第35卷第2期溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報Vol.35 No.22005 年4月Journal of Wenzhou Medical CollegeApr.2005綜述疆RNA干擾技術(shù)俞富軍，陳永平(溫州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染內(nèi)科，浙江溫州325000)[關(guān)鍵詞] RNA干擾; 基因沉默;雙鏈RNA[中圖分類號]R 459.5[文獻標識碼] B [文章編號] 1000-2138 (2005) 02- 0168-03在基因治療領(lǐng)城里，繼反義RNA、核酶和三鏈DNA基本作用模式最近得到實驗證明。技術(shù)之后，現(xiàn)在又掀起了RNA干擾技術(shù)，這項技術(shù)在第一種模式: Dicer和Sicer依賴模型。這種是2002年度里榮登美國著名“科學(xué)”雜志評選出的世界十人們用果蠅胚胎細胞及培養(yǎng)細胞s2作為研究對象發(fā)現(xiàn)大科技進展之榜首，現(xiàn)將有關(guān)RNA干擾技術(shù)作一一介紹。的，它主要包括四個步驟:①長的雙鏈RNA在導(dǎo)入細胞后首先被剪切為長度21 ~25個核苷酸的雙鏈RNA分子，1 RNA 干擾的定義和發(fā)展即小干擾RNA，在這一步驟中，Dicer 參與對雙鏈RNA .RNA干擾是指一種雙鏈RNA分子在mRNA水平上關(guān)的剪切作用。②小干擾RNA與一種蛋白復(fù)合物相結(jié)合，閉相應(yīng)序列基因的表達使其沉默的過程,是- -種序列特這種蛋白復(fù)合物含有一個小干擾RNA分子和一個蛋白核異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。1995年康奈爾大學(xué)郭博酸酶分子。目前這種酶分子已被分離出來，有人將它命士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲par21基因表達時意外發(fā)名為Sl1icer.③在小干擾RNA的指導(dǎo)下，蛋白復(fù)合物現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象川。給對照實驗組線蟲注射正義RNA,產(chǎn)形成了一種有活性的RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物。④在生與反義RNA同樣的結(jié)果一特異性阻斷 該基因的表達，少量或沒有ATP參與的情況下,基因沉默復(fù)合物識別與這一與反義RNA技術(shù)傳統(tǒng)認知相矛盾的現(xiàn)象直到1998小干擾RNA具有同源互補序列的靶mRNA，并對靶mRNA年才有了新的解釋。卡耐基研究院Fire等發(fā)現(xiàn)，正義進行剪切而產(chǎn)生RNA干擾作用。RNA和過去反義RNA對基因表達的阻斷都是由體外轉(zhuǎn)錄第二種模式:隨機降解PCR模式。這種模式的作用制備RNA中污染的微量雙鏈RNA所引起[2。將制備的RNA機制與一種名叫RNA依賴性RNA聚合酶有關(guān)。RNA依賴高度純化后發(fā)現(xiàn)，正義RNA無基因抑止作用，反義RNA性RNA聚合酶不僅可以擴增雙鏈RNA，同時也可以擴增的基因抑止作用也很弱;而用純化后的雙鏈RNA注射線小干擾RNA。隨機降解PCR模式的作用機制是: RNA依賴蟲，卻能高效、特異地阻斷相應(yīng)基因地表達。此后，又性RNA聚合酶利用小干擾RNA鏈作為引物，以靶mRNA作在果蠅、錐蟲、渦蟲、無脊椎動物、脊椎動物、植物和為模板來合成新的雙鏈RNA。合成的雙鏈RNA分子被哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。Dicer水解。被Dicer水解釋放出的新的小干擾RNA又可以作為引物指導(dǎo)新- ~輪的雙鏈 RNA的合成和降解。人2 RNA 干擾的作用機制們在果蠅、真菌、線蟲等細胞內(nèi)均檢測到這種RNA依賴近年來研究發(fā)現(xiàn)，小干擾RNA是RNA干擾作用賴以性RNA聚合酶的活性，但在人類細胞中還未見有類似報發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。小干擾RNA具有特征性結(jié)構(gòu)，道41。即長約21~25個核苷酸的特殊雙鏈RNA分子;小干擾3 RNA干擾的特點RNA的序列與所作用的靶序列具有同源性;小干擾RNA兩條單鏈末端為5，端磷酸和3，端羥基;每條單鏈的跟傳統(tǒng)的基因治療技術(shù)相比, RNA干擾在基因功能3，端均有2~3個突出的非配對的堿基@。和相關(guān)“ 中國煤化工優(yōu)勢。RNA干擾確切的作用機制目前還不是很清楚，兩種.8.1粗MH的反義鏈和正義鏈對介導(dǎo)CcNM H G連所起的作用尚不清楚。收稿日期: 2004-03-30作者簡介:俞富軍(1975-),男，浙江紹興人，住院醫(yī)師，碩士生。3.2特異性RNA 干擾最顯著的特征就是只引起與雙-168一第35卷俞富軍，等: RNA干擾技術(shù)第2期.鏈RNA同源的mRNA降解，而對其他無關(guān)基因的表達不小功能研究。其中雙鏈RNA合成成本很高，雙鏈RNA轉(zhuǎn)影響。入宿主細胞效率以及其在宿主細胞中的穩(wěn)定性及RNA干3.3 高效性無論是在體內(nèi)還是體外實驗中，僅需少擾作用效率均不確定。②體外轉(zhuǎn)錄法。這種方法采用量的雙鏈RNA就能有效地抑止靶基因表達，抑止效率在I7RNA聚合酶，以先合成的DNA鏈為模板分別轉(zhuǎn)錄合成低等動物中大于90%，這表明雙鏈RNA介導(dǎo)的RNA干擾正義和反義RNA，將正義和反義RNA混合，再經(jīng)退火復(fù)是一個以催化放大的方式進行的●性得到雙鏈RNA,從而使臺成雙鏈RNA的成本大大降低，3.4 雙鏈RNA長度限制性 引發(fā)有效RNA干擾的雙鏈但這種方法與化學(xué)合成方法有相同的缺點.③體內(nèi)載體RNA最短不得短于21個堿基，而且長的雙鏈RNA也在細合成法。這是由P atrick等首先報道的利用載體在細胞內(nèi)被Dicer酶切割為21個堿基左右的小干擾RNA，并胞體內(nèi)穩(wěn)定地表達siRNA從而抑制哺乳動物細胞靶基因由小干擾RNA來介導(dǎo)mRNA切割。表達的方法0.11。其基本思路如下:細胞內(nèi)存在RNA聚3.5 可傳播性RNA干擾有一種令人驚奇的跨越細胞合酶II，它可以識別U6啟動子，從而使啟動子后的基界限的能力，在果蠅細胞中可在細胞群落之間傳播。在因轉(zhuǎn)錄成RNA，當模板連續(xù)出現(xiàn)3~5個T堿基時，轉(zhuǎn)錄線蟲中可在局部注射雙鏈RNA而傳播到整個機體問。就會終止。根據(jù)這一機制，可以設(shè)計一種能表達RNA的3.6 ATP依賴性 在去除ATP的樣品中，RNA千擾現(xiàn)象質(zhì)粒，其組成包括四個部分: a.常用質(zhì)粒的基本序列。降低或消失，表明RNA干擾是一個ATP依賴的過程。b、U6啟動子，位于克隆位點的上游。C、克隆位點。d3.7轉(zhuǎn)錄后水平的 基因沉默機制注射 該基因的內(nèi)含RNA千擾模板序列。這部分序列具有如下特點:含RNA子或者啟動子順序的雙鏈RNA都沒有千涉效應(yīng)，翻譯抑干擾序列，對哺乳動物而言通常為21~23個核苷酸;制劑對RNA干擾也不產(chǎn)生影響。發(fā)卡結(jié)構(gòu)環(huán)狀部分，通常有4~7個核苷酸;靶序列的反向互補序列: 3~5個核苷酸T.將具有如上結(jié)構(gòu)的質(zhì)4 RNA 的實驗技術(shù)及其進展粒導(dǎo)入細胞內(nèi)，體內(nèi)的RNA聚合酶I就可以合成- - 條4.1小干擾 RNA序列設(shè)計方法在基因庫中 尋找靶向RNA鏈，這條RNA鏈可以通過兩端的21個左右的核苷酸基因mRXA序列，并從基因編碼序列的起始密碼子開始反向互補特性而形成發(fā)卡樣雙鏈結(jié)構(gòu)，從而起到基因抑向下游尋找腺苷二核苷酸，標記并選擇每個腺苷二核苷制作用。這種技術(shù)操作簡便，使用成本低，與直接導(dǎo)入酸及其下游鄰近的19個核苷酸序列--起作為mRNA的靶小干擾RNA相比，DNA質(zhì)粒更易導(dǎo)入細胞內(nèi)，而且質(zhì)粒序列。在設(shè)計小干擾RNA的過程中，要避開mRNA的5'導(dǎo)入細胞后存在時間長且穩(wěn)定，對靶基因的表達抑制效和3’非編碼區(qū)以及5'起始密碼區(qū)附近50~100個核苷率高，便于進行較長時間的基因功能研究，因而近日來酸的序列，因為在這些區(qū)域含有豐富的蛋白結(jié)合位點，成為一種熱門技術(shù)。結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白以及形成的翻譯起始復(fù)合物等可以影響4.3 RNA干擾技術(shù)存在的問題 目 前RNA干擾機制尚RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合到靶mRNA上間。為了選擇合適未完全闡明，尤其在哺乳動物細胞中的報道不多，小千的小干擾RNA靶序列,必須將上述包括腺苷二核苷酸在擾RNA在哺乳動物細胞中抑制mRNA表達是有效的，但內(nèi)的21個核苷酸的序列，根據(jù)實驗對象的不同,選擇不并不能像在果蠅細胞中那樣完全抑制目的基因的表達，同基因組數(shù)據(jù)庫進行全基因組描和序列同源分析，確可能是因為生物體是一個復(fù)雜的系統(tǒng),存在多種機制相保選擇的小干擾RNA序列與基因組中其他基因至少存在互作用以調(diào)控基因的表達。另外在哺乳動物中RNA干擾3個以上的堿基不同，同時在進行小干擾RNA或雙鏈RNA能否成功地抑制基因表達以及其抑制的程度還取決于細序列設(shè)計時要盡量沿靶基因序列多設(shè)計幾個不同序列，胞類型。對線蟲來說可以采用注射、浸泡或喂食的方法通過轉(zhuǎn)染細胞選出效果最好的序列，因為對于mRNA的轉(zhuǎn)入雙鏈RNA，而對哺乳動物來說，尋找高效的方式來.不同區(qū)域序列同源的小干擾RNA產(chǎn)生的RNA干擾的效率轉(zhuǎn)入小干擾RXA以及快速的方式來篩選RNA干擾尚需進是不同的。最后根據(jù)已經(jīng)設(shè)計的21個反義RNA序列合成-步 探索。RSA干擾在病毒感染中的應(yīng)用令人振奮，但2條RNA鏈，在其二鏈的3’末端最后2個核苷酸設(shè)計合中國煤化工A發(fā)生作用，有些病毒成dTdT序列，以減少細胞內(nèi)降解。靶YHCNMHG&者位于高度折疊的區(qū)4.2 小干擾RNA合成方法 ①體外化學(xué)合成方法。最域中，而有些病毒序列可能與蛋白質(zhì)形成緊密的復(fù)合為經(jīng)典的方法，共分四個步驟: a、化學(xué)合成雙鏈RNA。物，阻礙了與小千擾RNA的識別。因此不僅要選擇合適b、將雙鏈RNA導(dǎo)入宿主細胞.c、檢測靶基因抑制效率。的靶序列，而且需要反復(fù)試驗。為了克服這個障礙，所-169一第35卷溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報第2期選病毒RNA的靶序列必須是高度保守的，或者設(shè)計幾對有專家認為RNA干擾現(xiàn)象的研究，可能是未來十年小干擾RNA同時作用于病毒。再者還需要注意有些病毒生物學(xué)領(lǐng)域中最激動人心，也最有可能產(chǎn)生豐富成果的會產(chǎn)生較多的代謝產(chǎn)物，也可以影響小千擾RNA抗病毒領(lǐng)域之-。盡管目前RNA干擾技術(shù)在哺乳動物中的應(yīng)用的效果。還處于探索階段,但它在斑馬魚和老鼠胚胎等脊椎動物中的成功應(yīng)用，預(yù)示RNA干擾將成為疾病尤其是腫瘤基5 RNA干擾研究的應(yīng)用 前景因治療中重要的組成部分，人工合成的雙鏈RNA寡聚藥5.1 研究基因功能的新工具在對基因組進行功能分析物的開發(fā)將可能成為極具發(fā)展前途的新興產(chǎn)業(yè)。時，需要對特定基因進行功能喪失或降低突變，以確定參考文獻: .其功能。由于RNAi具有高度的序列專- -性，可沉默特異基因，因此被視為功能基因組研究的有力工具。Kamath[11 Guo S,Kemphues KJ.Par-I ,a gene required for establishingpolarity in C.elegans embryos,encodes a putative SerThr等用RNAi抑制蠕蟲基因組中19427個基因中的86%，鑒kinase that is asymmetrically distributed [J]. Cell, 1995, 81定了1722個基因的突變亞型，其中有2/3的表型以往(4):611-620.未曾被注意門。同法抑制16757個編碼蛋白質(zhì)的預(yù)言基[21 Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al. Potent and specific genetic因，其中許多基因與人類同源，如50%以上的蠕蟲脂肪interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans調(diào)節(jié)基因在哺乳動物中有同源基因，對其進行研究將有[].Nature,1998,3916669): 806 -811.助于發(fā)現(xiàn)人類肥胖相關(guān)基因固,進而治療肥胖或其相關(guān)[3] Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,et al.RNAi:double-strandedRNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at21 to疾病。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入23 nucleotide intervals []. l.l,00010(1):25- 33.少、周期短、操作簡單等優(yōu)勢，近來RNA干擾成功地用[4Pal- Bhadra M,Bhadra U,Birchler JA,et al.RNAi related mec-于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多，標志著RNA干hanisms affect both transcriptional and posttranscriptional擾將成為研究基因功能不可缺少的工具。transgene silencing in Drosophila [J.Mol Cell,2002, 9(2) :315- 327.5.2 研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑 聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNA干擾技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信[5Caplen NJ,Fleenor J.,Fire A.et al.DsRNA-mediated gene si-lencing in cultured Drosophila cells: a tsse culture model號傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系。Clemensy 等應(yīng)for the analysis of RNA itrerenecelJ.ene.2000252(1-用RNA干擾研究了果蠅細胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑，2):95- 105.取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果，在[61McManus MT, Sharp PA. Gene silencing in mammals by small此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與DACK之間地關(guān)系，證實了interfering RNAs[J].Nat Rev Genet,2002,3(10):737-747.DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶9。RNA干擾技[7Kamath RS,Fraser AG,Dong Y,et al.System atic functiongalanalysis of the caenorhabditis elegans genome us ing RNAi術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實驗簡單、快速，重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)[]. Nature,2003, 42(6920):231-237.染實驗中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點，[8] Ashrafi K,Chang FY,Watts JL,et al.Genome wide RNAi ana-因此認為RNA干擾技術(shù)將可能成為研究細胞信號傳導(dǎo)通lysis of caenorhabditis elegans genome using RNAilI].路的新途徑。Nature,2003, 421(6920):268-272.5.3 開展基因治療的新策略RNA干擾具有抵抗病毒入[9] Moris JC.Wang Z.Drew ME,et al.Glycolysis modulates try-panosome glycoprotein expression as revealed by an RNAi侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、防止自私基因序列過量增殖等作library[].EMBO J,2002.21(17):4429- 4438.用，因此可以利用RNA千擾現(xiàn)象抗擊人類致病病毒。丙{101 Randall G,Grakoui A,Rice CM.Clearance of replicating型肝炎病毒是慢性肝病和肝細胞癌的主要致病因子,hepatitis C virus replic on RNAs in cell culture by smallRandall等以NSSB為靶位點合成siRNA轉(zhuǎn)染Huh7細胞，interfering RNAs [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(1):235- 240.發(fā)現(xiàn)HCV RNA表達下降80倍101。Kapadia 等以非結(jié)構(gòu)Kapadia SB,Brideau Andersen A,.Chisari FV. Interference區(qū)為靶位點合成7個siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細胞，發(fā)of hepatits C virus RNA replication by short interfering現(xiàn)NS3和NS5B的mRNA水平下降21倍和23倍，有效地中國煤化工,1004):2014-2018.抑制了病毒復(fù)制川。本文編輯:胡苗苗)“YHCNMHG-170-