2007.Vl24N1化學(xué)與生物工程Chemistry Bioengineering纖維素乙醇的研究進(jìn)展龔大春,田毅紅,李德瑩,龔美珍,涂志英三峽大學(xué)—艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所,湖北宜昌443002)摘要:近年來以纖維素類生物質(zhì)為原料制備乙醇的硏究取得了許多進(jìn)展,使纖維素乙醇的開發(fā)更具商業(yè)化前景重點(diǎn)介紹了木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的原料預(yù)處理方法、纖維素和半纖維素的酶法降解、有效可靠的發(fā)酵菌種的選育及木質(zhì)纖維素乙醇制備工藝的開發(fā)關(guān)鍵詞:木質(zhì)纖維素;生物乙醇;進(jìn)展中圖分類號:TQ223.12TQ517.44文獻(xiàn)標(biāo)識碼文章編號:1672-5425(2007)01-0004-021世紀(jì)所面臨的能源、資源、環(huán)境等危機(jī),已成為進(jìn)一步降低酶制劑的成本人類文明發(fā)展的主要障礙。人們正在努力尋找替代化2.1產(chǎn)纖維素酶工程菌的構(gòu)建石燃料的新能源,以降低對不可再生能源的依賴、控制利用基因工程方法可改善纖維素酶的性能、降低二氧化碳的排放、保護(hù)生態(tài)環(huán)境。纖維素原料是地球糖化生物質(zhì)底物所需的酶量。對于纖維素酶工程菌最上產(chǎn)量最大的可再生資源,包括林木、農(nóng)作物秸稈、農(nóng)初的目標(biāo)是纖維二糖酶,它們在天然纖維素酶系中副產(chǎn)品加工下腳料等,在自然生態(tài)系統(tǒng)的能量流與物般占60%~80%。 Teter等利用定點(diǎn)突變、定向飽質(zhì)循環(huán)流中有重要地位,開發(fā)以木質(zhì)纖維素為原料制和突變、PCR擴(kuò)增和DNA分子進(jìn)化,產(chǎn)生了里氏木酶備乙醇的工藝是未來乙醇生產(chǎn)的發(fā)展方向的變種,突變株在酵母中表達(dá),通過選育改善其熱穩(wěn)定作者在此重點(diǎn)闡述近幾年有效的木質(zhì)纖維素生物性和熱活性。重組菌的綜合性能超過母本,用于預(yù)處轉(zhuǎn)化為乙醇的研究進(jìn)展。在生物轉(zhuǎn)化工藝中主要有三理后的玉米秸稈的水解。Day也利用定點(diǎn)突變,得步:纖維素預(yù)處理、纖維素酶解、酵母發(fā)酵及乙醇分離到新的 Hypocreajecorena纖維二糖酶Cel7A(CBH1)1纖維素預(yù)處理工藝變種,幾個(gè)突變株表達(dá)在里氏木酶中顯示出好的熱穩(wěn)定性和可逆性纖維素原料預(yù)處理方法主要有物理方法、化學(xué)方另一種方法是將異源酶引入里氏木酶系統(tǒng)中,加法、物理化學(xué)法和生物法。最有工業(yè)化前景的預(yù)處理方強(qiáng)整個(gè)體系的性能。 Bower介紹了將幾個(gè)菌的內(nèi)切法是物理化學(xué)法:低壓氨爆和CO爆破。在蒸汽爆破酶引入里氏木酶的方法。從 Acidothermus cellulo過程中,纖維素結(jié)晶度和聚合度下降,細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞, oticus來的GH5A蛋白,被融合到里氏木酶的纖維二從而破壞纖維素一半纖維素一木質(zhì)素的結(jié)構(gòu),半纖維素糖酶中,表達(dá)在里氏木酶中,發(fā)現(xiàn)在纖維素的糖化過程通過自水解作用轉(zhuǎn)變成單糖和寡糖,部分木質(zhì)素的芳中具有更高的活性,結(jié)果顯示6h達(dá)到20%的纖維素醚鍵斷裂且發(fā)生部分縮合作用。由于化學(xué)方法涉及濃轉(zhuǎn)化率,用母本的纖維素酶則需要10h酸、濃堿,對生物質(zhì)的主要成分會有不同的影響。另外,2.2酶一底物相互作用機(jī)理的研究技術(shù)經(jīng)濟(jì)分析對主要的預(yù)處理方法進(jìn)行原料成本評價(jià)碳水化合物鍵合的模型(CBMs)表明,通過和結(jié)和性能評價(jià)對工業(yè)化工藝的選擇至關(guān)重要晶纖維素表面鍵合,靶向鎖定特定底物的催化活性中2纖維素和半纖維素的酶法降解心,通過提高表面的有效濃度,可加強(qiáng)酶的催化活性。同時(shí)有人認(rèn)為酶的靶點(diǎn)在取向時(shí),能裂解多糖的結(jié)構(gòu),近幾年,從細(xì)菌和真菌里分離得到新的纖維素酶從而加快水解速率。最近, Vaaje-Kolstad等0提出和半纖維素酶。依靠基因工程、酶工程和發(fā)酵工藝將有效的殼多糖降解取決于一個(gè)小的非催化蛋白基金項(xiàng)目:湖北省教育廳重大項(xiàng)目(D200613006)收稿日期:2006-10-11龔大春等:纖維素乙醇的研究進(jìn)展/2007年第1期CBP21的存在。由于CBP21可以鍵合到結(jié)晶底物中,受木糖醇抑制,敲出醛還原酶基因(Gre3)是必要的,導(dǎo)致底物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而提高了酶的水解能力。可以使從木酮糖到木糖醇的產(chǎn)量降到最低,獲得更高2.3半纖維素酶的產(chǎn)率和速率。這些最新的研究結(jié)果顯示利用重組酵半纖維素的有效降解需要許多酶的協(xié)同作用,最母改善木糖發(fā)酵已取得巨大進(jìn)步。在國內(nèi),利用木糖重要的是半纖維素酶的參與。半纖維素酶的商業(yè)化開和葡萄糖的酵母工程菌的構(gòu)建從2002年開始研究,其發(fā)遠(yuǎn)沒有纖維素酶先進(jìn),因?yàn)槟壳袄w維素乙醇的商業(yè)中山東大學(xué)曲音波教授和鮑曉明教授、大連理工大學(xué)化制備主要采用稀酸預(yù)處理生物質(zhì),而半纖維素在糖白鳳武教授和中科院江寧研究員做了大量工作。但國化之前就已去除。然而隨著非酸預(yù)處理方法的開發(fā),內(nèi)對木糖代謝的下游疏通、輔酶工程和綜合考慮代謝半纖維素還殘留在緊密層,就要求半纖維素酶的參與。流提高乙醇總收率的研究還亟待加強(qiáng)目前從木酶得到的半纖維素酶活性較弱,不能完全轉(zhuǎn)化為單糖。近年,通過了解木糖酶和半纖維素酶4木質(zhì)纖維素乙醇制備工藝的開發(fā)CBMs的特點(diǎn),半纖維素酶的開發(fā)取得了不斷的進(jìn)纖維素乙醇的制備工藝主要有酸水解、酶水解乙展。開發(fā)低成本商業(yè)化的半纖維素酶和纖維素酶協(xié)同醇生產(chǎn)工藝兩大類。目前酸水解工藝的研究較少,較作用,用于生物乙醇的生產(chǎn),將是未來的研究重點(diǎn)。酶水解工藝來說,其研究和發(fā)展?jié)摿ο鄬^弱,美國的3己糖和戊糖共發(fā)酵工程菌的選育Vulcan化工公司和加拿大的 Stake公司已經(jīng)完成了用木屑酸水解制備乙醇的全部設(shè)計(jì)工作。纖維素酶水以淀粉和蔗糖為原料生產(chǎn)乙醇的生物轉(zhuǎn)化過程是解乙醇生產(chǎn)工藝可以分為分步水解發(fā)酵工藝、同步糖利用釀酒酵母。然而,從纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來的化發(fā)酵工藝以及復(fù)合水解發(fā)酵工藝。糖不僅有己糖(主要是葡萄糖),還有戊糖(主要是木4.1分步水解發(fā)酵工藝( Separate hydrolysis and fer糖)。大多數(shù)工業(yè)釀酒酵母菌株不能代謝木糖。針對 mentation,SHF這個(gè)難題,研究者們主要采用兩種方法來提高從生物SHF法的工藝特點(diǎn)是纖維素水解和水解液乙醇質(zhì)衍生的混合糖的發(fā)酵產(chǎn)率。第一種方法是通過基因發(fā)酵分別在不同的容器內(nèi)進(jìn)行,早期的纖維素酶水解工程和代謝工程的方法,將其它菌株的木糖代謝途徑生產(chǎn)乙醇都采用這種工藝,其流程比較簡單。添加到酵母中。第二種方法是通過在微生物宿主細(xì)胞4.2同步糖化發(fā)酵工藝( Simultaneous saccharifica-中利用基因工程同時(shí)表達(dá)能發(fā)酵己糖和木糖的基因, tion and fermentation,SsF)13構(gòu)建工程菌,用于纖維素質(zhì)的發(fā)酵。盡管目前兩種方同步糖化發(fā)酵法是在酶水解糖化纖維素的同一容法均有較大進(jìn)展,但對混合糖的利用率和產(chǎn)率還沒有器中加入產(chǎn)生乙醇的纖維素發(fā)酵菌,使糖化產(chǎn)生的葡達(dá)到商業(yè)化的要求。另外,與從淀粉和蔗糖來的單一萄糖和纖維二糖轉(zhuǎn)化為乙醇。纖維素的酶水解糖化和葡萄糖相比,從生物質(zhì)衍生的水解物中常含有不利于發(fā)酵過程在同一裝置內(nèi)連續(xù)進(jìn)行,消除了底物葡萄糖發(fā)酵的抑制劑如醋酸、糠醛等,當(dāng)濃度較高時(shí),需要采濃度的增加對纖維素酶的反饋抑制作用。但SSF法用工藝除去或者開發(fā)超強(qiáng)菌株來解決這個(gè)難題。也存在一些抑制因素,如木糖的抑制作用、糖化溫度和在第一種方法中,木糖代謝基因已經(jīng)表達(dá)到酵母發(fā)酵溫度不協(xié)調(diào)等。消除木糖抑制的方法是利用能轉(zhuǎn)中,酵母具有葡萄糖和木糖共發(fā)酵的能力。將畢赤酵化木糖為乙醇的菌株,如假絲酵母、管囊酵母等。研究母 NADPH依賴的木糖還原酶和一個(gè)NAD依賴的較多的是利用葡萄糖與木糖的菌株混合發(fā)酵,與單純木糖醇還原酶編碼基因(XYL1.XYL2)表達(dá)到釀酒酵的葡萄糖發(fā)酵菌和單純的木糖發(fā)酵菌相比,混合發(fā)酵母中,并強(qiáng)化酵母內(nèi)部的木酮糖激酶。通過添加木糖乙醇的產(chǎn)量分別提高30%~38%和10%~30%途徑,在改進(jìn)酵母性能的同時(shí),這些重組菌中木糖發(fā)酵由同步糖化發(fā)酵法衍生出了很多類似的新工藝,還受到氧化還原輔酶因子不平衡和ATP生成的限如同步糖化共發(fā)酵法( Simultaneous saccharification制。針對氧化還原不平衡,Bro等提出了改變葡萄 and co-fermentation,SsCF)1、固定化酶糖化發(fā)酵法糖到甘油路線的四條代謝途徑,最終發(fā)現(xiàn)利用一個(gè)( Consolidated bio-processing,CBP)、非等溫同步糖NADH氧化網(wǎng)絡(luò)可將甘油產(chǎn)物替換為乙醇產(chǎn)物,解決化發(fā)酵法(NSSF)。了基因工程菌構(gòu)建后氧化還原輔酶不平衡的問題。第4.3復(fù)合水解發(fā)酵工藝( Multipl hydrolysis and fer龔大春等:纖維素乙醇的研究進(jìn)展/2007在第1期后,半纖維素和纖維素分別進(jìn)行發(fā)酵,所用的發(fā)酵方法究進(jìn)展[].釀酒科技,2006,(8):97-100是多種方法的結(jié)合,如糖化時(shí)可以是酸處理和酶處理4潘亞杰,張雷,郭軍,等,農(nóng)作物秸稈生物法降解的研究[J,可結(jié)合來完成,發(fā)酵時(shí)根據(jù)纖維素和半纖維素的性質(zhì)也再生能源,2005,(3):33-355]羅鵬,劉忠,王高升,蒸汽爆破預(yù)處理?xiàng)l件對麥草生物轉(zhuǎn)化為乙可采用不同的發(fā)酵方法相結(jié)合醇影響的研究[J],釀酒科技,2005,(10):43-47中科院生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳洪章等在[61 Eggeman T, Flanders t. Process and economic analysis of pre-分析了傳統(tǒng)SSF法后,提出秸稈分層多級轉(zhuǎn)化液體燃treatment technologies[ J]. Bioresource Technology, 2005, 96料的新構(gòu)思,即以秸稈“組分分離、分級定向轉(zhuǎn)化”為核(18):2019-2025心,將生物轉(zhuǎn)化和熱轉(zhuǎn)化有機(jī)結(jié)合,多級轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料[7 Teter S, Cherry J, Ward C et al. Variants of cellobiohydrolase I乙醇與生物油。秸稈經(jīng)過不添加任何化學(xué)藥品的低壓from Trichoderma reesei with improved properties [P].USP2005048619爆破新技術(shù)處理后,采用高濃度發(fā)酵一分離乙醇耦合[81DyAG. Novel variant Hypocrea jecorina CBH I cellulases系統(tǒng),可降低纖維素酶用量和費(fèi)用,提高纖維素酶解效their production with recombinant cells. and their uses P]. USP率,簡化操作過程,使蒸餾前乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過60%,2004016760.而且減少了發(fā)酵剩余物中的廢水量。[9 Bower B S Fusion proteins of an exocellobiohydreand an endoglucanase for use in the saccharification of cellulose and hemi-5結(jié)語cellulose[ P]. USP 200509307310 Vaaje-Kolstad G. Houston D R. Riemen A H K. et al. Crystal近幾年來,木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的研究取得了有ructure and binding properties of the Serratia arcescer意義的進(jìn)展。建立可商業(yè)化的工藝的關(guān)鍵是降低每個(gè)tin-binding protein CBP21[J]. J Biol Chem, 2005. 280(12)單元操作的工藝成本和運(yùn)行成本。通過對預(yù)處理工藝11313-11319[11 Vardakou M. Flint J. Christakopoulos P, et al. A family 10特點(diǎn)的深刻認(rèn)識,建立低成本的預(yù)處理工藝是纖維素乙thermoascus aurantiacus xylanase utilizes arabinose decorations醇開發(fā)首先要解決的問題。然后利用蛋白質(zhì)工程和基of xylan as significant substrate specificity determinants [J].J因工程等技術(shù)有望進(jìn)一步降低酶的成本,產(chǎn)生具有更好Mol biol,2005,352(5):1060-1067特定活性的商業(yè)化酶。加強(qiáng)對半纖維素酶的應(yīng)用基礎(chǔ)12] Bro Christoffer, Regenberg birgitte, Forster Jochen. In silico ai研究是一個(gè)重要方向。利用微生物代謝工程和基因工ded metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for程等手段進(jìn)行商業(yè)化的混合糖發(fā)酵的釀酒酵母的選育proved bioethanol production[J]. Metabolic Engineering, 2006是纖維素乙醇開發(fā)的關(guān)鍵。最后,微生物轉(zhuǎn)化為多種糖131 Kadar Z, Szengyel z,Reyk. Simultaneous saccharification再到乙醇的工藝也在不斷改進(jìn)之中。相信在不遠(yuǎn)的將and fermentation(SSF) of industrial wastes for the produc來會產(chǎn)生可與淀粉質(zhì)乙醇媲美的低成本高產(chǎn)量的纖維ethanol [J]. Industrial Crops and Products, 2004,20(1).素乙醇生產(chǎn)工藝,推動纖維素乙醇的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程參考文獻(xiàn)[14 Ohgren Karin, Vehmaanper a Jari. Siika-Aho Matti et al. High[1] Kotrba R. Keeping pace with policyLJ]. Ethanol Producer Magtemperature enzymatic prehydrolysis prior to simultaneous sac-[2 Mosier N, Wyman C, Dale B, et al. Features of promising techethanol production[J. Enzyme and Microbial Technology, 2006nologies for pretreatment of lignocellulosic biomass [J]. Biore(in press)source Technology. 2005. 96(6): 673-686「15]陳洪章,徐建,姚建中,等.秸稈分層多級轉(zhuǎn)化液體燃料新工藝3]文新亞,李燕松,張志鵬,等.酶解木質(zhì)纖維素的預(yù)處理技術(shù)研的研究進(jìn)展[冂].生物加工過程,2005,3(1):9-13Advances of research on bioethanol from ligncelluloseGONG Da-chun, TIaN Yi-hong, LI De-ying, GONG Mei-zhen, tU Zhi-ying(The Institute of Research on Renewable Energy of Three GorgesJniversity-Alan. G. Macdiarmid, Yichang 443002, China)Abstract: Much advances of research on bioethanol from ligncellulosic biomass have been made over thepast few years, which make commercialization more promising. The pretreating methods, the enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. the breeding of effective strains for fermentation and the development of the