] R973.2[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1000-5501( 2005 )04-0333-04Effect of pegylation degree on activity and half-life of hirudinYU Ai-Ping ,LIU Yu-Ying ,JIANG Zhong-Hua , DONG Chun-Na , Zhong Gen-Shen , WU Chu-tse .( Institute of Radiation Medicine , Academy of Military Medical Sciences , Beiing 100850 ,China )[ Abstract ] Objective :To obtain the optimal reaction condition for pegylation of hirudin in order prolong half-life of hir-udin in vioo by pegylation. Methods : The pegylated products were isolated by gel filtration chromatography. Chromogenicsubstrate TH was used to analyze the special activity of hirudin with different pegylation degree. Activated partial thrombintime( APTT ) of rabbit serum was analyzed to identify the half-life of hirudin in rivo. Results :The activity of the pegylatedmixture decreased dramatically when the ratio of PEG us hirudin exceeded 3: 1. The activities of pegylated hirudins linkedwith 1 or 2 PEG were well retained but that with 3 PEG obviously attenuated. The half-lives of hirudins with different pegy-lated degree were prolonged to different extents. Conclusion : Under the optimization of modified conditions , two pegylatedhirudins with prolonged half life were obtained without activity loss.[ Key words ] hirudin ; polyethylene glycols ; chemical modification ; half-life隨著生物技術(shù)的發(fā)展,蛋 白類藥物的發(fā)展非常迅速,但不均一性產(chǎn)物的活性也隨之不同。因此研究合適的修飾是其進(jìn)入臨床應(yīng)用的速度和效果并不理想。其中重要的原反應(yīng)條件和分離純化方法得到活性較高的、能夠延長體內(nèi)因包括小分子蛋白類藥物在體內(nèi)的半衰期較短需要反復(fù)半衰期的蛋白修飾產(chǎn)物具有重要意義。注射或長時(shí)間滴注用藥量大患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重許多蛋白水蛭素( hirudin )是一相對分 子質(zhì)量約7 x 10*的小分子類藥物對于人體來說屬于異源蛋白進(jìn)入人體后容易引起免蛋白質(zhì),可以通過與凝血酶的特異性結(jié)合而直接抑制凝血酶疫反應(yīng)。所以研發(fā)安全、長效的蛋白類藥物的緩釋、控釋劑的活性被認(rèn)為是-種新型的抗凝和抗栓藥物用于血栓相型成為蛋白類藥物發(fā)展的一個(gè)重要方向。采用一些高分子關(guān)性疾病的治療和預(yù)防如冠狀動脈成形術(shù)后再栓塞的治療材料對蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要手段之和預(yù)防、治療急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛等3。但水蛭-。近年來聚乙二醇polyethylene glycol PEG )是被廣泛用素在體內(nèi)半衰期只有1 ~2 h臨床用藥量較大。用PEG對于蛋白類藥物化學(xué)修飾的材料之一。PEG 修飾后的蛋白具水蛭中國煤化工半衰期降低用藥量減少有不易被蛋白水解酶降解、不易被腎小球?yàn)V過等優(yōu)點(diǎn)，從而用藥CNMHG還可降低長時(shí)間大量給使蛋白修飾產(chǎn)物的體內(nèi)半衰期延長。同時(shí)PEG對蛋白抗原表位的物理屏障作用使蛋白的免疫原性和抗原性下降或[收稿日期] 2004-12-27消除2。目前用于修飾蛋白的PEG的種類較多不同活化.[基金項(xiàng)目]國家973"計(jì)劃基金資助項(xiàng)目( 2002CB713804 )形式的PEG對蛋白質(zhì)的不同基團(tuán)有一定的選 擇性,但對蛋[作者簡介]于愛平( 1972- )女山東省海陽市人在讀博士白分子內(nèi)同一種奧的多個(gè)基團(tuán)的修飾具有隨機(jī)性產(chǎn)物存在334軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊2005年8月第29卷第4期藥引發(fā)的免疫反應(yīng)。M,(x103)4本研究旨在優(yōu)化PEG修飾水蛭素的連接反應(yīng)條件建53立反應(yīng)產(chǎn)物的分離純化方法探討PEG修飾對水蛭素半衰36期的影響。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明修飾產(chǎn)物的生物學(xué)活性得到了24保留,體內(nèi)半衰期得到了延長。1材料與方法1.1 材料mPEG-SPA購自Shearwater 公司(相對分子質(zhì)量5 x .103 ) ;水蛭素為本實(shí)驗(yàn)室提供純度達(dá)95%以上凝膠過濾圖1各 反應(yīng)條件下PEG修飾水蛭素的SDS-PAGE層析介質(zhì)Superdex 75購自Amersham公司;TH發(fā)色底物購1.蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2.水蛭素3. PEG:水蛭素=1:1 A. PEG:水蛭素=3:1 5. PEG:水蛭索=5:1 ;自Roche公司部分活化凝血酶時(shí)間( APTT )試劑盒購自太6. PEC:水蛭素=10:1陽生物技術(shù)公司其他藥品為分析純;所有水溶液均用Milli-pore超純水系統(tǒng)生產(chǎn)的超純水配制。1.2 mPEG-SPA 偶聯(lián)水蛭素的反應(yīng)表1不同反應(yīng) 條件下各產(chǎn)物的比活性分析水蛭素溶于硼酸緩沖液( pH 9.0 )中,分別按mPEG-PEG:水蛭素比活性<( ATU/mg水蛭素)SPA:水蛭素摩爾比1:1 3:1 5:1和10: 1的比例稱取mPEG-10:1686SPA室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h。5:11 0771.3 SDS-PAGE3:110 102參照文獻(xiàn)4 ],15%的分離膠5%積層膠采用氯化鋇.1:117 348和碘液對PEG進(jìn)行染色水洗后再對蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)水蛭素17 339染色。1.4 活性測定參照文獻(xiàn)5]采用TH發(fā)色底物法。31.5 凝膠過濾層析2取水蛭素: mPEG-SPA摩爾比1:1的反應(yīng)產(chǎn)物上凝膠過濾層析柱(Superdex75,2.6cmx90cm),洗脫液為0.05mol/L的磷酸緩沖液pH7.0流速為2ml/min檢測波S長為214 nm。當(dāng)客米1.6 動物體內(nèi)半衰期實(shí)驗(yàn)雄性新西蘭大白兔,體重2.5~3 kg按水蛭素1 mg/kg體重耳緣靜脈給藥在給藥前給藥后10 min 30 min 1.5 h,2.5h3.5h和4.5h股靜脈取血0.109mol/L枸櫞酸鈉抗020406080100120140160凝離心取血漿按試劑盒說明測部分活化凝血酶時(shí)間。洗脫時(shí)間(t/min)2結(jié)果圖2凝膠過濾層析圖( pH =9.0 PEG:水蛭素=1:1 )2.1反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析1. PEG3-水蛭素2. PEG2-水蛭素3. PEG1-水蛭素4.水蛭素;取各反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE結(jié)果見圖1。由圖中可5.琥珀酰亞胺等小分子看出每種反應(yīng)條件下的產(chǎn)物均為多個(gè)組分的混合物按每56分子水蛭素連接PEG數(shù)目的多少分別記為:PEG1-水蛭素,PEG2-水蛭素,PEG3-水蛭素,PEG4-水蛭素和PEG5-水蛭素。M,(.x 103)本文采用的氯化鋇和碘液染色方法是專-對PEG進(jìn)行染色著色深淺與PEG的量呈正相關(guān)而與蛋白量無關(guān)。24 -2.2 反應(yīng)產(chǎn)物的活性分析以原料水蛭素為對照對各反應(yīng)條件下的修飾產(chǎn)物按等中國煤化工摩爾數(shù)進(jìn)行比活性分析結(jié)果見表1。MYHCNMHG2.3 凝膠過濾層析及各組分活性分析由表1看出反應(yīng)中mPEG-SPA與水蛭素摩爾比為1:1圖3凝膠過濾 層析各洗脫峰SDS-PAGE的修飾產(chǎn)物活性保持良好,因此取該產(chǎn)物上Superdex 75柱,1. 蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2.水蛭素3. PEG:水蛭素色譜圖見圖2、盆別收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE和活性分=1:1反應(yīng)產(chǎn)物斗洗脫峰3 5.洗脫峰2 B.洗脫峰1析結(jié)果分別見圖3和表2。第4期于愛平等.聚乙二醇不同修飾度對水蛭素活性和半衰期的影響335表2凝膠過濾層析各 洗脫峰比活性分析481.28%分離組分比活性( ATU/mg水蛭素)PEG3-水蛭素5 85012.0PEG2-水蛭素17 908PEG1-水蛭素17 3008.2水蛭素17 4546.1 11.17%2.75% .4.8%由各組分的SDS-PAGE結(jié)果和活性分析表明峰1、2.3、2.0火4分別是連接3.2.1個(gè)PEG分子的水蛭素和反應(yīng)中剩余的0.水蛭素峰5既無抗凝活性在蛋白電泳中也未見染色可能100.0120.0140.160.0是反應(yīng)中產(chǎn)生的琥珀酰亞胺等小分子物質(zhì)。各組分活性測t/min定結(jié)果表明PEG2-水蛭素和PEG1-水蛭素活性保持較好而圖5凝膠過濾層析圖( pH7.5 PEG: 水蛭素=1:1 )PEG3-水蛭素活性明顯下降。1. PEG3-水蛭素2. PEG2-水蛭素3. PEG1-水蛭素A.水蛭素2.4動物體內(nèi)半衰期實(shí)驗(yàn)結(jié)果由于PEG3-水蛭素的活性明顯降低所以只取PEG2-x<蛭素和PEG1-水蛭素進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)考察了水蛭素及其PEG56. 89%修飾產(chǎn)物對APTT的影響。與水蛭素相比,PEG1-水蛭素和PEG2-水蛭素可不同程度地使APTT延長當(dāng)水蛭素組APTT27.67%10.0恢復(fù)至基礎(chǔ)值后,PEG1-水蛭素組和PEG2-水蛭素組APTT8.0.仍分別為基礎(chǔ)值的1.4倍和1.6倍這表明這兩種修飾產(chǎn)物6.0|的體內(nèi)半衰期得到不同程度的延長。結(jié)果見圖4。4.0-◆-.水蛭素1.13%250-部PEG1-水蛭素).0 |-▲PEG2-水蛭素-2.0100120140160180圖6凝膠過濾層析圖( pH9.0 PEG:水蛭素=0.5:1 )501. PEG3-水蛭素2. PEG2-水蛭素3. PEG1-水蛭素4水蛭素50 100 150 200 250 300本研究中的重組水蛭素2其N端是抗凝活性功能區(qū)，為其活性所必需水蛭素分子有6個(gè)半胱氨酸殘基,形成3圖4 PEG 修飾水蛭索對APTT的影響對二硫鍵;每分子水蛭素中共有4個(gè)賴氨酸,分別位于24、27.35和47位其中47位賴氨酸對維持其空間構(gòu)象具有重2.5 PEG偶聯(lián)反應(yīng)條件的優(yōu)化要意義[8。因此我們選擇了專-修飾賴氨酸側(cè)鏈氨基的活由于PEG1_水蛭素和PEG2-水蛭素較好地保持了原有.化PEC mPEG-SPA )與水蛭素偶聯(lián)盡管該種PEG對賴氨酸活性并可延長水蛭素的體內(nèi)半衰期,因此提高PEG1-水蛭側(cè)鏈氨基有-定的選擇性,但當(dāng)PEG過量時(shí)少量的PEG仍素和PEG2-水蛭素的轉(zhuǎn)化率降低PEG3-水蛭素的產(chǎn)率具有可與末端氨基發(fā)生偶聯(lián)。為得到有活性的PEG修飾產(chǎn)物,重要意義。研究表明減少PEG與蛋白的比例以及降低反本實(shí)驗(yàn)對偶聯(lián)反應(yīng)條件進(jìn)行了較為系統(tǒng)研究,反應(yīng)中PEG應(yīng)的pH可降低PEG的偶聯(lián)率(0]。為此我們對偶聯(lián)反應(yīng)的的用量可明顯影響其產(chǎn)物活性。當(dāng)PEG用量增加( PEG與條件進(jìn)行了如下改變:①反應(yīng)中PEG與水蛭素摩爾比保持水蛭素摩爾比>3: 1 )時(shí)產(chǎn)物活性明顯下降。主要原因是水1:1 而pH降至7.5②反應(yīng)中pH保持9.0 ,PEG與水蛭素蛭素的修飾度隨反應(yīng)中PEG的比例增加而增加,水蛭素是摩爾比降至0.5:1。反應(yīng)產(chǎn)物上Superdex75柱進(jìn)行凝膠過小分子蛋白偶聯(lián)過多的PEG分子可能物理性遮蔽水蛭素濾層析結(jié)果分別見圖5和圖6。的活性區(qū)影響與凝血酶的結(jié)合表現(xiàn)為水蛭素活性下降其次隨著被pEC偶聯(lián)的賴氣酸數(shù)日的增多，越來越多的水蛭3討論素的中國煤化工政其空間構(gòu)象不穩(wěn)定或發(fā)目前用于修飾蛋白質(zhì)的活化PEG種類較多,可以根據(jù)生改YHCN MH G可能隨著PEC的增多賴蛋白質(zhì)本身的特點(diǎn)和要求選擇不同種類的活化PEG例如,氨酸側(cè)鏈氨基逐漸被PEG偶聯(lián)飽和后,PEG 可能會與N端專-性修飾肽鏈的N端氨基半胱氨酸的巰基賴氨酸的側(cè)的a-氨基發(fā)生偶聯(lián)使其活性喪失。鏈氨基等7。所選擇被修飾的基團(tuán)必須是蛋白質(zhì)功能的非為進(jìn)-步研究偶聯(lián)PEG的數(shù)目對水蛭素活性的影響，必需基團(tuán)唇廁轉(zhuǎn)專致蛋白質(zhì)活性下降甚至完全喪失。我們采用凝膠過濾層析的方法對保持了原有活性的反應(yīng)產(chǎn)336軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊2005年8月第29卷 第4期物PEG:水蛭素為1:1 )進(jìn)行了分離純化得到了3種修飾.[參考文獻(xiàn) ]度的產(chǎn)物其中PEG1-水蛭素和PEC2 -水蛭素較好地保持了原有活性而PEG3-水蛭素活性明顯下降。通過降低反應(yīng)的[1 ] Nakaoka R ,Tabata Y ,Yamaoka T ,et al. Prolongation of the ser-pH值偶聯(lián)率顯著降低，未發(fā)生偶聯(lián)的水蛭素占81. 28% ,um half-life period of superoxide dismutase by poly( ethylene gly反應(yīng)產(chǎn)物中PEG3-水蛭素的量相對增多而PEG1 _水蛭素和col ) modifcaio[ J ].J Control Release ,1997 A6(3 ) 253 -261.PEG2-水蛭素的量相對減少其原因可能是隨著pH的降低，[ 2 ] Katre NV. Immunogenicity of recombinant IL-2 modified by cova-lent atachment of polyethylene gyco[ J ] J Immunol ,1990 ,144mPEG-SPA的水解增加,而氨解的選擇性降低。通過降低反(1) 209 -213.應(yīng)中PEG的相對用量明顯降低了產(chǎn)物中PEG3-水蛭素的含I 3 ] Glusa E. Pharmacology and therapeutie applications of hirudins a量,PEG1-水蛭素和PEG2-水蛭素的含量相對增高。盡管由new anticoagulan[ J] Kidney Int Suppl ,1998 64 :s54 -56.于反應(yīng)中PEG量的減少水蛭素的轉(zhuǎn)化率降低(剩余水蛭素[4 ] Kurfirst MM. Detection and molecular weight占50%以上)但這些水蛭素可回收再利用。因此,我們在lyethylene glycol-modifed hirudin by staining after sodium dodecyl減少PEG用量的基礎(chǔ)上使PEG1-水蛭素和PEG2水蛭素的sulfate-polyaerylamide gel electrophoresis[ J ] Anal Biochem ,相對轉(zhuǎn)化率得到了提高,降低了產(chǎn)物中PEG3-水蛭素的含1992 200(2)244 -248.量。[5 ] Griessbach U , Surebecher J , Markwardt F. Assay of hirudin in在保證水蛭素原有活性的前提下延長修飾產(chǎn)物的半衰plasma using a chromnogenie thrombin substate[ J ] Thromb Res期是本研究的重要目的之- -。有研究表明反映抗凝效果的1985 37(2 ) 347 -350.常用生化指標(biāo)中凝血酶原時(shí)間(PT)因?qū)λ嗡貪舛茸兓痆6] ZalipskyS ,lee C. Poly( ethylene glycol ) chemisty : bitechnics不敏感不能很好地反映水蛭素在體內(nèi)的代謝情況;而凝血and ppication[ M] Harris JM ,Ed. NY :Plenum , 1992.酶時(shí)間( TT )對其變化又過于敏感其線性變化區(qū)域很窄;[7] Roberts MJ ,Bentley MD ,Haris JM. Chemistry for peptide andprotein pegylatior[ J] Adv Drug Deliv Rev 2002 ,54( 4 ) :459 -APTT能在較寬范圍內(nèi)反映水蛭素的代謝狀況線性關(guān)系較476.好9]。因此我們選用檢測給藥后APTT的變化作為反映體8] Rydel TJ ,Tulinsky A , Bode W. Refined structure of the hirudin-內(nèi)水蛭素半衰期變化的指標(biāo)。thrombin comple[J]. J Mol Biol ,1991 221(2 ) 583 -601.本研究表明,PEC1-水蛭素和PEC2-水蛭素可不同程度[9] Schenk JF , Glusa E , Radziwon P ,et al. A recombinant hirudin地延長水蛭素在體內(nèi)的有效作用時(shí)間其體內(nèi)半衰期較水蛭( IK-HIR02 ) in healthy vlunteers. I. Effects on coagulation parame-素有所延長并且通過反應(yīng)條件的優(yōu)化提高了PEG1-水蛭ters and bleeding time[ J ]. Haemostasis ,996 2(3 ) 140 - 149.素和PEG2-水蛭素的轉(zhuǎn)化率。由此我們得到了活性保持良(本文編輯 姜曉舜)好、半衰期延長的PEG修飾的水蛭素產(chǎn)品使其有可能成為一種新的抗凝藥物的緩釋劑。(上接第308頁)lated protein-1 in cultured osteoblast[ J ] Endocrinology , 1999[ 20] Ellis MJ , Jenkins S , Hanfelt J ,et al. Insulin-like growth factors140( 1 )228 -232.in human breast cancer[ J ]. Breast Cancer Res Treat ,1998 ,52[25 ] Ahmed S , Yamamoto K ,Sato Y , et al. Proteolytic processing of( 1-3):175 - 184.ICFBP-related protein-1 ( TAF/ angiomodulin/ mac25 ) modulates[21] Hu YF ,MiyakeT ,YeQ et al. Characterization of a novel trans-its biological activity[ J ] Biochem Biophys Res Commun 2003 ,activation domain of BRCA1 that functions in concert with the310(2) 612 -618.BRCAI C.temina( BRCT ) domair{J] J Biol Chem ,0000 ，[26] Wixlerv ,Gets D，aplatine E ,e al. The LM-oly protein275( 52 ) :40910 - 40915.DRAL/FHL2 binds to the cytoplasmic domain of several alpha[22] 丁麗華張京生周圍等胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7and beta integrin chains and is recruited to adhesion complexes基因的克隆和表達(dá)[ J ]生物技術(shù)通訊2003 ,14( 4 ) 282 -[ J]J Biol Chem ,2000 ,275( 43 ):33669 - 33678.284.[27] Wilson EM ,0h Y ,Hwa V ,et al. Interaction of ICF-binding pro-[23] Oh Y , Nagalla SR , Yamanaka Y ,et al. 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