第25卷第11期分析試驗室25 No 11006年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory唐古特大黃乙醇提取物的HPLC指紋圖譜研究周劍波2,蔣福全2,文懷秀12,邵赟,師治賢,陶燕鐸*〔Ⅰ.中國科學院西北高原生物研究所,西寧810008;2.中國科學院研究生院,北京100049)摘要闈高效液相色譜法建立唐古特大黃乙醇提取物的指紋圖譜分析方法。采用 Phenomenex Kromasil C色譜柱(4.6mm×250mm,5pm);甲醇-0.1%HPO為流動相,梯度洗脫,檢測波長為270nm,以大黃酸為參照峰。結果共有18個共有峰。此法為有效地控制唐古特大黃乙醇提取物的質量提供了依據(jù).關鍵詞唐古特大黃;提取物;HPLC;指紋圖譜中圖分類號657.7文獻標識碼A文章編號1000-07202006)1-001-05唐古特大黃( Rheum tanguticum Maxim.ex器), agilent化學工作站,中藥色譜指紋圖譜相似Ba∥f.)為蓼科植物,是大黃藥材的主要來源,其有度評價系統(tǒng)(國家藥典委員會,版本2004A),KQ效成分主要是蔥醌類衍生物如大黃酸、大黃素、-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器大黃酚、蘆薈大黃素和大黃素甲醚等,具有瀉熱有限公司),電子分析天平(梅特勒公司通腸,涼血解毒,逐淤通經(jīng)等功能,是中醫(yī)臨床1.2試劑常用中藥。有關大黃中蒽醌類衍生物的含量測定甲醇為色譜純(山東禹王化工廠),水為重蒸方法報道24較多,但以此作為質量控制,很難全水,其它試劑均為分析純。大黃酸對照品(批號面反映藥材或提取物的內在質量。而有關大黃指0757-9804)大黃素對照品(批號:110756紋圖譜的研究,文獻5也曾有報道,但多限于200110)大黃酚對照品(批號:110796-200309大黃藥材成份的指紋圖譜分析。徐雄良等曾研大黃素甲醚對照品(批號:758-9301),以上對照究了注射用大黃粉針劑的HPLC指紋圖譜,關于大品購自中國藥品生物制品檢定所。12批唐古特大黃提取物的HPC指紋圖譜還沒見報道。建立中藥黃乙醇提取物由本實驗室根據(jù)優(yōu)化工藝制得。提取物可行的質控方法將更加有助于中藥提取物2方法與結果向更廣闊的國際市場空間發(fā)展。利用色譜指紋圖2.1色譜條件譜可以較為全面地檢測其多種成分在藥材中分布Phenomenex Kromasil C1色譜柱(4.6mm×250的全貌,使藥材的內在質量情況可視。本文通m,5pm);流動相:A相為甲醇,B相為0.1%的過優(yōu)選HPLC梯度洗脫程序,建立了大黃乙醇提取H3PO緩沖液,采用梯度洗脫∶流速:1.0mI/r物的指紋圖譜質量控制技術,可作為唐古特大黃DAD檢測器,柱溫30℃。線性梯度洗脫程序見乙醇提取物及以其為主成分制劑的指紋圖譜研究表1,運行時間50min,兩次進樣之間用流動相初基礎始梯度條件平衡15min。采用二極管陣列檢測器1儀器與試劑對檢測波長進行了考察,分別記錄波長在2301.1儀器254、270、280,300mm的色譜圖。結果在270mmΔ gilet100液相色譜儀〔含在線真空脫氣機,處各色譜峰均有較好的紫外吸收,色譜信息最為低壓四元梯度泵,手動進樣器,柱溫箱,DAD檢測豐富,并且分離度好,可使主要色譜峰達到基線*收稿日期:2006-02-24修訂日期:2006-04-29基金項目:中國科學院知識創(chuàng)新工程(CXLY-2002-9項目資助第25卷第11期分析試驗室ol.25.No.112006年11月Chinese Joumal of Analysis Laboratory2006-11分離。以大黃酸色譜峰(指紋圖譜中為14號峰)為參照表1線性梯度洗脫程序峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。Gradient elution program結果表明,各共有峰相對保留時間和相對峰面積梯度流速B/%穩(wěn)定,RSD<3%,表明樣品溶液在16h內穩(wěn)定。t/min(ml/min)甲醇0.1%HPO4緩沖液2.4唐古特大黃提取物指紋圖譜的測定及參數(shù)分別準確吸取對照品溶液及12批供試品溶液各10μL按前述色譜條件進樣,記錄指紋圖譜(見圖1、圖2),將圖譜數(shù)據(jù)導入指紋圖譜相似性評價軟(中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng),2004A2.2樣品與對照品溶液的制備版)分析,通過設置參照圖譜,自動匹配(見圖3),2.2.1提取物的制備根據(jù)文獻"報道,經(jīng)過生成對照圖圖2)確定了18個共有峰,其中14優(yōu)化確定提取物的最佳提取工藝為唐古特大黃藥材粉碎成粗粉,加8倍量V75%乙醇):V(15%384.9H2SO4)=10:1回流提取2次,每次2h,合并提取液,濃縮,先用乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯層再以50g/ L NaoH溶液萃取,取水層,加入HCl后得沉淀,干燥成浸膏粉,得提取物。2.2.2樣品溶液的制備準確稱取干燥至恒量的09.1618.3227.4836.6445.805496提取物粉末10mg,加甲醇超聲溶解,用甲醇定容圖1混合對照品色譜圖至25mL,過0.45m的微孔濾膜后作為供試品溶Fig. I Chromatogram of mixed reference substances液大黃酸;b-大黃素;c-大黃酚;d-大黃素甲醚2.2.3對照品溶液的制備分別準確稱取大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品5mg,加384.91甲醇超聲溶解,用甲醇定容至25mL,制成0.2mg/m的混合對照品溶液,過0.45{m的微孔濾膜后作為供試品溶液。2.3方法學考察2.3.1精密度分別準確吸取同一供試品溶液0△10μL,按上述色譜條件連續(xù)進樣5次,記錄指紋09.1618.3227.4836.6445.8054.96圖譜。以大黃酸色譜峰(指紋圖譜中為14號峰)為圖2對照樣品色譜圖參照峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰Fig 2 Chromatogram of a representative sample面積。結果表明,各共有峰相對保留時間和相對峰面積穩(wěn)定,RSD<3%,表明儀器精密度良好。15、16、18號峰分別為大黃酸、大黃素、大黃酚2.32重現(xiàn)性按樣品溶液制備方法處理同一樣大黃素甲醚,選取14號峰大黃酸為參照峰標示品5份,各吸取10L,按上述色譜條件分別測定為S峰)計算各共有峰對保留時間和相對峰面積記錄指紋圖譜。以大黃酸色譜峰指紋圖譜中為14值分別見表2、表3單峰面積與總峰面積的比號峰)為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間值大于10%的共有峰有1、4、5、14號峰,其相對和相對峰面積。結果表明,各共有峰相對保留時保留時間分別為0.104、0.346、0.434、1.000.間和相對峰面積穩(wěn)定,RSD<3%,表明實驗方法用夾角余弦法計算相似度,進行整體相似度評價,的重復性良好,通過相似度分析發(fā)現(xiàn),12批樣品的相似度均在23.3穩(wěn)定性取同一供試品溶液分別在0、2、95%以上(見表4),平均為97.5,表明樣品相似性L良好,可以作為控制唐古特大黃乙醇提取物的質第25卷第11期分析試驗室25 No 11年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory2006-11量依據(jù)。384.91大黃酸大黃素大黃酚大黃系甲醚8910121317人凡A水術法18.3236.64圖312批大黃提取物樣品的匹配色譜圖Fig 3 Matching chromatograms of 12 batches of rhubarb extracts表212批大黃提取物指紋圖譜共有峰相對保留時間(t/min)Tab 2 Relative retention values of characteristic peaks for 12 batches of rhubarb extracts批號峰號12平均RSD/%10.1030.1020.1040.1050.1030.1010.1040.1050.1020.1040.1030.1060.1041.39720.1270.1260.1250.1240.1270.1240.1270.1250.1260.1250.1240.1250.1250.92930.1850.1830.1840.1860.1850.1860.1830.1840.1850,1860.1840.1820.1840.71140.3480.3460.3450.3470.3450.3430.3450.3470.3490.3460.3440.3470.3460,49350.4340.4320.4350.4330.4360.4310,4340.4360.4320,4340.4330.4350.4340.36960.5410.5430.5380.5370.5390.5420.5430.5400.5390.5440.5420.5410.5410.40370.6780.6750.6730.6760.6740.6790.6770.6760.6750.6740.6740.6760.6760.26480.7450.7430.7470.740.7420.7460.7450.7440.7430.7450.7460.7470.7450.2157850.7830.7860.7870.7820.7850.7880.7860.7870.7820.7840.7830.7850.260100.8210.8240.8180.8170.8250.8230.8220.8240.8250.8200.8250.8230.8220.333ll0.8400.8420.8370.8420.8430.8410.8440.8410.8430.8450.8460.8440.8420.288120.8800.8770.8810.8820.8780.8850.8830.8780.8790.8830.8810.8770.8800.29630.9490.9470.9450.9530.9510.9480.9530.9470.9520.9460.9490.9470.9490.28914S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000151.2951.2921.2951.2931.2961.2941.2911.2971.2951.2981.2921.2911.2940.179161,4201,4191.4221.4211,4241,4221,4171.4211.4231,4181.4201.4211,4210.142171.4871,4851,4901,4881.4911.4861.4881.4911,4851,4871,4851.4861.4870.150181.5711,5741,5691.5731.5681,5721.5721.5681.5731.5671.5721.5691.5710.149第25卷第11期分析試驗室ol.25.No.112006年11月Chinese Joumal of Analysis Laboratory2006-11表312批大黃提取物指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab 3 Relative peak areas of characteristic peaks for 12 batches of rhubarb extracts批號峰號12平均RsD/%11.1091.1001.1071.1051.1071.1091.1071,10l121.1071.1091.1051.1070.26520.3310,3370.3400.3340.3320,3300.3280.3290,3340.3380.3300.3360.3331.16030.3750,4010.3800.3780.3850.3730.3710.3760.3810,3810.3730.3790.3792.08641.3921.4031.3891.3971.421.3951,3931.3981.3941.4021.3951.3951.3980.59350.9100.9080.9130.9120.9080.9060.9010.9060.9080.9110.9060.9130.9090.38860.2400.2370.2430.2420.2370.2370.2390.2390.2370.2350.2370.2420.2391.05870.2320.2390.2370.2370.2400.2320.2350.2360.2360.2370.2310.2330.2351.22180.1580.1620.1550.1610.1570.1590.1540.1560.1580.1570.1560.1550.1571.54190.1920.1980.1980.1950.1920.1890.1850.1930.1970.1910.1920.1940.1931.964100.1280.1300.1250.1290.1270.1270.1250.1260.1280.1240.1280.1250.1271.459110.2970.2910.2950.2930.2980.2960.2930.2920.2940.2910.2960.2940.2940.778120.1610.1580.1630.1590.1570.1590.1600.1620.1610.1600.1600.1630.1601.164130.1860.1870.1890.1910.1850.1850.1840.1870.1890.1890.1850.1860.1871.15141.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00050.3340.3340.3330.3360.3340,3330.3310.3340.3340.3350.3330/3300.3330,486160,1020.1020.1010.1030.1040,1040.1010.1020.1050.1020.1040/1060.1031.549170.1350.1400.1390.1420.1410.1330.1360.1380.1410.1420.1330.1410.1382,435180.0410.0400.0400.0410.0420.0400.0420.0410.0400.0410.0410.0400.0411.850表412批大黃提取物的相似度烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相柱,分別對甲Ib4 Similarity analysis results of I2 batches of rhubarb醇-水、甲醇-0.1%H3PO、乙腈-水和乙腈extracts0.1%H3PO等體系進行了等度和梯度洗脫試批號相似度批號相似度驗,結果以甲醇-0.1%HPO水體系進行梯度洗0.9810.980脫得到的色譜峰形以及分離度較好;比較了1900.9770.975400mm波長下的色譜圖,結果270mm波長時色譜0.9520.961峰信息較多,分離情況良好;同時考察了不同柱0,9860.981溫、不同流速等條件對色譜分離的影響,表明柱0.978110,984溫30℃,流速ImL/min為佳,采用本方法可使主0.9830.964要色譜峰在50min內達到很好的分離,且同時分析了大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚4個指討論標成分,這使提取物的指紋圖譜分析效率大大提1.本實驗依據(jù)國家藥典委員會關于《中藥注。射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》,以HPLC通過本方法分析12批唐古特大黃的乙醇梯度洗脫法對唐古特大黃的乙醇提取物進行了指提取物,經(jīng)指紋圖譜相似度軟件分析,相似度均紋圖譜研究,實驗證明,該方法可操作性強、重復在95%以上。所建立的方法精密度、穩(wěn)定性和重性好,可作為唐古特大黃乙醇提取物及以其為主現(xiàn)性符合指紋圖譜研究的技術要求,為唐古特大成分制劑的指紋圖譜研究基礎。黃乙醇提取物及其制劑的質量控制提供了科學依第25卷第11期分析試驗室25 No 11006年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory參考文獻2004,354):559[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(第一部)[9]張立新,周曉英等.藥品檢測,2001,1010):36北京:化學工業(yè)出版社,2000.18[10]劉欣,胡芳弟等.分析測試技術與儀器,2004,10[2]華曉東,王智華等.中成藥,2002,245):340(3):140[3]李太平,王小文等.中成藥,2003,234):293[11]徐雄良,張志榮,黃園.色譜,2003,216):596[4]曹紅,劉云.藥物分析雜志,1998,181):3[12]謝培山.中國中藥雜志,2001,2610):6535]陳斌,蔡寶昌等.中草藥,2003,345):457[13]裴月湖.天然藥物化學實驗,北京:人民衛(wèi)生出版[6]朱玲英,任愛農(nóng)等.中成藥,2003,256):438社,2005:141[7]秦晨,段玉萍等.現(xiàn)代儀器,2000,(3):8[14]鄭志華.廣東藥學,2002,1x(3):58[8]徐雄良,張志榮,黃園.四川大學學報(醫(yī)學版)Study on HPLC fingerprint of alcohol extracts from Rheum tanguticumZHOU Jian-bo.,JIANG Fu-quan, WEN Huai-xiu, SHAO Yun, SHI Zhi-xian and TAO Yan-duo(1. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences Xining 810008; 2. Graduate School of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049), Fenxi Shiyanshi, 2006, 25( 11): 1-5Abstract: Fingerprint chromatograms of alcohol extract from Rheum tanguticum by HPLC were established. A Phe-nomenex Kromasil CI8( 4. 6 mm x 250 mm, 5 um)column was used methanol-01% phosphate acid was used asthe mobile phase and gradient elution program was used, UV detection wavelength was 270 nm, and rhein was usedas a reference peak. The results indicated that 18 peaks were obtained in fingerprint chromatograms. The method issimple and accurate with a good reproducibility and it can be used as a quality control method for alcohol extractseum tKeywords: Rheum tanguticum Extract Fingerprint chromatogram i HPLC全國試劑與應用技術交流會會議通知(第二輪)為總結、交流化學試劑包括小噸位精細化學品)與應用技術、分析測試技術的進展交流最新成果搭建產(chǎn)、學、研、銷用平臺促進化學試劑和分析測試技術的發(fā)展中國分析測試協(xié)會、全國化學試劑信息站將于2006年11月12-17日在海南省海口市海外酒店召開″全國試劑與應用技術交流會”具體由《化學試劑》編輯部承辦。會議期間除發(fā)表論文外還有科技部條財司領導、中國科學院院土、著名專家、學者的專題報告。會議時間:2006年11月13日至17日報到時間:2006年11月12日全天會議地點:?？谑泻Ｍ饩频陥竺椒?欲參加會議者請?zhí)顚懟貓?zhí)寄回或傳真給全國化學試劑信息站或《化學試劑》編輯部。為了安排食宿方便請務必于9月25日前寄回或傳真回執(zhí)聯(lián)系電話:010-65283411、65281741;傳真:65281741《化學試劑》編輯部010-68512289中國分析測試協(xié)會謝小E-mail:webmaster@chinareagent.com.cn通訊地址:100010北京市東城區(qū)東四南大街160號《化學試劑》編輯部中國分析測試協(xié)全國化學試劑信息站年7月20日