中圃奠科大學(xué)學(xué)報142Journal of China Pharmaceutical University 2012 ,43(2):142 - 146喜樹堿-聚乙二醇前藥的合成及體內(nèi)外釋藥特性徐蓓華",周惠燕(浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,寧波315100)摘.要為提高喜樹堿(CPT)在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性,合咸喜樹堿聚乙二醇葡藥。以聚乙二醇為原料,經(jīng)過端基活化，與喜樹堿20-位痊基反應(yīng)得到目標(biāo)化合物(6a6e),分別用IR.'H NMR對化合物6a6e進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。用HPLC法測定化合物6a6e在磷酸緩沖液(pH 7.4)中釋教的喜樹堿濃度，以及大鼠血漿中釋放的喜樹堿濃度。結(jié)果表明化合物6a-6e在磷酸緩沖液中24 h的藥物釋放速率在11% -S2%之間;大鼠尾靜脈給藥,衰明化合物6a6e的AUC為CPT溶液劑的4.38倍至6.67倍?；衔?a6e具有比CPT更好的體內(nèi)穩(wěn)定性,有望延長藥物體內(nèi)半袁期及提高生物利用度。關(guān)鍵詞喜樹堿;聚乙二醇;前藥;合成中圖分類號R944 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1000 - 5048(2012)02 -0142 -05Synthesis and characterization of camptothecin-polyethylene glycol ester pro-drugsXU Bei-hua ' , ZHOU Hui-yanZhejiang Pharmaceuical College, Ningbo 315100, ChinaAbstract To improve the metabolie stability of camptothecin (CPT) in rivo, a series of 20-PEG-linked campto-thecin prodrugs were synthesized. After activation of hydroxy groups at the two ends of polyethylene glycol( PEG), CPT was coupled to the activated PEC to give the targeted products 6abe. The chemical structures of 6a-6e were characterized by IR and 'H NMR . HPLC method was used for the determination of CPT concentration inPBS buffer ( pH 7. 4) and in plasma of rats. Drug releasing rates from 6a6e in PBS buffer (pH 7.4) were 11%-2% within 24 h. When given to rats intavenously, AUC of compounds 6a-6e were 4. 38 to 6. 67 fold higher thanthat of CPT solution. Compunds 6a-6e have longer circulation efects, subtantially greater than CPT. They canprolong biological half-life and improve the bioavailability of camptothecin.Key words camptothcin; polyethylene glycol; prodrug; synthesisThis study was sppred by the Scientific Research Project of Zhejiang Pharmaceutical Clle (No. ZPCSR200600)喜樹堿(CPT)是一- 種拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑,臨本研究采用傳統(tǒng)的前藥方法,選擇可降解的水溶性床試驗(yàn)表明對胃腸道腫瘤、膀胱癌、肝癌和白血病高分子聚乙二醇( PFG)來修飾高樹堿,修飾的位點(diǎn)等多種惡性腫瘤有效。但其體內(nèi)半衰期很短,約為內(nèi)酯環(huán)上20-位的羥基。聚乙二醇的修飾可避1.5 h。研究表明,喜樹堿結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯環(huán)及20-羥免藥物被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)谷噬，延長藥物在體內(nèi)的循基是活性必需的,而喜樹堿的內(nèi)酯環(huán)在人血清中迅環(huán)時間;PEG產(chǎn)生的空間位阻,可提高喜樹堿內(nèi)酯.速開環(huán)(約11 min) ,其開環(huán)產(chǎn)物的活性僅為喜樹環(huán)的穩(wěn)定性,另外PEG可提高藥物的水溶性及腫堿的1/10,且副作用增大"。另外喜樹堿的水溶瘤組織的被動聚集效應(yīng),增強(qiáng)藥物的療效2。性很小,這也影響了它在臨床上的使用。為了考察不同相對分子質(zhì)量的PEG,以及與喜為了延長喜樹堿的半衰期,提高它的水溶性，樹堿的不同結(jié)合 方式對前藥水解速率和體內(nèi)代謝方收稿日期211-1104 ● 通訊作者Tel;0574 822279393 E-mail:x中國煤化工基金項目浙江醫(yī)藥高等 專科學(xué)?？蒲姓n題責(zé)助項目(Ner ZPCSR20060:YHCNMHG.第2期徐蓓華等:喜樹啵-聚乙二醇前藥的合成及體內(nèi)外釋藥特性143式的影響,合成了5個化合物(6a6e) ,見路線1。BrCCO.E1R.RIRy1.NaOHHO-PEG-OH1BuOK- + EO:C--O-PEGO-S -CO2Et 2HC+ HOC--ofPEGo-C-cOH- +H13c--OFPEC+0-DCC, DMAP~6m-6e3a: PEG-6k R-= H.3b: PEG-20k. R1=H: 3e: PEG-6k, R;=CH3↓6: PEG&k, R- H, 6lr PC_20,H, bePEGC6HR-CH, ;CH, 0R2C-0-C-NH-CH-C0OHRHy00C-CH- NHCF:COOH一R &RRg R‘0-0C-CH-INC-C-0-PEGo-C- - CNH-CH-C0-0*AEEDQ, DMAP6d-6e6d; PEG-6k. RI- H.R2= H. be: PE0-sk, R- H. Rx- CH3Scheme 1 Synthesis of corpounds 6a6e光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);U3000高效液相色譜儀(紫外檢測器為SPD-10A型,美國1材料戴安公司) ;BS1I0S系列電子天平(北京賽多利斯1.1藥品與試劑天平有限公司)。喜樹堿(黃石飛云制藥有限公司,批號: .1.3動物081101 ,未經(jīng)處理直接使用);聚乙二醇-6k ( PEC-清潔級SD大鼠,雌雄各半,體重(270 +20)g, .6k)、聚乙二醇-20k (PEG-20k)、二甲氨基吡啶由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供,動物合格證號: SCXK(DMAP)澳代乙酸乙酯、溴代丙酸乙酯、叔丁醇(浙)20080033。鉀、二異丙基碳二亞胺( DIPC)、2-乙氧基1-乙氧羰2方.法基-1 ,2-二氫喹啉( EEDQ)、2-氯-1-甲基碘代吡啶,以上試劑均為化學(xué)純，購自中國國藥上?；瘜W(xué)試劑2.1化學(xué)合成[3-5]公司;其余試劑均為市售分析純。叔T醇及二氯甲2.1.1聚乙二醇二乙酸(3a) 將 PEG-6k(1)烷使用前須做無水處理。8.0g(1.3 mmol)溶于甲苯100 mL中,共沸除水1.2儀器1 h,蒸除甲苯,冷至室溫,加人叔丁醇100 mL,叔Avance500型核磁共振波譜儀(CDCI為溶丁醇鉀4.5g(39.0mmol),攪拌至固體全部溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));170SX型傅里葉變換紅外光譜中國煤化工0 mmol) ,加熱儀( KBr壓片,美國Nicolet公司) ;752紫外可見分. 回流YHC NMH G', 加硅藻土抽144中圃果科大學(xué)學(xué)報Journal of China Pharmaceutical Universiry第43卷濾,減壓蒸除溶劑。殘余物用二氯甲烷10 mL溶(20 mL x2)洗滌,無水硫酸鈉干燥過夜,減壓蒸去解,攪拌^下慢慢倒入乙醚150 mL.中.析出白色固溶劑，殘留物用異丙醇重結(jié)晶(400 ml x3),此時體.抽濾得聚乙二醇二乙酸乙酯(2)7.4 g,產(chǎn)率在TLC板的原點(diǎn)處有亮紫色斑點(diǎn),其他位置無雜92.0%。IR (v):3 424,2 889,1 747(C=0),斑(履開劑為乙酸乙酯-石油醚,2:1)。產(chǎn)物為淺黃.1 468,1 114 cm"。色固體(6a)2.32 go將化合物2 7.0 g(1.2 mmol)投入1 mol/L以化合物3b代替3a,用類似方法制備6b,產(chǎn)NaOH 36 mL中.室溫攪拌4 h,在冰水冷卻下,用物為淺黃色固體。以化合物3c代替3a,用類似方2 mol/L HCl調(diào)pH至3.0,用二氣甲烷( 12 mL x3)法制備6c,產(chǎn)物為淺黃色固體。提取,合并有機(jī)層,用水25 ml,洗,無水硫酸鈉干燥2.1.3 甘氨酸20-喜樹堿酯三氟乙酸鹽(5a) 將過夜，減壓蒸除二氯甲烷,殘留物用異丙醇60ml.Boc-甘氨酸1.8 g(9.3 mmol)、喜樹堿(4) 1.1 g重結(jié)晶，干燥后得白色固體(3a)6.2 g, 產(chǎn)率88. 6(3. 1 mmol)溶于二氯甲烷700 mL中,降溫至0 C,%。以PEG-20k 代替PEC-6k,用類似方法制備加入DIPC 1.5 mL(9.3 mmol)和DMAP 0.76 g3b:產(chǎn)率85%。(6.3 mmol) ,升至室溫.攪拌反應(yīng)24 h,用0.1 mol/L以a-溴代丙酸乙酯代替溴代乙酸乙酯,用類HCl溶液(90 mL x2)洗滌,無水硫酸鈉干燥過夜，似方法制備3c:產(chǎn)率83%。減壓蒸去溶劑，殘留物用甲醇45 mL重結(jié)晶,得黃2.1.2聚乙二醇二乙酸二(20~喜樹堿) 酯(6a)色結(jié)晶1.26 g,產(chǎn)率94%。將化合物3a3.0 g(0.5 mmol)投人甲苯s0 mL中,將以上產(chǎn)物1.2g溶于二氯甲烷15 mL中,加共沸除水0.5 h,蒸除甲苯。加入二氧甲燒80mL，人三氟乙酸 I5 mL。將反應(yīng)液倒入乙醚100 m在0~5 C下加入喜樹堿0.8 g(2. 3 mnol) , DMAP中,抽濾,得黃色固體。用二氯甲烷乙醚(1:4)再1.0g(8.0 mmol)和2-氯-1-甲基碘代吡啶1.0 g次重結(jié)晶，得淺黃色固體(5a)1.2 g,產(chǎn)率83%。(4. 0 mnol) ,繼續(xù)在冰浴中攪拌1 h,然后升至室以Boc-丙氨酸代替Boc-甘 氨酸,用類似方法溫,反應(yīng)18 h。抽濾,濾液用0.5 mol/L HCl溶液制備5b,為淺黃色固體,產(chǎn)宰80%。Table 1 Speeroscopie dnta of compounds 6a6eCompd.__ YietlU% IR( KBe,r)/m-TH SMIR (CDCI .8)6n672888,1 970,1 755,1 653,1 602，0. 98(3H,1,18-CH,) ,2 29(2H,m,19-CH2).3. 43-3.79(467H, m,PEG),1468,1 343,1 281,1 242,4. 34(2H,CH2CO) ,5. 30(2H,8.5-H).5.40( lH,d,17-H) ,5.67(1H,1 102d,17-H) ,7.25(H,s,Ar-HI),7.67<(lH,m. ArH),7.84(1H,m, Ar-H),7.94(1H,d,Ar-H) ,8. 2(1H,.A-H) ,8.40(H,e,Ar-H)Sb702 88.8 970,1 755,1 620,1 468，0.95(3H,1, 18-CH,).2.27 (2H, m, I.CH2)3433.81 (131H, m.,1 343,1 281,1 242,1 100PEG),5. 27(2H,s,5-H).5.64(1H,d,17-H).5.68(1H,d,I7-H),7.25(IH,s, Ar-H) ,7.66(IH,m,Ar-H).7.82( IH.m,Ar-H) ,7.91(1H,d, Ar-1),8. 18(H,d,Ar-H) ,8.39(1H,s,ArH)6S288.1 753,1 663,1 468,1 360，1.02(3H.18-CH)1.45(3H,d.LCH,).2.30(2H,.m. 19-CH.),3.47-fec1 343,1 281,1 1093. 82(489H,m,PEG) ,5.29(2H,5H) .s. 41(1H,d.17-H) ,5.64(1H,d,17-H) ,7.67(1H,m, Ar-H) ,7.85(1H,m, Ar-H) ,7.96(1H,d,ArH),8.20(1H,d,Ar-H) .8.42(1H,s,Ar-H)id682 88,1 756,1 66,1 602,1 468,0. 9(3H,18,8CH4),2. 30(2H,m,19-CH2),3.47-3. 84(439H, m,PEC),1360,1 342,1 281,1 242,1 1084. 47(2H,d,CH2.CO) ,s.30(2H,5.5-H) ,s.43(1H,d,17_H) ,5.67(1H,d.17-H),7. 59(IH,, Ar-H),7.68(1H,t, A-H),7.84(IH,t, A-H),7.94(1H,d,Ar-H) ,8.25(1H,d.Ar-H) .8. 42(1H,3,Ar-H)5e62888.1 754.1 620,1 468.1360，0. 9(3H,1,18.CH4).L.54(3H,m, -CH,).2.28(2H,m,19-CH2),3.46.1342,1 281,1 242,1 1023.81(1044H, m, PEC),4.84(1H, m. CHCO),s.29(2H,s, 5.H),5.40(1H,d.17-H),5. 69(1H. d, 17-H),7.66(IH,1, A-H),7.82(1H,I, ArH).Z. 94(H,d.ArH) & 23(UH.d.A-H) .8.41(UH,s,A-H)2.1.4聚乙二醇二乙酰甘氨酸二(20喜樹堿) 酯苯3.中國煤化工苯15 mL,冷(6d)將化合物 3a 0.22 g(0.04 mmol)投入甲，卻至0.20 mmol) ,*TYHCNMHG第2期徐依華等:真樹賊聚乙二醇前藥的臺成及體內(nèi)外釋藥特性145EEDQ 0.05 g(0. 18 mmol)和DMAPO.08 g(O. 6.(1:3)400 μL,擺勻,離心后取上清液進(jìn)行HPLCmmol) ,55 ~60 C攪拌反應(yīng)12 h。抽濾,減壓蒸檢測。色諧條件同“2. 3”項。去溶劑,殘留物用異丙醇重結(jié)晶。產(chǎn)物為淺黃色3結(jié)果與討論 .固體(6d)0. 18 g。以化合物5b代替5a,用類似方法制備,得淺3.1化合物6a-6e 中喜樹堿的含量黃色固體6e。本實(shí)驗(yàn)中的雙羧基端PEG制備未采用傳統(tǒng)2.2含量測定的琥珀酸酐法引人羧基*1,而通過PEC與a-鹵以甲醇為溶劑,將喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為代羧酸酯的氧烴化反應(yīng)引人。喜樹堿與PEG的3~ 30 umol/L的5個標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定在370 nm下結(jié)合率普遍不高,見表2。PEG 分子兩端應(yīng)能接的吸收度(A),以依度c對吸收度進(jìn)行線形回歸,兩個藥物分子,本實(shí)驗(yàn)中平均只接了0.6-1.3得標(biāo)準(zhǔn)曲線:A =0. 0220 +0.0273c (r =0. 99)。個藥物分子。這可能與PEG端基活化不完全有精確稱取化合物6a-6e,用甲醇配成適當(dāng)?shù)臐怅P(guān),另外喜樹賊20-位羥基存在較大位阻.也增加度,在同一波長下測定吸收度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算了結(jié)合難度。喜樹堿的濃度。喜樹堿的重量與稱取量之比,即為在PEC端基活化制備過程中,無水條件的控質(zhì)量百分比(四)。喜樹堿的摩爾數(shù)與稱取量的前制顯得很重要。PEG 分子中結(jié)合有水分子,無法藥摩爾數(shù)之比，即為摩爾百分比(x)。通過減壓十燥等手段除去,本實(shí)驗(yàn)中采用甲苯帶水2.3體外釋藥試瞼的方法。根據(jù)文獻(xiàn)[9],甲苯也是合成反應(yīng)的溶將精確稱取的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品及化合物6a6e劑,但研究發(fā)現(xiàn),叔丁醇鉀不能很好的溶解。因此，分別投入透析袋(透過相對分子質(zhì)量3500),再加將甲苯全部蒸除,換成尤水叔丁醇作為溶劑。人磷酸緩沖液(PBS,pH 7.4) 2 mL,束緊袋口,分Table 2 Carnptohecin( CT) content of compounds 6abe別投入PBS溶液28 mL的錐形瓶中，置37 C恒溫w(CPT)/呢x(CT)水浴鍋中。按設(shè)定時間間隔取出PBS溶液5a6.51.221.10.5ml,并補(bǔ)充相同體積的新鮮PBS溶液，用高效1.液相法檢測PBS溶液中再樹堿含量。0.色譜條件如下。色譜柱:ODS Ci柱(250 mmx4. 6 mm,5 μm);流動相:甲醇水(60: 40);流速:3.2體外釋藥1.0 mL/min ;檢測波長:370 nm ;進(jìn)樣最:20 pL。前藥的穩(wěn)定性與喜樹堿的內(nèi)酯環(huán)穩(wěn)定性存在標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取CPT5 mg,精密稱定,以著正相關(guān)性。研究表明，喜樹臧的內(nèi)酯環(huán)在20-位甲醉配制成質(zhì)量濃度為0.04,0.1,0.15,0.3,0.5，羥基 與PEG成酯的狀態(tài)下是不會被打開的,這樣2.0,5.0,20.0 mg/L的CPT系列溶液，進(jìn)樣,記錄前藥形式就保持了喜樹堿的活性”。色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，CPT質(zhì)量濃度從圖1可見,PEG的相對分子質(zhì)量可影響前藥(<)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:A =水解速率:與化合物6a相比,6b的水解速率有所0.797c-0.0231(r=0. 9996)。減緩。PEC高分子呈螺旋線結(jié)構(gòu),相對分子質(zhì)量2.4體內(nèi)藥代動 力學(xué)預(yù)試{0-)1的大小可能引起了螺旋半徑,及疏密程度的改變,將健康SD大鼠隨機(jī)分組.每組3只,分別經(jīng)導(dǎo)致水解速率的差異,但影響不是很大。尾靜脈級饅注射CPT及化合物6a-6d溶液制劑,劑與化合物6a相比,6c的水解速率顯著放慢,量以CPT計為3.5 mg/kg;分別于0.25,0.5,1,2,與它的酯鍵a-位甲基取代形成的空間位阻有關(guān)。3,5,7,9,11 h經(jīng)尾靜脈取血0.5 mL,全血置涂有與6a相比,6d由于引入甘氨酸做連接臂,水解速肝素的干燥EP管中.4 000r/ min離心10 min分率有所增大;6e引人丙氨酸,由于酯鍵x-位甲基形離血漿,-20 C冷凍保存。成的空間位阻,使水解反應(yīng)減緩。所以我們可以通血漿樣品的處理精密移取大鼠血漿200 μl，過改變 PEG相對什子質(zhì)量的大小C以及鍵合的形加入磷酸20 μ山,搖勻.避光放置2 h;加甲醇乙腈式來得中國煤化工YHCNM HG146中國善科大學(xué)學(xué)報Jourmnl of China Pharmaceuical Uninersity第43卷容易代謝;另一方面由于化合物6a相對分子質(zhì)量較小,更有利于通過腎小球?yàn)V過方式代謝,而化合40-物6b的相對分子質(zhì)量比6a大很多,不容易透過腎小球?；衔?c和6d由于鍵合方式與6a不同,其MRT都比a大,應(yīng)該由其水解速率差異引起?；衔?c在體外PBS(pH7.4)緩沖溶液中表現(xiàn)s10152025.很穩(wěn)定,在體內(nèi)同樣不容易被酶促代謝水解。雖/min然化合物6c的相對分子質(zhì)量比6b小,但MRT和-+-6a:一- 6b;-1-6c:-●- 6d:;-0-6eFigure 1 Kinetics of CPT release from corpounde 6a6e in PBS bufferAUC與化合物6b差別不大,可見化合物6c的鍵(pH7.4)合方式，即酯鍵旁增加小基團(tuán),對延長藥物體內(nèi)3.3體內(nèi) 藥代動力學(xué)作用時間很有利;同時也說明前藥在體內(nèi)的消除化合物6a6d及CPT溶液制劑的血藥濃度經(jīng)方式還是以代謝為主,腎排泄為次。時曲線(圖2)顯示，化合物6a-6d的血漿內(nèi)CPT消參考文獻(xiàn)除速度明顯低于CPT溶液制劑，循環(huán)時間延長。根據(jù)3P97藥代動力學(xué)程序可初步獲得6a6d及[1] 2hao H,Lee C,Sai P.ct a. 20 0-Aegykempohein devative:evidence for lartone sabiliation [J]. J Ong Chem, 200.65CPT的藥代動力學(xué)參數(shù),結(jié)果見表3。(15):4 601 -4606.[2] Genwald RB,Choe YH. McGuire J,a al. Eecire dug deli.very by PEGylatred dnug cnjugles[J]. Ado Drug Delin Rer,三10002003 55(2):217 -250.3] Xu BH,Zhou HY, Wwo IQ. Sntheie of poly( ehyene gyoa)-isclavone ester prodngr []. Chin J Symth Chan( 合成化學(xué)),2008. 16(1):77 -80.100,10i5[4] Greenwald RB, Pendi A, Conover CD, e al. Camplobein.20-hPEG eler Lansport forms ;the efce o spacer groups on antitu-一0- 6a;-x-6b;-0- 6e;-o- 6d;-◆- CPTmor siviy[J]. Biog Med Chem.1998 ,6(S):551 -562.Figure2 Cnetnitinre eurves of componds 6a6d and CPr [5] Pi JS,Luan LB,Wu xT. Syubheis and cacrezationn of PEC-T.in plasmaeiyl-oyrgayi-rploaheinn cnjugie[J]. Chin J Pham (中國醫(yī)藥工業(yè)雜志) ,209 ,40(9) :680 -683.Table 3 Pamecokintices paraneters for eompounds 6a6d and6] Fu XN,Luan LB. Prepartion of long erclated liposome contiCPT solutionning 7-thy-10-hyroy crplothecin and its pharmacokinetinCompd._ CL(Lh-g~V ALC(ng+/L)_ MRT/b_study[J]. 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