.24N1化學與生物工程纖維素乙醇的研究進展龔大春,田毅紅,李德瑩,龔美珍,涂志英三峽大學一艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所,湖北宜昌443002)摘要:近年來以纖維素類生物質為原料制備乙醇的研究取得了許多進展,使纖維素乙醇的開發(fā)更具商業(yè)化前景。重點介紹了木質纖維素轉化為乙醇的原料預處理方法、纖維素和半纖維素的酶法降解、有效可靠的發(fā)酵菌種的選育及木質纖維素乙醇制備工藝的開發(fā)關鍵詞:木質纖維素;生物乙醇;進展中圖分類號:TQ223.12TQ517.44文獻標識碼:A文章編號:1672-5425(2007)01-0004-0321世紀所面臨的能源、資源、環(huán)境等危機,已成為進一步降低酶制劑的成本。人類文明發(fā)展的主要障礙。人們正在努力尋找替代化2.1產纖維素酶工程菌的構建石燃料的新能源,以降低對不可再生能源的依賴、控制利用基因工程方法可改善纖維素酶的性能、降低二氧化碳的排放、保護生態(tài)環(huán)境。纖維素原料是地球糖化生物質底物所需的酶量。對于纖維素酶工程菌最上產量最大的可再生資源,包括林木、農作物秸稈、農初的目標是纖維二糖酶,它們在天然纖維素酶系中副產品加工下腳料等,在自然生態(tài)系統(tǒng)的能量流與物般占60%~80%。 Teter等利用定點突變、定向飽質循環(huán)流中有重要地位,開發(fā)以木質纖維素為原料制和突變、PCR擴增和DNA分子進化,產生了里氏木酶備乙醇的工藝是未來乙醇生產的發(fā)展方向。的變種,突變株在酵母中表達,通過選育改善其熱穩(wěn)定作者在此重點闡述近幾年有效的木質纖維素生物性和熱活性。重組菌的綜合性能超過母本,用于預處轉化為乙醇的研究進展。在生物轉化工藝中主要有三理后的玉米秸稈的水解。Day也利用定點突變,得步:纖維素預處理、纖維素酶解、酵母發(fā)酵及乙醇分離。到新的 Hypocreajecorena纖維二糖酶Cel7A(CBH1)變種,幾個突變株表達在里氏木酶中顯示出好的熱穩(wěn)1纖維素預處理工藝定性和可逆性。纖維素原料預處理方法主要有物理方法、化學方另一種方法是將異源酶引入里氏木酶系統(tǒng)中,加法、物理化學法和生物法。最有工業(yè)化前景的預處理方強整個體系的性能。 Bower介紹了將幾個菌的內切法是物理化學法:低壓氨爆和CO爆破。在蒸汽爆破酶引入里氏木酶的方法。從 Acidothermus cellulo過程中,纖維素結晶度和聚合度下降,細胞結構被破壞, anticus來的GH5A蛋白,被融合到里氏木酶的纖維二從而破壞纖維素一半纖維素一木質素的結構,半纖維素糖酶中,表達在里氏木酶中,發(fā)現在纖維素的糖化過程通過自水解作用轉變成單糖和寡糖,部分木質素的B芳中具有更高的活性,結果顯示6h達到20%的纖維素醚鍵斷裂且發(fā)生部分縮合作用。由于化學方法涉及濃轉化率,用母本的纖維素酶則需要10h酸、濃堿,對生物質的主要成分會有不同的影響。另外,2.2酶一底物相互作用機理的研究技術經濟分析對主要的預處理方法進行原料成本評價碳水化合物鍵合的模型(CBMs)表明,通過和結和性能評價對工業(yè)化工藝的選擇至關重要6。晶纖維素表面鍵合,靶向鎖定特定底物的催化活性中2纖維素和半纖維素的酶法降解心,通過提高表面的有效濃度,可加強酶的催化活性同時有人認為酶的靶點在取向時,能裂解多糖的結構,近幾年,從細菌和真菌里分離得到新的纖維素酶從而加和半纖維素酶。依靠基因工程、酶工程和發(fā)酵工藝將有效H中國煤化工 aje-Kolstad等提出CNMHG個小的非催化蛋白基金項目:湖北省教育廳重大項目(D200613006)收稿日期:2006-10-11作者簡介:龔大春(1967—),男,湖北人,博士,副教授,碩士生導師,主要從事生物催化與生物轉化領域的研究。 E-mail:dchgng2004@163.com。龔大春等:纖維素乙醇的研究進展/2007年第1期CBP21的存在。由于CBP21可以鍵合到結晶底物中,受木糖醇抑制,敲出醛還原酶基因(Gre3)是必要的導致底物的結構發(fā)生變化,從而提高了酶的水解能力?？梢允箯哪就堑侥咎谴嫉漠a量降到最低,獲得更高2.3半纖維素酶的產率和速率。這些最新的研究結果顯示利用重組酵半纖維素的有效降解需要許多酶的協(xié)同作用,最母改善木糖發(fā)酵已取得巨大進步。在國內,利用木糖重要的是半纖維素酶的參與。半纖維素酶的商業(yè)化開和葡萄糖的酵母工程菌的構建從2002年開始研究,其發(fā)遠沒有纖維素酶先進,因為目前纖維素乙醇的商業(yè)中山東大學曲音波教授和鮑曉明教授、大連理工大學化制備主要采用稀酸預處理生物質,而半纖維素在糖白鳳武教授和中科院江寧硏究員做了大量工作。但國化之前就已去除。然而隨著非酸預處理方法的開發(fā),內對木糖代謝的下游疏通、輔酶工程和綜合考慮代謝半纖維素還殘留在緊密層,就要求半纖維素酶的參與。流提高乙醇總收率的研究還亟待加強目前從木酶得到的半纖維素酶活性較弱,不能完全轉化為單糖。近年,通過了解木糖酶和半纖維素酶木質纖維素乙醇制備工藝的開發(fā)CBMs的特點,半纖維素酶的開發(fā)取得了不斷的進纖維素乙醇的制備工藝主要有酸水解、酶水解乙展。開發(fā)低成本商業(yè)化的半纖維素酶和纖維素酶協(xié)同醇生產工藝兩大類。目前酸水解工藝的研究較少,較作用,用于生物乙醇的生產,將是未來的研究重點酶水解工藝來說,其研究和發(fā)展?jié)摿ο鄬^弱,美國的己糖和戊糖共發(fā)酵工程菌的選育Vulcan化工公司和加拿大的 Stake公司已經完成了用木屑酸水解制備乙醇的全部設計工作。纖維素酶水以淀粉和蔗糖為原料生產乙醇的生物轉化過程是解乙醇生產工藝可以分為分步水解發(fā)酵工藝、同步糖利用釀酒酵母。然而,從纖維素類生物質轉化而來的化發(fā)酵工藝以及復合水解發(fā)酵工藝。糖不僅有己糖(主要是葡萄糖)·還有戊糖(主要是木4.1分步水解發(fā)酵工藝( Separate hydrolysis and fer糖)。大多數工業(yè)釀酒酵母菌株不能代謝木糖。針對 mentation,SHF這個難題,研究者們主要采用兩種方法來提高從生物SHF法的工藝特點是纖維素水解和水解液乙醇質衍生的混合糖的發(fā)酵產率。第一種方法是通過基因發(fā)酵分別在不同的容器內進行,早期的纖維素酶水解工程和代謝工程的方法,將其它菌株的木糖代謝途徑生產乙醇都采用這種工藝,其流程比較簡單添加到酵母中。第二種方法是通過在微生物宿主細胞4.2同步糖化發(fā)酵工藝( Simultaneous saccharifica中利用基因工程同時表達能發(fā)酵己糖和木糖的基因, tion and fermentation,SSF)13構建工程菌,用于纖維素質的發(fā)酵。盡管目前兩種方同步糖化發(fā)酵法是在酶水解糖化纖維素的同一容法均有較大進展,但對混合糖的利用率和產率還沒有器中加入產生乙醇的纖維素發(fā)酵菌,使糖化產生的葡達到商業(yè)化的要求。另外,與從淀粉和蔗糖來的單萄糖和纖維二糖轉化為乙醇。纖維素的酶水解糖化和葡萄糖相比,從生物質衍生的水解物中常含有不利于發(fā)酵過程在同一裝置內連續(xù)進行,消除了底物葡萄糖發(fā)酵的抑制劑如醋酸、糠醛等,當濃度較高時,需要采濃度的增加對纖維素酶的反饋抑制作用。但SSF法用工藝除去或者開發(fā)超強菌株來解決這個難題也存在一些抑制因素,如木糖的抑制作用、糖化溫度和在第一種方法中,木糖代謝基因已經表達到酵母發(fā)酵溫度不協(xié)調等。消除木糖抑制的方法是利用能轉中,酵母具有葡萄糖和木糖共發(fā)酵的能力。將畢赤酵化木糖為乙醇的菌株,如假絲酵母、管囊酵母等。硏究母 NADPH依賴的木糖還原酶和一個NAD依賴的較多的是利用葡萄糖與木糖的菌株混合發(fā)酵,與單純木糖醇還原酶編碼基因αXYL1,ⅩYL2)表達到釀酒酵的葡萄糖發(fā)酵菌和單純的木糖發(fā)酵菌相比,混合發(fā)酵母中,并強化酵母內部的木酮糖激酶。通過添加木糖乙醇的產量分別提高30%~38%和10%~30%途徑,在改進酵母性能的同時,這些重組菌中木糖發(fā)酵由同步糖化發(fā)酵法衍生出了很多類似的新工藝還受到氧化還原輔酶因子不平衡和ATP生成的限如同步糖化共發(fā)酵法( Simultaneous saccharification制。針對氧化還原不平衡,Bro等2提出了改變葡萄ndco中國煤化工固定化酶糖化發(fā)酵法糖到甘油路線的四條代謝途徑,最終發(fā)現利用一個( ConsCN MH GBP)、非等溫同步糖NADH氧化網絡可將甘油產物替換為乙醇產物,解決化發(fā)酵法(NSSF)了基因工程菌構建后氧化還原輔酶不平衡的問題。第4.3復合水解發(fā)酵工藝( Multipl hydrolysis and fer種方法是用一個木糖異構酶表達在酵母中替代還原 mentation,MHF酶和脫氫酶,以避免氧化還原不平衡的問題。異構酶復合水解發(fā)酵工藝是將纖維素原料進行預處理龔大春等:纖維素乙醇的研究進展/2007年第1期后,半纖維素和纖維素分別進行發(fā)酵,所用的發(fā)酵方法究進展[冂].釀酒科技,2006,(8):97-100是多種方法的結合,如糖化時可以是酸處理和酶處理4潘亞杰,張雷,郭軍,等農作物秸稈生物法降解的研究[J.可結合來完成,發(fā)酵時根據纖維素和半纖維素的性質也再生能源,2005,(3):33-355]羅鵬,劉忠,王高升.蒸汽爆破預處理條件對麥草生物轉化為乙可采用不同的發(fā)酵方法相結合醇影響的研究[冂].釀酒科技,2005,(10):43-47.中科院生化工程國家重點實驗室陳洪章等在6] Eggeman T., Elander R T. Process and economic analysis of分析了傳統(tǒng)SSF法后,提出秸稈分層多級轉化液體燃treatment technologies[J]. Bioresource Technology, 2005,96料的新構思,即以秸稈“組分分離、分級定向轉化”為核(18):2019-2025心,將生物轉化和熱轉化有機結合,多級轉化生產燃料[7 Teter S, Cherry J. Ward C et al. Variants of cellobiohydrolase Ifrom Trichoderma reesei with improved properties [ P]. USP乙醇與生物油。秸稈經過不添加任何化學藥品的低壓2005048619爆破新技術處理后,采用高濃度發(fā)酵一分離乙醇耦合[8] Day A G. Novel variant Hypocrea jecorina CBH I cellulases,系統(tǒng),可降低纖維素酶用量和費用,提高纖維素酶解效their production with recombinant cells, and their uses P]. USP率,簡化操作過程,使蒸餾前乙醇質量分數超過60%,2004016760而且減少了發(fā)酵剩余物中的廢水量9 Bower B S Fusion proteins of an exocellobiohydrolase and an en-doglucanase for use in the saccharification of cellulose and hem結語cellulose[ P]. USP 2005 093073[10 Vaaje-Kolstad G. Houston DR, Riemen A H K. et al. Crystal近幾年來,木質纖維素轉化為乙醇的研究取得了有cture and binding properties of the Serratia marcescens chi-意義的進展。建立可商業(yè)化的工藝的關鍵是降低每個tin-binding protein CBP21[J]. J Biol Chem, 2005, 280(12)單元操作的工藝成本和運行成本。通過對預處理工藝特點的深刻認識建立低成本的預處理工藝是纖維素乙1] Vardakou m,Fint1, Christakopoulos P.ta. A family1othermoascus aurantiacus xylanase utilizes arabinose decoration醇開發(fā)首先要解決的問題。然后利用蛋白質工程和基of xylan as significant substrate specificity determinants[JI因工程等技術有望進一步降低酶的成本,產生具有更好Mol biol.2005,352(5):1060-106特定活性的商業(yè)化酶。加強對半纖維素酶的應用基礎12] Bro Christoffer, Regenberg birgitte, Forster Jochen. In silico ai-研究是一個重要方向。利用微生物代謝工程和基因工ded metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for程等手段進行商業(yè)化的混合糖發(fā)酵的釀酒酵母的選育duction[J]. Metabolic Engineering, 2006(2):102-111是纖維素乙醇開發(fā)的關鍵。最后,微生物轉化為多種糖131 Kadar2s,sgd2z, Reczey K. Simultaneous saccharification再到乙醇的工藝也在不斷改進之中。相信在不遠的將and fermentation(SSF)of industrial wastes for the production o來會產生可與淀粉質乙醇媲美的低成本高產量的纖維ethanol [J]. Industrial Crops and Products, 2004,20(1):103素乙醇生產工藝,推動纖維素乙醇的產業(yè)化進程。參考文獻[14] Ohgren Karin, Vehmaanper a Jari. Siika-Aho Matti, et al. High[1] Kotrba R. Keeping pace with policyLJ]. Ethanol Producer Magatemperature enzymatic prehydrolysis prior to simultaneous sac-charification and fermentation of steam pretreated corn stover for[2 Mosier N, Wyman C, Dale B, et al. Features of promising techethanol production[J. Enzyme and Microbial Technology, 2006nologies for pretreatment of lignocellulosic biomass [J].Biore-(in press)source Technology. 2005, 96(6):673-68615]陳洪章,徐建,姚建中,等.秸稈分層多級轉化液體燃料新工藝文新亞,李燕松,張志鵬,等.酶解木質纖維素的預處理技術研的研究進展[].生物加工過程,2005,3(1):9-1Advances of research on bioethanol from ligncelluloseGONG Da-chun, tian Yi-hong, LI De-ying, GONG Mei-zhen, TU Zhi-ying(The Institute of Research on Renewable Energy of Three GorgesUniversity-Alan, G. Macdiarmid, Yich中國煤化工Abstract: Much advances of research on bioethanol from liCN MH Ge beeen made overpast few years, which make commercialization more promising. The pretreating methods, the enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose, the breeding of effective strains for fermentation, and the development of thegy for ligncellulose are mainly introducedKeywords: ligncellulose; bioethanol; advance