科技論壇多肽固相合成宋曉驥王立策(吉林化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院吉林市特殊設(shè)備檢驗(yàn)中心1320000摘要:多肽固相化學(xué)合成法是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域非常重要的研究方法之一,可分為 Merrifield和Fmoc方法,在生物藥物、蛋白質(zhì)工程、免疫學(xué)等研究中得到了廣泛的應(yīng)用。介紹了多肽的固相合成法,包括多肽合成原理、固相多肽合成的分類(lèi)、合成步驟。關(guān)鍵詞:多肽;固相合成;方法;分類(lèi);步驟1概述量,其他氨基酸活化的方法為4 eq Fmoc保護(hù)氨基酸、3.6cq自 Merrifield刨立并發(fā)展固相合成多肽方法,使得多肽合成領(lǐng) mmolHBTU、4HOBt和8 eq. DIPEA溶于40 mLDMF中,將反應(yīng)液域取得了重大突破,對(duì)生化、醫(yī)藥、免疫及分子微生物學(xué)等領(lǐng)域起到加入固相反應(yīng)器中室溫?fù)u蕩2小時(shí)。耦合完畢后,用 Kaiser's試劑進(jìn)了巨大的推動(dòng)作用。隨著對(duì)連接分子、脫除方法和保護(hù)基的不斷研行檢測(cè),若反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性說(shuō)明耦合不完全,重復(fù)耦合步驟究,近年來(lái)固相方法在多肽合成上的應(yīng)用發(fā)展迅速。利用這一方法2.33多肽的切除和沉淀幾乎能夠高收率地制備任何多肽。樹(shù)脂用DCM洗滌幾遍后,真空抽干。往裝有樹(shù)脂的多肽固相反1963年, Merrifield提出固相合成多肽的思想,現(xiàn)在固相多肽合應(yīng)器中緩慢加入:三氟乙酸/三異丙基硅烷/水(TFA/ms/HO)成技術(shù)已經(jīng)成為多肽合成中的一種常規(guī)技術(shù),除了 Merrifield當(dāng)年=95/2.525(w)溶液50mL,反應(yīng)3小時(shí)。過(guò)濾,氮?dú)獯等ゴ蟛糠值慕⒌腂oc固相法外,1978年 Meienlofer和 Atherton等人采用溶劑后,向殘液中倒入20.0mL無(wú)水乙醚,出現(xiàn)白色絮狀沉淀,在Carpino報(bào)道的Fmoc基團(tuán)作為氨基保護(hù)基,成功的進(jìn)行了多肽合4000RM轉(zhuǎn)速,5℃條件下離心5分鐘,倒去溶劑乙醚,向沉淀中加成。Fmoc固相法已得到廣泛的應(yīng)用并愈加受到人們的重視。多肽固入無(wú)水乙醚200mL,振蕩,同樣條件下離心5分鐘,再重復(fù)一次,除相合成法在藥物研究領(lǐng)域、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域、免疫學(xué)研究領(lǐng)域去大部分的雜質(zhì)。沉淀真空干燥24小時(shí)。固體殘留物用離子水溶呈現(xiàn)著不可比擬的優(yōu)越性。多肽固相合成法在生物制藥及蛋白質(zhì)工解,冷凍干燥得到白色絮狀固體,-20℃保存。程中有著廣闊的應(yīng)用前景234多肽的分離純化目前,大量合成多肽,可以采用多肽合成儀,通過(guò)改進(jìn)多肽合成將凍干的粗品多肽,溶于20%乙腈/水溶液進(jìn)行高效液相色譜儀的功能,可使合成過(guò)程完全自動(dòng)化,從而提高合成效率,節(jié)約試(HPLC)分離。HPLC在 Waters-600E多通道系統(tǒng)上進(jìn)行,選用DE-劑,降低成本。Ⅴ ELOSIL ODS-UG-5C18半制備柱。(10.0×250mm)和Wa-2多肽固相合成ters-2487紫外檢測(cè)器(A=215和254mm),或 Varian( Pro Star215)2.1原理CC1254 nucleodur cl8 gravity制備柱。用含有0.6%TFA的乙腈和首先對(duì)組成目的肽的氨基酸進(jìn)行改造,使其成為氨基末端帶有水溶液進(jìn)行梯度洗脫。收集主要峰產(chǎn)物,進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜或MAL保護(hù)基的氨基酸。將目的肽第一個(gè)氨基酸的羧基以共價(jià)鍵的形式與D-TOF質(zhì)譜鑒定。減壓旋蒸除去HPLC的樣品鋒中的乙腈。在冷凍固相載體相連,再以這一氨基酸的氨基為合成起點(diǎn),使其與相鄰氨干燥機(jī)上冷凍干燥,獲得目標(biāo)產(chǎn)物多肽,多肽樣品-20℃保存?；岬聂然l(fā)生酰化反應(yīng),形成肽鍵。然后讓包含有這兩個(gè)氨基酸24檢測(cè)方法的樹(shù)脂肽的氨基與下一個(gè)氨基酸的羧基反應(yīng),不斷重復(fù)這一過(guò)程最終產(chǎn)物經(jīng)過(guò)ESI-Ms方法鑒定,ES-MS采用軟電離方式,電直至目的肽形成為止。接著目的肽從樹(shù)脂上裂解,進(jìn)行氧化折疊,這離后的分子化學(xué)鍵一般不會(huì)被破壞,因此可以直接得到較強(qiáng)的分子樣得到了人上合成肽的粗產(chǎn)品。再進(jìn)行純化,化學(xué)修飾,進(jìn)行活性鑒離子鋒數(shù)據(jù),試驗(yàn)得到目標(biāo)化合物有分子離子峰、加鈉的分子離子定。重復(fù)上述步驟,即縮合-洗滌-去保護(hù)-洗滌-縮合,直至得峰和加鉀的分子離子峰。到目的肽鏈。質(zhì)譜條件:樣品溶解于甲醇,通過(guò) Cole-Parmer74900注射泵打22分類(lèi)入電噴霧質(zhì)譜。電噴霧質(zhì)譜條件:噴霧器壓力為70或11.0Psi,干燥固相多肽合成在近幾十年的發(fā)展中逐漸分化為2種類(lèi)型。①器(N2)流速為40或80L分鐘,溫度為300℃。噴霧針電壓為Merrifield固相合成,也稱(chēng)為Boc固相合成。② Atherton和 Shepar所4kV。發(fā)展的Fmoc固相合成法。由于脫Fmoc保護(hù)基以及將產(chǎn)物從樹(shù)脂3結(jié)論上切下時(shí)反應(yīng)條件溫和,而且與Boc固相合成相比Fmoc固相合成多肽合成的成功與采用的活化偶聯(lián)等方法有關(guān),但更多的是的副反應(yīng)少,所以Fmo固相合成法已經(jīng)被廣泛采用。取決于選擇性保護(hù)脫保護(hù)策略。在“最小保護(hù)”策略下,醇和酚性羥Fmoc固相合成法是常用的多肽合成方法,其反應(yīng)條件溫和單基、巰基、甚至羧基都可以不加保護(hù)但只限于使用中度活潑的酰步反應(yīng)產(chǎn)率高達(dá)98%以上。化劑,例如活潑酯。假如大量地試用?；瘎?或者當(dāng)使用更活潑的中23固相多肽合成的基本步驟間體時(shí),最小保護(hù)”策略就不適用。在固相載體上增長(zhǎng)肽鏈,如果使以Fmoc策略固相合成多肽為例用酸酐或DCC-HOBt方法,就需要更大的保護(hù),在極端情況下就是231樹(shù)脂的活化最大保護(hù)”。在中等保護(hù)或最大保護(hù)策略中,脫保護(hù)時(shí)的選擇性至取一定量的樹(shù)脂置于固相反應(yīng)器中,加入50mL無(wú)水DMF浸關(guān)重要。最終除去合成的肽鏈上的一切保護(hù)基是極為關(guān)鍵的操作,泡溶脹2小時(shí),減壓抽去溶劑DMF。應(yīng)當(dāng)引起極大的注意,以便保證組合起來(lái)的肽鏈不受傷害。新型2.32氨基酸的耦聯(lián)Fmoc固相多肽合成方法的優(yōu)越性正在逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。即以活化的Fmo-AA-0H4.0eg-Fmoc保護(hù)氨基酸、36 q HOBt和Fmo作為a-氨基的瞬間保護(hù)基,與作為C端羧基和一系列側(cè)鏈eq DIPEA溶于40 mLDMF中。功能基的半永久性保護(hù)基(如Boc基)配套形成正交保護(hù)。每步偶聯(lián)第一氨基酸耦聯(lián)到樹(shù)脂上的方法為4 leq Fmoc保護(hù)氨基酸之后,用弱堿溶液脫Fmoc保護(hù)肽鍵形成之后用三氟乙酸脫側(cè)鏈保36 g HBTU和0.1 eq DMAP溶于40 ImLDMF中,加入8 eq DIPEA,室護(hù)。由于結(jié)晶性的活潑酯和Fmo-氨基酸的對(duì)稱(chēng)酸酐可以得到所溫?fù)u蕩反應(yīng)10小時(shí),減壓抽去溶劑,以DMF(4.0mL×5)洗滌樹(shù)脂。以該研究方法切實(shí)可行并很快得到泛應(yīng)用加入乙酸酐:吡啶:DMF=2:1:3的溶液60mL,搖蕩30分鐘,封閉樹(shù)中國(guó)煤化工脂上未反應(yīng)的官能團(tuán)。依次用DMF(40mL×3),DCM(40mL×3)和CNMHGDMF(40mL×3)洗滌樹(shù)脂,20%派啶/MF脫保護(hù)(4.mL×3),時(shí)間為10分鐘和20分鐘。然后開(kāi)始進(jìn)行接肽反應(yīng),每一輪都按表中程序進(jìn)行。除了Fmoc-Ser/Thr(AcxB- 0-GlcNAc)OH是采用兩倍用