中國(guó)生物工程雜志第23卷第12期CHINA BIOTECHNOLOGY2003年12月AmpliDet RNA技術(shù)劉春燕*陳慶山梁秀瑞張立軍李文濱(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所150030)Q7 A摘要隨著分子生物學(xué)發(fā)展,核酸實(shí)時(shí)定量檢測(cè)已成為人們研究的 熱點(diǎn)問(wèn)題。分子標(biāo)燈與NASBA結(jié)合實(shí)時(shí)檢測(cè)ssRNA發(fā)展成為一種新技術(shù)，稱為AmpliDet RNA。就NASBA擴(kuò)增原理、分子標(biāo)燈的結(jié)構(gòu)和AmpliDet RNA的特點(diǎn)及應(yīng)用作一簡(jiǎn)單介紹。關(guān)鍵詞分子標(biāo)燈 NASBA AmpliDet RNA sRNA隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,核酸體外擴(kuò)體外特異核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增酶促過(guò)程。反應(yīng)在.增巳在各實(shí)驗(yàn)室得到普及應(yīng)用,進(jìn)而在擴(kuò)增過(guò)程中42C進(jìn)行,擴(kuò)增速度與PCR -樣快,在3h內(nèi)可擴(kuò)增做到實(shí)時(shí)定量檢測(cè)已成為人們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。1000萬(wàn)倍(1。NASBA技術(shù)均-.地等溫?cái)U(kuò)增特性擴(kuò)目前核酸檢測(cè)常用的方法有DNA印跡、RNA印跡、大了它的應(yīng)用范圍,并且用NASBA擴(kuò)增雙鏈DNA酶聯(lián)免疫法(ELISA)等,這些技術(shù)操作繁瑣復(fù)雜,費(fèi)也已有報(bào)道。時(shí),技術(shù)難度大,而且難以對(duì)核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢NASBA反應(yīng)依賴于AMV反轉(zhuǎn)錄酶.RNA酶H、測(cè)"。而分子標(biāo)燈是與PCR、 RT-PCR、NASBAT,RNA聚合酶共同協(xié)作完成,標(biāo)準(zhǔn)的NASBA反應(yīng)( nucleic acid sequence- based amplification) 相結(jié)合進(jìn)體系除以上3種酶外,還應(yīng)有脫氧核糖核苷三磷酸行核酸定量檢測(cè)的一種新技術(shù)。其中分子標(biāo)燈與(dNTP)、核糖核苷三磷酸(NTP)、兩個(gè)特殊的引物NASBA結(jié)合是一種實(shí)時(shí)檢測(cè)特異單鏈RNA和適宜的緩沖液。其中引物I 3’端與靶序列互補(bǔ)，(ssRNA)的有效方法，這種新技術(shù)稱為AmpliDet5'端具有被T,RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列,引物RNA,現(xiàn)已在許多診斷研究方面得以應(yīng)用”。II的5'端序列與靶RNA序列相同5.6]。NASBA技術(shù)是體外等溫?cái)U(kuò)增ssRNA 的酶促過(guò)程。NASBA整個(gè)反應(yīng)分為兩相:非循環(huán)相和循環(huán).該反應(yīng)依賴于AMV反轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)、RNA酶H相。如開(kāi)始用RNA靶序列,反應(yīng)將如此進(jìn)行:首(RNaseH)、T,RNA聚合酶(T, RNA polymerase)共 同先,5'端含有RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的引物I與協(xié)作擴(kuò)增反義原靶序列RNA。分子標(biāo)燈是一種與靶序列復(fù)性,并由反轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生一cDNA鏈,核酸雜交能產(chǎn)生熒光的一種新 型探針'”。分子標(biāo)以RNaseH降解新生成的雙鏈螺旋中的RNA,這樣燈與NASBA結(jié)合能高通量檢測(cè)核酸,同時(shí),擴(kuò)增與生成了帶有啟動(dòng)子序列的eDNA,稱為非循環(huán)相。檢測(cè)在同- - 封閉管內(nèi)進(jìn)行,臧少了核酸交叉污染的然后,引物I與裸露的cDNA復(fù)性,進(jìn)行第二鏈的危險(xiǎn),減少中間操作步驟,省時(shí)省力。現(xiàn)將分子標(biāo)合成,啟動(dòng)子序列變?yōu)殡p鏈。這時(shí), RNA聚合酶可燈技術(shù)與NASBA反應(yīng)原理及AmpliDetRNA定量檢以合成一反義原靶序列的多個(gè)拷貝啟動(dòng)子序列。.測(cè)核酸的應(yīng)用作一簡(jiǎn)述。反過(guò)來(lái),它們又可作為反應(yīng)循環(huán)相中cDNA合成模板,繼續(xù)合成反義原靶序列RNA。過(guò)程見(jiàn)圖1。1 NASBA擴(kuò)增反應(yīng)原理NASBA的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,不需特殊儀器,不NASBA(依賴核酸序列的擴(kuò)增)是AmpliDet需溫度循環(huán)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制,循環(huán)次RNA技術(shù)中擴(kuò)增目的RNA片段的步驟。1990 年由數(shù)少,忠實(shí)性高。由于反應(yīng)不需高溫變性步驟,所.Guatelli首次提出的由一對(duì)引物指導(dǎo)的連續(xù)均一的以NASBA不會(huì)受到雙鏈DNA的污染。同時(shí)由于外來(lái)雙鏈DNA無(wú)T,啟動(dòng)子序列,不可能被擴(kuò)增，這就大大提高了NASBA反應(yīng)的特異性,適于檢測(cè)收稿日期:2003-08-04修回 日期2003-09-24*電子信箱:eyliucn@ botmail. com中國(guó)煤化工TYHCNMHG第12期劉春燕等:AmpliDet RNA技術(shù)79RNA引物I.↓rT 5'非循環(huán)相RNA:DNA↓RNase HDNA(-)|3'- 5引物,Ty RNA polymerase循環(huán)相T, RNA polymerase/3'"一5' 引物1IRNA()3'-RTxTDNA(+)引物1RNase H圈1 NASBA 反應(yīng)過(guò)程{圈中引物I傾斜部分為T7啟動(dòng)子序列)核酸存在時(shí),分子標(biāo)燈保持莖環(huán)結(jié)構(gòu),熒光基團(tuán)與2分子 標(biāo)燈的結(jié)構(gòu)及作用原理淬滅基團(tuán)距離較近,產(chǎn)生的熒光能量根據(jù)熒光共振分子標(biāo)燈(molecular beacon)自1996 年問(wèn)世以能量轉(zhuǎn)移原理轉(zhuǎn)移到淬滅基團(tuán),并且以熱能的形式后,已廣泛應(yīng)用于PCR反應(yīng)的實(shí)時(shí)檢測(cè)、活體細(xì)胞散發(fā)出去,從而檢測(cè)不到或僅有微弱熒光本底。當(dāng)中DNA-RNA雜交的實(shí)時(shí)檢測(cè)、DNA突變分析等[']。靶核酸存在時(shí),莖部結(jié)構(gòu)由于環(huán)狀部分結(jié)合靶序列分子標(biāo)燈在AmpliDetRNA技術(shù)體系中與NASBA擴(kuò)而被打開(kāi)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi),熒光產(chǎn)生。增子雜交產(chǎn)生熒光,從而對(duì)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物分子標(biāo)燈檢測(cè)核酸的三大特點(diǎn)是特異性、信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。放大和產(chǎn)生熒光[回。熒光產(chǎn)生依賴于分子標(biāo)燈莖分子標(biāo)燈是根據(jù)核酸堿基配對(duì)原則和熒光共環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,而前兩者則依賴于探針與目標(biāo)分振能量轉(zhuǎn)移( fluorescence resonance energy transfer,子雜交的長(zhǎng)度及莖部的穩(wěn)定性。FRET)現(xiàn)象設(shè)計(jì)的17.8。分子標(biāo)燈為一莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3 AmpliDet RNA特點(diǎn)及應(yīng)用寡核甘酸探針,其環(huán)狀區(qū)核甘酸序列與靶序列互補(bǔ),靠近兩端的部分序列構(gòu)成分子標(biāo)燈的莖部,大3.1 AmpliDet RNA特點(diǎn)約有5-7個(gè)堿基對(duì),兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)分子標(biāo)燈與NASBA結(jié)合應(yīng)用技術(shù)被稱為(fluorophore)和淬滅基團(tuán)(quencher)(圖2)。沒(méi)有靶AmpliDet RNA技術(shù)。該技術(shù)與RNA印跡等方法比.擴(kuò)增子RNA8°分子標(biāo)燈圈2分子標(biāo)燈的作用模型F(furophore)熒光基團(tuán);Q( quenche)誶滅基團(tuán)中國(guó)煤化工TYHCNMHG80中國(guó)生物工程雜志第23卷較, AmpliDet RNA具有相同的特異性與靈敏度,并通過(guò)凝膠電泳后經(jīng)Northem雜交進(jìn)行檢測(cè)。而另便易于操作。由于整個(gè)過(guò)程在微量封閉的離心一份通過(guò)分子標(biāo)燈進(jìn)行檢測(cè),證明AmpliDetRNA管內(nèi)進(jìn)行,消除了核酸交叉污染的可能。AmpliDet檢測(cè)準(zhǔn)確可靠,靈敏度更高,并且易于操作。由于RNA除了能實(shí)時(shí)檢測(cè)sRNA外，還可應(yīng)用到其他分子標(biāo)燈在反應(yīng)開(kāi)始就需加入到反應(yīng)管內(nèi),這就有許多方面,如:生物活性的預(yù)測(cè)、基因表達(dá)、細(xì)胞生可能由于分子標(biāo)燈與擴(kuò)增子的雜交而阻滯了存力的檢測(cè)等。根據(jù)AmpliDet RNA的原理和目前NASBA反應(yīng)體系繼續(xù)進(jìn)行,因此應(yīng)對(duì)實(shí)時(shí)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與常規(guī)核酸檢測(cè)方法相比,AmpliDetNASBA反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。Cionate Leone 通過(guò)設(shè)計(jì)具RNA具有以下特點(diǎn)。(1)液相雜交檢測(cè):常規(guī)檢測(cè)有不同結(jié)合位點(diǎn)的分子標(biāo)燈和引物來(lái)克服這一現(xiàn)方法主要為固相雜交,通常把核酸片段變性后轉(zhuǎn)移象,并檢測(cè)了從100pg 到10fg-系列稀釋10倍的.并固定于支持膜上,用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交[10]。因PLRV病毒RNA。此要把未結(jié)合的探針和引物分離后才能利用其他3.2.2多 重AmpliDet RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因信號(hào)對(duì)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)。而AmpliDet RNA可以直或核酸的不同位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)在植物疾病 診斷過(guò)接在紫外燈下或借助熒光光譜儀進(jìn)行定量檢測(cè)。程中,分子標(biāo)燈的應(yīng)用已較為普遍。該技術(shù)能靈敏(2)準(zhǔn)確性高:分子標(biāo)燈與NASBA結(jié)合實(shí)時(shí)檢測(cè)核的檢測(cè)到微量的植物病原體。在植物發(fā)病過(guò)程中，酸要優(yōu)于分子標(biāo)燈與PCR或RT-PCR結(jié)合檢測(cè)核不單是由一種病原體致病,有可能是幾種病原菌共酸。這是因?yàn)镹ASBA是連續(xù)均一的等溫?cái)U(kuò)增過(guò)同作用導(dǎo)致植物發(fā)病的。因此利用多重檢測(cè)技術(shù)程,反應(yīng)在42C進(jìn)行,這就省去了在PCR和RT-同時(shí)檢測(cè)幾種病原菌顯得尤為重要。在利用PCR反應(yīng)中高溫變性的步驟,排除了分子標(biāo)燈因高AmpliDet RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)單-目的基因的基礎(chǔ)上,發(fā)溫變性而使雜交莖部打開(kāi)產(chǎn)生熒光的可能。也就展了多重AmpliDet RNA技術(shù)。在具有不同目的基是說(shuō)只有分子標(biāo)燈的環(huán)狀序列不斷與擴(kuò)增子雜交因的反應(yīng)管中加人帶有不同顏色熒光基團(tuán)的分子才能產(chǎn)生熒光信號(hào),提高了實(shí)時(shí)檢測(cè)RNA的準(zhǔn)確標(biāo)燈進(jìn)行檢測(cè)。常用的熒光-淬滅分子對(duì)有:香豆性。(3)特異性強(qiáng):在對(duì)分子標(biāo)燈與靶序列雜交特素(藍(lán)色)-DABCYL; EADNS(藍(lán)綠)- DABCYL;熒光異性研究中發(fā)現(xiàn),與線性寡核苷酸探針相比，莖環(huán)素(綠色)-DABCYL;熒光黃-DABCYL;四甲基羅丹狀結(jié)構(gòu)的分子標(biāo)燈檢測(cè)特異性高，對(duì)靶序列中單個(gè)明(橙色)_DABCYL;得克薩斯紅- DABCYL等。經(jīng)實(shí)堿基的錯(cuò)配、缺失或插人突變均能檢測(cè)出來(lái)。(4)驗(yàn)證實(shí),這個(gè)技術(shù)體系的可靠性和靈敏性要高于酶靈敏度高: AmpliDet RNA能檢測(cè)到低至1拷貝的核聯(lián)免疫( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)酸,敏感性很高。(5)對(duì) 靶核酸實(shí)時(shí)檢測(cè):在NASBA檢測(cè)和Northerm雜交等技術(shù)。由于NASBA擴(kuò)增技體系中加入分子標(biāo)燈,并把擴(kuò)增儀與熒光光譜儀相術(shù)比RT-PCR靈敏,同時(shí)AmpliDet RNA不使用凝膠連,可以對(duì)NASBA反應(yīng)過(guò)程隨時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。(6)有檢測(cè)，使得該技術(shù)優(yōu)于多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)"。效消除核酸交叉污染:利用分子標(biāo)燈可以直接對(duì)封Klerks等8已利用該技術(shù)成功地同時(shí)檢測(cè)了馬鈴閉微量離心管進(jìn)行檢測(cè),完全避免核酸中間操作環(huán)薯卷葉病毒(PLRV)和馬鈴薯病毒Y(PVY)兩種病節(jié),徹底消除核酸交叉污染。(7)可大通量的檢測(cè)毒的核酸含量。在同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯兩種病毒時(shí)，核酸:NASBA與分子標(biāo)燈結(jié)合可實(shí)現(xiàn)核酸的大規(guī)Klerks等通過(guò)在反應(yīng)管內(nèi)加入低濃度內(nèi)參照物IPC .模自動(dòng)化檢測(cè)。來(lái)消除假陽(yáng)性。IPC序列與目標(biāo)RNA幾乎相同,但3.2 AmpliDet RNA檢測(cè)核酸的應(yīng)用有3~20個(gè)核苷酸的差異,用具有不同熒光基團(tuán)的3.2.1 AmpliDet RNA能均一的實(shí)時(shí)檢測(cè)單一目的分子標(biāo)燈來(lái)檢測(cè)IPC擴(kuò)增子。所以在擴(kuò)增檢測(cè)中RNA在NASBA擴(kuò)增體系中應(yīng)用分子標(biāo)燈可隨著應(yīng)始終有IPC的熒光信號(hào)產(chǎn)生,這樣進(jìn)一步提高了擴(kuò)增的進(jìn)行均一的產(chǎn)生熒光信號(hào)。這是因?yàn)?AmpliDet RNA技術(shù)的準(zhǔn)確性。Eun AJC等[12}設(shè)計(jì)NASBA是連續(xù)均一的等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程,使分子標(biāo)燈了4種分子標(biāo)燈同時(shí)檢測(cè)了蘭花花葉病毒的環(huán)狀序列不斷與擴(kuò)增子雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行(CymMV)和蘭花環(huán)斑病毒( ORSV)兩種病毒中RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)。Gionate Leone 等[2}已把AmpliDet RNA依賴的RNA聚合酶基因和病毒外殼蛋白基因。該成功應(yīng)用于馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)的核酸定量檢技術(shù)在兩病毒共侵染的100mg蘭花葉片中同時(shí)檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)中NASBA擴(kuò)增子被均分為兩份,一份中國(guó)煤化工毒。多重AmpliDtfYHCNMHG第12期劉春燕等:AmpliDet RNA技術(shù)81RNA技術(shù)成功地應(yīng)用到了蘭花產(chǎn)業(yè),為蘭花的抗. [ 2 ]Gionate Leone, Harm van Schjnde, Bob van Gemen .e1 al .病育種提供了先進(jìn)的手段。由此可見(jiàn)，多重Molecular beacon probee combined with amplification by NASBAenable homogeneous, ral-time delectio of RNA. Nucleic AeidaAmpliDet RNA技術(shù)可應(yīng)用到不同作物的多個(gè)病毒Reearch, 1998 ,26 (9):2150- 2155.檢測(cè)。多重AmpliDetRNA不僅可以對(duì)多個(gè)病毒同[ 3 ]Tyagj S,Kramer F R. Molecular beaconsprobes ihat fuoresce upon時(shí)檢測(cè),還可以檢測(cè)同一病毒的不同株系。Szemeshybridizaion. Nat Biolechnol, 196,14(3):303 - 308等川采用NASBA擴(kuò)增馬鈴薯病毒Y(PVY)中編碼[ 4 ]Compton J. Nucleic acid Bequence based aplifcation.n Noture,外殼蛋白基因并用分子標(biāo)燈檢測(cè)成功地分離了1991.350:91 -92PVY~、PVYorC.、PVYT三種株系。同時(shí)利用該技術(shù)[5]顏進(jìn).NASBA及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用.國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化成功地分離了來(lái)自6個(gè)國(guó)家的47個(gè)PVY株系,經(jīng)學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)1997.18 (2)6-6-6驗(yàn)證,分離結(jié)果與這些株系的生物性狀一致,準(zhǔn)確[ 6]Kierils T, van Gemen B, van Strjp D.et al. NASBA isothermal可靠。enzymatic in vitronucleie acid amplfcation opimized for HIV-I3.2.3利 用AmpliDet RNA檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性dingnois . Jourmal of Virological Methods, 1991 ,35(3) :273 ~ 286[ 7 ]Tan W.Fang X,Li J, et al. Molecular beacons:a novel DNA probe(SNP)14.51隨著人類基因組計(jì)劃研究進(jìn)展,已經(jīng)for nucleic acid and prolein studies. Chemistry 2000.6(7);1107 -在人類基因組中鑒定出200多萬(wàn)個(gè)SNP。由此可1111以推知,在植物、動(dòng)物的基因組中也存在一定量的[8]Klerks MM，Leone GO, Verbek M,er al. Derelopment of aSNP。而且這些SNP在植物進(jìn)化、生長(zhǎng)發(fā)育、抗病muliplex AmpliDet RNA for the sinultaneous decction of potato性等方面起著重要作用。這使SNP成為基因研究leafroul vinus and potato vinus Y in potato tubers. Journal of的有利工具。對(duì)這些SNP近一步的研究具有深遠(yuǎn)Virologcal Methods ,2001 ,93(1-2):115- 125意義。利用分子標(biāo)燈與NASBA結(jié)合檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是[ 9 JSsemes M, Schoen CD. Design of molecular beacons for AmpliDet可以把多個(gè)樣品集合同時(shí)檢測(cè)，對(duì)微量樣品的檢測(cè)RNA asay Charceriration of binding sability and probespeificity. . Analyical Biochemistry , 2003 ,315(1~ 2):189 ~ 201具有很高的靈敏度。[10]劉明軍,王立榮,王兆五.核酸定量檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展及應(yīng)用.3.2.4利用 AmpliDet RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)目的DNA分醫(yī)學(xué)信息200.10 (6) :340-342子NASBA技術(shù)傳統(tǒng)上是擴(kuò)增ssRNA行之有效的[11]Burchill SA,erebolte L,Jobnston C. et al Comparison of the RNA-方法。但現(xiàn)在有一些實(shí)驗(yàn)室也采用NASBA技術(shù)擴(kuò)amplifcation based methods RT-PCR and NASBA for the dection增雙鏈DNA。只要反應(yīng)中加人變性步驟,即在等溫of cireulaing tumor cll. British Journal of Cancer,2002, 86 (1):反應(yīng)進(jìn)行前使雙鏈DNA分子變性成為單鏈,同時(shí)102- 109在引物設(shè)計(jì)、樣品的提取方法和模板變性等方面做[12] Alrin Jin Cheng Eun, Sek-Man Wang. Moleular beacons: A new一些修改,就可以利用NASBA有效擴(kuò)增雙鏈DNAepproech to plat virus dection. Pyopahlgyy .20090(3) :269- 275分子。用AmpliDet RNA檢測(cè)DNA分子優(yōu)點(diǎn)為反應(yīng)[13]Szenes M,M klerkes M, van den Heuvel J F] M,et al. Development在一等溫封閉管內(nèi)進(jìn)行,減少中間操作環(huán)節(jié),免除of a multiplxs AmpliDet RNA 8y for simulaneous deletion and核酸交叉污染的可能,同時(shí)允許高通量檢測(cè)目的typing of potato virns Y inlates. Journal of Virological Methods,DNA分子。Yales 等[16]采用AmpliDet RNA技術(shù)實(shí)2002,100 (1-2):83 -96.時(shí)檢測(cè)定量了乙型肝炎病毒(HBV),并檢測(cè)到了人[14]aras SAE, Kramer FR, Tyaji s . Muliplex deteticon of single-類血漿每毫升中HBV DNA 10'~ 10°拷貝不等。該nucleoide varaions using moleular beacons . Cenetic Analysis:方法具有很好的重復(fù)性和精確度。與其他DNA檢Bionoleculer Engineing, 199,14(5- 6):l51- 156測(cè)技術(shù)相比,AmpliDet RNA具有更好的靈敏性和較[15] Mhlanga MM , Malmberg L. Using mlecular beacons l0 detct大的動(dòng)力學(xué)范圍,并且可以高通量檢測(cè)。這使eingle nuclotide polymorphismns with real time PCR. Methods,2001 ,25(4):463 -471AmpliDet RNA技術(shù)在檢測(cè)目的DNA分子的應(yīng)用上[16]Yates s. Penning M, Goudenit J,et al. Quantiative detection of也有廣闊的前景。hepeitis B vins DNA by rel-lime mucleic acid sequence-based參考文獻(xiàn)amplification with molecular beacon delection. Jourmal of ClinicalMicrobiology ,2001 ,39( 10) :3656 - 3665[1]陳忠斌,王升啟,孫志賢.分子信標(biāo)核酸檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展.(下轉(zhuǎn)第94頁(yè))生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1998,25(6):488~492中國(guó)煤化工MYHCNMHG94中國(guó)生物工程雜志第23卷的克隆及結(jié)構(gòu)分析.生命科學(xué)研究,003, 16(3);188 ~ 191[4]F.奧斯伯，R.布倫特,等.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.北京:[2]朱平,馮書(shū)章.抗體實(shí)驗(yàn)技術(shù).長(zhǎng)春:長(zhǎng)春出版杜,94,415-科學(xué)出版社.1998. 200.565 - 581[s]許崇波.朱平.產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素保護(hù)性抗原基因在大腸(3}張智清,姚立紅,侯云德含PRPL啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載桿菌中的高效表達(dá).中國(guó)普醫(yī)學(xué)報(bào), 19919(1):29 -32體的組建及應(yīng)用.病毒學(xué)報(bào)，190612)11116High Expression of Recombinant Alpha-toxin's C-Terminal Gene ofClostridium perfringens Type A in E. coliLin Minghui' Yin Jun2 Xing Hongguang' Hou Xiaojun2 Wang Hui' Song Wei2(1 Laboratory Department of Genernl Hospital of Kunning Kunming 6500322 Institute of Microbiology and Epidemiology Academy of Miliary Medical Sciences Beijing 100071)Abstract After having been cloned and digested by the restriction endoenzyme EcoR I and Pst I , the modifiedalphatoxin' s C-terminal gene was connected with the expression vector pBV220 and then transferred into the host cellE. coli DH5a . Induced by 42 C , the cpa408 gene was highly expressed , which expression amount was to the 43.75percent of the totall bacterial protein. By analysis of SDS-PAGE , the molecular weight of the expression protein is about15.5x 10'Da. Analysised by Westem-blot , the protein could secificly react with the standard anti alpha-toxin.Key words Clostridium perfringens type A Alpha- toxin C- terminal gene High expression(上接第77頁(yè))包涵體復(fù)性研究進(jìn)展龔平生羅貴民(吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)春 130023)摘要用基因工程技術(shù)在大腸桿菌 高水平表達(dá)重組蛋白時(shí),通常形成無(wú)生物活性的包涵體。包涵體在體外經(jīng)分離、溶解與重折疊后可實(shí)現(xiàn)復(fù)性,表現(xiàn)為具有生物活性的蛋白。總結(jié)了包涵體的相關(guān)復(fù)性技術(shù),重點(diǎn)介紹重折疊的最新進(jìn)展情況。關(guān)鍵詞包涵體 復(fù)性重折疊重組蛋白(上接第81頁(yè))The Principle and Application of AmpliDet RNALiu Chunyan Chen Qingshan Liang Xiurui Zhang Lijun li Wenbin(Instiute of Soybean Research Northeast Agriculural Univenity Harbin 150030)Abstract With the development of molecular biology, real-time detection of nucleic acid has become a hotproblem. AmpliDet RNA is a new technology for detecting nucleic acid combined nucleic acid sequence-basedamplification( NASBA) and molecular beacon. The principle of NASBA, the structure of molecular beacon, and thecharacteristics of AmpliDet RNA have been summarized.Key words Molcular beacon NASBA AmpliDet RNA ssRNA中國(guó)煤化工MYHCNMHG