棕櫚殼發(fā)酵制取燃料乙醇的研究王瓊1,2,莊新姝1,張字12,徐明忠12,許敬亮,李東2,袁振宏1(中國科學(xué)院廣州能源研究所,中國科學(xué)院可再生能源與天然氣水合物重點實驗室廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點實驗室廣東廣州,510640)2(中國科學(xué)院研究生院,北京,100039)摘要嘗試?yán)?Cadida shehatae ATcc34887、 Saccharomyces cerevisiae2.20251和 Saccharomyces cereus3株酵母功菌發(fā)酵棕櫚殼的高溫液態(tài)水水解液和纖維素晦水解液?；藿庖号c高溫液態(tài)水水解液相比,發(fā)酵較容易,乙醇產(chǎn)率最高達(dá)到理論產(chǎn)率的70%面水解液發(fā)酵仍有許多工藝問題值得研究探討關(guān)鍵詞棕櫚殼,發(fā)酵,燃料乙醇使用燃料乙醇作為車用化石燃料替代品已經(jīng)很糖濃度為4.42g/L,大部分為木糖。第2步,將水解普遍。燃料乙醇是最直接、使用量最大的液體燃料,液中和脫毒然后取部分濃縮液用于種子液培養(yǎng)和發(fā)通過生物質(zhì)原料,如玉米、木材來制備它是各國研究酵,其余部分同殘渣一起進行酶解(纖維素酶購自的一大熱點,而利用棕櫚殼制備目前少有研究。棕櫚 Sigma公司,加酶量為15FPU/g,溫度50℃,水解12是一種重要的經(jīng)濟作物,在東南亞、南美洲、非洲的很h,糖濃度基本穩(wěn)定)得到纖維素酶水解液(以下簡多國家都有種植在我國廣泛分布于長江以南大部分稱酶解液),測得其還原糖濃度為28.06g/L,葡萄糖地區(qū)。由其果實制得的棕櫚油是世界油脂市場的重約占80%。具體的原料處理流程見圖1要組成部分121,而油脂生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量棕櫚粽櫚殼原料殼尚未得到有效利用。本文初涉棕櫚殼水解制乙醇高溫高壓液態(tài)水水解領(lǐng)域,選擇使用休哈塔假絲酵母來發(fā)酵棕櫚殼的水解中和脫毒后的水解液液,同時利用3個菌株來發(fā)酵其酶解液,對糖利用情部分液體殘渣部分十剩余液體況、乙醇產(chǎn)率等進行了研究,為棕櫚殼燃料乙醇的生濃酶水解液產(chǎn)打下基礎(chǔ)液相部分殘渣部分1原料及其處理方法木糖發(fā)酵己糖發(fā)酵圖1棕櫚殼原料的基本處理流程圖通過范式分析的方法得出棕櫚殼含有豐富的用掃描電鏡觀察棕櫚殼原料和實驗殘渣的微觀纖維素和半纖維素資源。幾種常用的木質(zhì)纖維素原結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)原料呈現(xiàn)沿徑向條狀紋路;水解渣顯料,如小麥稈、稻稈、硬木、軟木,其纖維素含量(質(zhì)量示沿徑向的纖維條有碎裂,質(zhì)地開始疏松;酶解殘渣分?jǐn)?shù))在30%~40%,半纖維素含量在25%顯示良好的破裂情況,纖維條有序排列但是彼此連35%而棕櫚殼的纖維素含量高達(dá)442%,半纖接松散。這表明高溫液態(tài)水水解和纖維素酶水解都維素含量也較高(21.74%),有利于產(chǎn)糖發(fā)酵。在不同程度上改變了棕櫚殼原料的結(jié)構(gòu),通過范式分棕櫚殼原料的處理主要分2步。第1步,將粉碎析發(fā)現(xiàn),半纖維素轉(zhuǎn)化率(質(zhì)量分?jǐn)?shù))達(dá)到90%,纖維后的棕櫚殼過40目篩,105℃烘干至恒重,然后用高素轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%說明確實產(chǎn)生了大量的糖用于溫高壓液態(tài)水水解的方法(20℃,4.0MPa,液固比發(fā)酵。15:1,攪拌轉(zhuǎn)速500r/min)得到水解液,測得其還原2實驗方法第一作者:讀碩士研究生(袁振宏為通訊作者)國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2007AA0524062.12007AA100702);中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重大項目(KSCX1-YW-11);中國科學(xué)院廣州能源研究所所長創(chuàng)新基金中國煤化工酵木糖能力5~。,人才引進專項(06076510607681001)故本CNMHG Cadida shehatae收稿日期:2008-04-11,改回日期:2008-06-04(ATCC34887,以下簡稱1號酵母,購自中國工業(yè)微28年第斗4卷9順(總需2期)65食品與發(fā)醉工 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES生菌種保藏中心)來發(fā)酵水解液,同時將其和釀酒酵條件下進行馴化培養(yǎng),測OD值考察其是否到達(dá)對數(shù)母 Saccharomyces, cereuisiae2.20251(以下簡稱2號生長期酵母,由首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供)、釀酒酵母2.3.3種子培養(yǎng)Saccharomyces, cerevisiae(以下簡稱3號酵母,由華馴化培養(yǎng)42h后,1號酵母進入對數(shù)生長期,將南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系提供)一起發(fā)酵酶解5mL菌液接種到15mL水解液種子培養(yǎng)基中,于液30℃,130~135r/min培養(yǎng)60h2.2培養(yǎng)基活化培養(yǎng)的1、2、3號酵母各5mL接種到102.2.1活化培養(yǎng)基(g/L)mL酶解液種子培養(yǎng)基,于30℃靜置培養(yǎng)60h。葡萄糖30,酵母粉10,蛋白胨5,麥芽浸膏10,2.3.4發(fā)酵pH5.0~5.5,115℃滅菌30min。水解液種子培養(yǎng)基按接種量10%接種到30mL2.2.2馴化培養(yǎng)基(g/L)水解發(fā)酵液中,發(fā)酵在50mL帶透氣塞的三角燒瓶木糖30,酵母粉10,蛋白胨5,麥芽浸膏10,pH中進行,條件是30℃,130~135r/min。此為1號發(fā)5.0~5.5,105℃滅菌20min酵液2.2.3種子培養(yǎng)基3份酶解液種子培養(yǎng)基同樣按接種量10%分別2.2.3.1水解液種子培養(yǎng)基接種到30mL酶解發(fā)酵液中,發(fā)酵在50mL密閉的過中和脫毒處理:用Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH為三角瓶中進行,條件是30℃,靜置發(fā)酵。此為2、3、410.0,過濾去除沉淀;加熱煮沸10min,補充水到原號發(fā)酵液。來刻度;活性炭吸附,1g/L,80min1以上發(fā)酵液均每隔一定時間取樣,測定糖濃度和取部分水解液微沸濃縮,使得還原糖濃度為乙醇濃度,進而計算得到乙醇產(chǎn)率10.05g/L,向15mL培養(yǎng)基中加入2g/L酵母提取2.4分析方法物,3g/L蛋白胨,3g/LKH2PO4,0.3g/L尿素,2.4.1乙醇產(chǎn)率分析0.3g/LCaC1,0.3g/ L MgSO4作為營養(yǎng)物10用 agilent6820氣相色譜儀分析發(fā)酵液中乙醇用稀HCl調(diào)節(jié)pH為酵母發(fā)酵pH,約5濃度。測定條件:初始溫度40℃,最高溫度250℃,升5.5。105℃滅菌20min,存儲待用。溫速率10℃/min,平衡時間1min,進樣量1L。乙2.2.3.2酶解液種子培養(yǎng)基醇產(chǎn)率計算公式:將剩余的水解液和水解殘渣進行酶解,獲得還原X/%100糖濃度2806g/L的酶水解液。向3份各10mL酶解液培養(yǎng)基添加營養(yǎng)物(如上所述)。105℃滅菌20式中:X為乙醇產(chǎn)率%;C1為乙醇濃度,g/L;min,存儲待用。C2為總還原糖濃度,g/L;N為計量系數(shù),發(fā)酵己糖2.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基N=0.51;發(fā)酵木糖,N=0.46。配制方法如種子培養(yǎng)基所示。水解發(fā)酵液302.4.2糖濃度分析mL,1份;酶解發(fā)酵液30mL,3份,存儲待用。采用3,5二硝基水楊酸(DNS)法測定水解液2.3培養(yǎng)方法酶解液和發(fā)酵液中的還原糖含量。2.3.1活化培養(yǎng)用高效液相色譜儀( Waters600HPLC)測定樣品將冷凍保存的1、2、3號酵母用無菌水制成菌懸中葡萄糖和木糖的含量。測定條件:進樣為 Waters液,于活化培養(yǎng)基中活化,條件為30~32℃,100r/717自動進樣器,配有 Waters410示差折光儀和min。其中,2、3號酵母活化2d;1號酵母活化10h增 Waters Sugar Pak I柱;流動相:重蒸水流速:1.1殖后取部分轉(zhuǎn)入馴化培養(yǎng)基(為發(fā)酵水解液做準(zhǔn)備),mL/min;柱溫:90℃;進樣量:1oμL;0.22μm濾膜過其余繼續(xù)活化(發(fā)酵酶解液)。濾后上高效液相色譜測定。2.3.2馴化培養(yǎng)9×10-6X休哈塔假絲酵母必須經(jīng)過一定的馴化和種子液中國煤化面積培養(yǎng)才能提高其代謝木糖產(chǎn)乙醇的能力112,因此CNMHG10-6X取部分活化后的1號酵母于30~32℃,100r/min的Y為木糖濃度(g/L),X為峰面積。662008vo34No9( (Total249)生產(chǎn)與科研經(jīng)驗量死亡1,3結(jié)果和討論3號發(fā)酵液的乙醇產(chǎn)率呈拋物線趨勢,最大值約3.1水解液脫毒情況為57%,出現(xiàn)在24~36h。采用過中和脫毒的方法處理水解液。一些抑制4號發(fā)酵液的乙醇產(chǎn)率也呈拋物線趨勢,最大值物在高pH值變得不穩(wěn)定,過中和可以去除部分酮可達(dá)到70%,出現(xiàn)在12~24h。這說明3號酵母發(fā)類、糠醛;加熱法可減少揮發(fā)性抑制劑的濃度,使水解酵酶解液產(chǎn)乙醇的能力優(yōu)于2號酵母液的可發(fā)酵性增強;活性炭吸附可去除小分子化合物3.3可發(fā)酵糖分析的干擾,比如苯酚和乙酸)。但本實驗中發(fā)現(xiàn),該法如圖3所示,除去6h時的不佳數(shù)據(jù),1號發(fā)酵液使得水解液糖濃度有一定損失(減少約50%),并且中還原糖含量只是略有降低這和它較低的乙醇產(chǎn)率木糖損失多于葡萄糖,原因可能是活性炭吸附了較多是相當(dāng)?shù)?可見休哈塔假絲酵母利用木糖發(fā)酵仍然是的糖,所以活性炭是否需要添加以及其用量需要再探需要探索的步驟。索。通過HPLC發(fā)現(xiàn),中和脫毒前后各產(chǎn)物峰的變化不大,說明中和脫毒并未起到應(yīng)有的作用,這是棕櫚殼水解液的獨有現(xiàn)象還是其他原因,需在今后實驗中進一步研究。3.2乙醇產(chǎn)率分析40各發(fā)酵液中乙醇產(chǎn)率隨時間的變化情況如圖2所示。發(fā)酵6h時,1號發(fā)酵液的乙醇產(chǎn)率達(dá)到最高122436值10.05%隨后變化緩慢,略呈下降趨勢。主要原因可能是該酵母種子液馴化程度不夠,未完全開發(fā)其◇—1號發(fā)酵液;-△-2號發(fā)酵液利用木糖產(chǎn)乙醇的能力;另外可能因為水解發(fā)酵液脫-3號發(fā)酵液;-□—4號發(fā)酵液圖3發(fā)酵液中還原糖剩余率隨時間的變化毒不夠、成分復(fù)雜,不利于1號酵母的生長,使其難以2號發(fā)酵液糖濃度始終變化不大,這和其他文獻(xiàn)利用糖分。報道的休哈塔假絲酵母有較好的利用葡萄糖能力相悖,如前所述,有可能因為1號酵母不能耐受高濃度乙醇而死亡,值得進一步研究。3、4號發(fā)酵液均取得了良好的發(fā)酵效果,還原糖(主要成分是葡萄糖)濃度迅速減少。在24h后,2種發(fā)酵液殘?zhí)堑陌俜致驶痉€(wěn)定,可能僅剩釀酒酵母不能利用的某些糖4結(jié)論◇1號發(fā)酵液;-△-2號發(fā)酵液-3號發(fā)酵液;-口4號發(fā)酵液(1)利用3種不同菌株來進行棕櫚殼水解液和酶2發(fā)酵液中乙醇產(chǎn)率隨時間的變解液的發(fā)酵研究。其中S. cerevisiae和S. cerevsiae2號發(fā)酵液的發(fā)酵效果同樣不理想,乙醇產(chǎn)率2.20251發(fā)酵酶解液產(chǎn)乙醇的能力都較高(以還原糖基本為2.58%。2號發(fā)酵液的總還原糖濃度計,乙醇的最高產(chǎn)率分別達(dá)到了70%和57%),而(28.06g/L)遠(yuǎn)大于1號發(fā)酵液(10.05g/L),但其乙 Cadida shehatae發(fā)酵水解液和酶解液的效果均不理醇產(chǎn)率不及1號,說明休哈塔假絲酵母在水解發(fā)酵液想(乙醇的最高產(chǎn)率只有10.05%和2.58%)中確實利用了部分木糖。休哈塔假絲酵母通常先利(2)實驗數(shù)據(jù)表明, Cadida shehatae經(jīng)過一定的用葡萄糖然后再幾乎同時利用半乳糖、甘露糖、木馴化后縣有發(fā)酵水解液產(chǎn)乙醇的能力。但是仍然需糖11,然而2號發(fā)酵液中,該酵母在葡萄糖等己糖要進中國煤化工 dida shehatae代占絕對優(yōu)勢的環(huán)境中不能正常發(fā)酵極可能是在活化謝木棚CNMHG,最終使其能夠適培養(yǎng)或者種子液培養(yǎng)時因不能耐受高乙醇濃度而大應(yīng)水解液復(fù)雜的環(huán)境,產(chǎn)出更多的乙醇208年第34卷第9期(總第24)67食品與發(fā)酵工業(yè) FOOD AND FERMENTATION INDUS(3)實驗中,2種不同酵母發(fā)酵酶解液均取得良Pachysolen tannophilus, Candida shehatae and Pichia sti好效果,說明采取已有的發(fā)酵工藝來發(fā)酵棕櫚殼酶解ri[J. Industrial Microbiology and Biotechnology,液,可行可靠1990,6:157~164(4)棕櫚殼的纖維素含量和半纖維素含量都較7 du jC Preez, Prior B A, Aida M T Monteiro. The effectof aeration on xylose fermentation by Candida shehatae高,在乙醇生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。and Pachysolen tannophilus[J]. Applied Microbiology and參考文獻(xiàn)Biotechnology, 1984, 19(4): 261-2668李素玉,陳新芳,田沈,等.木質(zhì)纖維素酒精發(fā)酵菌種的1金青哲,鄭耀坤.國際棕櫚油產(chǎn)品的新進展[刀].糧油食品篩選[門.太陽能學(xué)報,2003,24(2):218~220科技,2007,15(2):599錢明宇,楊秀山燃料酒精生產(chǎn)中對木質(zhì)纖維素稀酸水解2程黔后期棕櫚油市場何去何從[].糧食與油脂,2007,液的脫毒處理[]太陽能,2005,(2):49(8):37~3910曹軍衛(wèi),馬輝文.微生物工程[M].北京:科學(xué)出版社,3薛惠琴,杭怡瓊,陳誼,等.稻草秸桿中木質(zhì)素、纖維素測定2006.82~84方法的研討[].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2001,(2):1511余世良,羅廉,李杰,等.休哈塔假絲酵母對半纖維素4朱錫鋒生物質(zhì)熱解原理與技術(shù)[M].合肥:中國科學(xué)技術(shù)戊糖和己糖的同步發(fā)酵[].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè).1991,11大學(xué)出版社,2006.28(1):185 Delgenesa J P, Molettaa R, Navarro J M. 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Applied Microbiology and BiotechnolFermentation of hardwood hemicellulose hydrolysate byogy,1986,23:228~233Research on Fuel Ethanol Production from Palm ShellsWang Qiong,2, Zhuang Xinshu, Zhang Yu'Xu Mingzhong,2, Xu Jingliang, Li dong,2, Yuan Zhenhong1( Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences; Key Laboratory of Renewable Energy and Gas HydrCAS: The New and Renewable Energy Key laboratory of guangdong Province, Guangzhou 510640, China)2( Graduate School of Chinese Academy of sciences, Beijing 100039, China)aBSTRacT Compared with other cellulosic biomass from agricultural and forest residue, the ratio of cellu-lose in palm shells is rather high, meaning that the palm biomass has a good application prospect in the areaof fuel ethonal production. Choosing the high temperature liquid water hydrolysate and the cellulase hydrolysate from palm shells as fermentation materials, we studied ethanol production by using Cadida shehataeATCC 34887, Saccharomyces cerevisiae 2. 20251 and Saccharomyces cerevisiae. It was found that in compari-son with high temperature liquid water hydrolysis, the fermentation from cellulase hydrolysate has the advantage of simplicity and better efficiency, with the highest yield rate of ethanol of 70%. There are still manytechnical issues to be addressed in the fermentation from high temperature liquid water hydrolysate.Key words palm shells, fermentation, fuel ethanol中國煤化工CNMHG682008vo34No.9( Total249)