第27卷第5期可耳生能Vol 27 No 5009年10月renewable Energy Resources0ct.2009微生物選育技術(shù)在生物燃料乙醇生產(chǎn)中的應用張敏,劉慶玉,陳東雨,李金洋(沈陽農(nóng)業(yè)大學丁程學院,遼寧沈陽110161)摘要:隨著全球性能源危機、糧食危機和環(huán)境危機的到來燃料乙醇作為汽油的替代品日益受到關(guān)注。應用微生物發(fā)酵技術(shù)將甘蔗、玉米、木薯和纖維類廢棄物等轉(zhuǎn)化為燃料乙醇已成為解決世界能源危機的一條理想途徑。通過對環(huán)境中各種微生物進行篩選分離和育種,可以得到轉(zhuǎn)化能力較強的高效菌株,將這些高效菌株應用于燃料乙醇生產(chǎn)中,能夠有效提高燃料乙醇的生產(chǎn)效率。文章對微生物選育技術(shù)在燃料乙醇生產(chǎn)中的應用進行了總結(jié)與展望。關(guān)鍵詞:菌種選育;生物質(zhì)能源;燃料乙醇中圖分類號:TK6;Q93文獻標志碼:A文章編號:1671-5292(2000050052-03Application of microorganism selecting and breeding technologyin the production of fuel ethanolZHANG Min, LIU Qing-yu, CHEN Dong-yu, LI Jin-yangCollege of Engineering, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)Abstract: With the forthcoming of the crises of global energy, food and environmental, more andmore attention has been focused on fuel ethanol, which will be the substitute of gasoline. The con-version of sugarcane, com, cassava and fiber waste to fuel ethanol by microbial fermentation techniques has become an ideal approach to settle the worldwide energy crisis. the strains of high efficient and strong conversion ability could achieved by separating and breeding microorganism inthe environment. Production efficiency of fuel ethanol was effectively improved by applying theseand breed technology for the production of fuel ethanol was illustrated and forecasted selectingmicrobial strains to production of fuel ethanol. In this paper, application of microorganiKey words: strain breeding: biomass energy; fuel ethanol0引言研究,如日本的“陽光計劃”、美國的“能源農(nóng)場”和目前,現(xiàn)代社會賴以生存與發(fā)展的化石能源巴西的“酒精能源計劃”等。我國是一個生物質(zhì)正日漸枯竭,已成為制約未來社會發(fā)展的潛在危資源豐富的國家,利用現(xiàn)代技術(shù)將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為機。開發(fā)清潔的可再生能源是解決能源危機、減少高效潔凈方便的高品位能源,對緩解能源危機環(huán)境污染、走可持續(xù)發(fā)展道路的重要途徑之一。生食品短缺和環(huán)境污染等狀況,促進社會經(jīng)濟的可物質(zhì)資源是人類賴以生存的基本物質(zhì)來源,其中持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的改善都具有重要意義。僅10%被人類利用作為食物和工業(yè)原料,而90%纖維素的降解是纖維素利用過程中最主要的的生物質(zhì)資源未被人類充分利用。自20世紀70化學反應。纖維素降解主要包括酸降解堿降解年代以來,工業(yè)發(fā)達國家對生物質(zhì)能開展了許多氧化降解和微生物降解等幾種類型,其中利用微收稿日期:200905-19中國煤化工基金項目:沈陽農(nóng)業(yè)大學青年教師科研基金資助項目(20081005)。CNMHG作者簡介:張敏(1978-),女博士,講師,主要從事農(nóng)業(yè)生物環(huán)境與能源ror-mau:uuunung412@163.com5敏,等微生物選育技術(shù)在生物然料乙醇生產(chǎn)中的應用生物所產(chǎn)纖維素酶對纖維素進行降解是最理想、變纖維單細胞菌,得到1株抗阻遏突變株M7,使最有效的途徑,也是當今纖維素降解研究的熱酶產(chǎn)量成倍提高。曲音波利用篩選到的斜臥青點。微生物是對纖維素進行生物處理的主體,因霉進行抗阻遏誘變,突變株JU1的濾紙CMC酶此,只有掌握了微生物的基本生理特性、分離篩活分別達到33,234mg/(mLh門。馮培勇以1株選方法才能培育出髙效的優(yōu)勢菌種,獲得較好的綠色木霉為出發(fā)菌株,經(jīng)過亞硝基胍、硫酸二乙酯處理效果。和氯化鋰誘變處理后,得到1株產(chǎn)酶活力較高的1微生物選育的意義菌株L6,其酶活較出發(fā)菌株提高了35.7%。張秋生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成的糖類主要有葡萄糖、木糖、卓以里氏木霉ZM-4為出發(fā)菌株,研究了紫外誘阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖。充分利用這5類糖,變、硫酸二乙酯誘變以及紫外與硫酸二乙酯復合是獲得高乙醇產(chǎn)率的關(guān)鍵。開發(fā)可發(fā)酵混合糖的交替誘變等不同誘變方法對其產(chǎn)纖維素酶能力的微生物,是促進生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇工藝發(fā)展的關(guān)影響,結(jié)果表明,復合交替誘變的正突變率最高,鍵。因此,要想充分發(fā)揮微生物在纖維素轉(zhuǎn)化為乙達45.98%,其中突變株ZM4F3具有最高的產(chǎn)酶醇中的作用,提高其酶活力,除了進一步改進工藝能力,比出發(fā)菌株ZM-4提高了1975%,在對外,更重要的是要加強高效菌株的選育工作,改良ZM4F3進行6代連續(xù)培養(yǎng)后,仍能保持較髙及菌種,以獲得適應能力強、產(chǎn)酶活性高、可以大規(guī)穩(wěn)定的產(chǎn)酶能力,可以應用于工業(yè)生產(chǎn)。毛培宏模應用的高效工程菌將低能N注入枯草芽孢桿菌Hy2中,選育出了2燃料乙醇生產(chǎn)中菌株的選育方法CMCase和FPA分別提高25倍和41倍的纖維菌種選育包括根據(jù)菌種自然變異而進行的自素酶組成型突變株Hy2-331,并研究了Hy2然選育,根據(jù)遺傳學基礎(chǔ)理論和方法,人為引起的3311的酶系組成和酶學性質(zhì),發(fā)現(xiàn)Hy2-311的菌種遺傳變異或基因重組,如誘變育種、雜交育酶系發(fā)生了很大的變化,并且各酶純組分的酶學種、原生質(zhì)體融合、基因工程等技術(shù)。性質(zhì)也發(fā)生了變化,不僅提高了對可溶性纖維素2.1自然界篩選與馴化的降解能力,也提高了對不溶性纖維素的降解能從自然界直接分離篩選出高產(chǎn)乙醇降解菌株力兩。武秀琴以黑曲霉為出發(fā)菌株,通過紫外線是育種工作中最經(jīng)濟實用的方法。吳海龍通過對(15W,照射距離30cm左右,照射時間8min)和秸稈和牛糞干的增殖培養(yǎng),從中分離出42株菌硝酸的復合誘變,復篩得到纖維素酶高產(chǎn)菌株,纖株,經(jīng)濾紙條崩解試驗、溶菌圈大小測定及CM-維素酶活力提高了6110%,濾紙酶活力提高了Case(羧甲基纖維素酶活)測定,篩選得到1株代64.01%叫。號為GNA120,對纖維素降解具有優(yōu)勢的放線菌吲。23原生質(zhì)體融合技術(shù)育種王敏釆用富集培養(yǎng)法,在高溫條件下對酵母細胞原生質(zhì)體融合技術(shù)廣泛應用于各類微生物遺進行培養(yǎng),通過篩選得到1株在45℃高溫下生長傳育種中,其作為一種更為隨機的基因重組方式,良好的菌株,發(fā)酵溫度為42℃,且發(fā)酵能力較強,能夠克服細胞壁這一天然屏障,排除接合型的限72h失重為69g。制,實現(xiàn)多基因重組;還可直接采用生產(chǎn)性狀好的22誘變育種菌株作為親本,加速工業(yè)菌種改良進程,為燃料乙誘變育種是利用物理或化學的方法(如紫外醇微生物菌種的選育提供了一條嶄新的途徑。毛線、X-射線、Y-射線、亞硝基胍、微波等誘變劑)處華進行了 pickiastipitis和 Sacchromyces cerevisi-理微生物群體,促使少數(shù)個體細胞遺傳物質(zhì)(主要a屬間原生質(zhì)體融合融合子能發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒是DNA)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使基因內(nèi)部的堿精,其在厭氧環(huán)境下發(fā)酵木糖和木糖一葡萄糖混基配對發(fā)生差錯,從而引起微生物的遺傳性狀發(fā)合液的能力明顯優(yōu)于親株,耐乙醇能力也比Pk生突變使人們可以簡便、快速地篩選出各種類型 lastiputLs有所提高。 Kordowska通過研究表明,畢的突變菌株赤酵中國煤化工乙醇能力高于畢目前這方面研究的報道較多,采用的誘變手赤酵CNMHG率有所下降段各異,均取得較好的效果。wart首先用Uv誘也有把h〔H與冒獲陣切屜合起來,得到的可耳生能漁2009,27(5)融合子的耐乙醇能力有所提高,但產(chǎn)乙醇能力沒糖→3-磷酸甘油醛+乙酰磷酸→乙酰CoA→乙有提高四。張華山以糖化酵母和釀酒酵母為親醛,重組酵母降低了副產(chǎn)物木糖醇的量,乙醇得本,采用單親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)進行屬間融率比親株提高25%。合,同時對酵母原生質(zhì)體的形成和再生條件進行3結(jié)束語了探索,取培養(yǎng)6-8h的單倍體,在30℃條件下雖然通過菌株的篩選以及基因工程等手段使用20%的蝸牛酶酶解Ih時,其形成率超過乙醇產(chǎn)量得到了提高,但是纖維素原料的水解以92%,對雙親與融合子的細胞大小、DNA含量、淀及發(fā)酵木糖生產(chǎn)酒精的工業(yè)化仍存在許多挑戰(zhàn)性粉利用率及產(chǎn)酒精能力等進行了比較研究,利用問題,因此還須要深入開展復合誘變劑處理微生獲得的融合子發(fā)酵可溶性淀粉,其乙醇得率可達物的誘變育種、基因工程育種技術(shù)以構(gòu)建出能大6.5%。規(guī)模應用于工業(yè)的高效工程菌等研究工作。采用2.4基因工程育種各種選育燃料乙醇微生物菌種的方法,得到優(yōu)良基因工程育種是指利用基因工程方法對菌株的菌株,將大幅度地提高乙醇的發(fā)酵產(chǎn)率及乙醇進行改造來獲得高產(chǎn)工程菌,或者通過微生物間產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益,對推動乙醇發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展具的轉(zhuǎn)基因來獲得新菌種的育種方法。與前兩種育有重要的現(xiàn)實意義。種技術(shù)相比,基因工程育種具有很好的定向性,為構(gòu)建髙效燃料乙醇生產(chǎn)菌開辟了新途徑,最有可參考文獻能使纖維素的分解利用問題得到突破性解決。[1 SHETTY J K, O J LANTERO, N DUNN-COLEMAN胡仕風利用限制性內(nèi)切酶介導的基因整合Technological advances in ethanol production [J).Int技術(shù)(REMI)轉(zhuǎn)化 T koningii CICC40144,共獲得Sugar.J.,2005,107:605-60623個穩(wěn)定的突變株,經(jīng)篩選獲得了1株高產(chǎn)纖(2]吳海龍張立青方萍一株產(chǎn)纖維素酶的諾卡氏屬菌維素酶木霉突變株TK-2R-14,其Cx酶活達株篩選及產(chǎn)酶條件研究門科技通報,2008,24(6):376UmL,比出發(fā)菌株提高805%,FPA酶活達3王敏,朱會霞,路玲玲,等高溫酵母的分離及其特性169U/mL,比出發(fā)菌株提高1901%叫。為了使大研究門中國釀造,2006(11):38-41.腸桿菌能夠代謝葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇,李學風將4] STEWART B J, J M LEATHEWOOD Derepressed syn運動發(fā)酵單胞菌乙醇發(fā)酵途徑中的關(guān)鍵酶基因thesis of cellulose by Cellulomonas [J]. Bacteriol丙酮酸脫羧酶基因與質(zhì)粒載體pGM-T連接轉(zhuǎn)化1976,128:609-615.至大腸桿菌TOP10中,丙酮酸脫羧酶基因在T7S曲音波高培基,王祖農(nóng)青莓的纖維素酶抗降解物阻啟動子的啟動下得到了高效表達,構(gòu)建的重組大遏突變株的選育(真菌學報,1984,3(4):238-242腸桿菌不但可以利用葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇,而且馮培勇葛宜和楊立紅,等化學誘變選育高產(chǎn)纖維素酶菌株安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(33):14378當葡萄糖和木糖同時存在時,優(yōu)先利用葡萄糖嗎。14379Mogagheghi將木糖和阿拉伯糖代謝所需的7個張秋卓蔡偉民纖維素酶高產(chǎn)菌株的復合交替誘變酶基因整合到運動發(fā)酵單胞菌的染色體上,產(chǎn)生選育工業(yè)做生物,2008,38(6):32-37.的工程菌可發(fā)酵40gL葡萄糖、40g/木糖和2018毛培宏,金湘曾憲賢,等新疆離子束牛物技術(shù)的研g(shù)/L阿拉伯糖的混合發(fā)酵液,在50h內(nèi)消耗完葡究門生物技術(shù),2003,13(4):50-51萄糖和木糖以及75%的阿拉伯糖,乙醇得率為9武秀琴,王敏纖維素酶高產(chǎn)南株的誘變選育小安徽043~046gg。 Shigechi利用細胞表面工程構(gòu)建農(nóng)業(yè)科學,2008,36(23):9817-9818表達了α-淀粉酶和糖化酶的酵母,利用生淀粉10毛華,曲音波,高培基,等酵好屬間原生質(zhì)體融合改發(fā)酵產(chǎn)生乙醇該酵母能在72h內(nèi)產(chǎn)生61.8g/L進木糖發(fā)酵性能小生物工程學報,1996,12:157-162乙醇,是生玉米淀粉理論收率的86.5%。Son[1l] KORDOWSKA W M, TARGONSKI Z Application ofSaccharomyces cerevisiae and Pickia stipitis karyoduc-deregger將外源的磷酸乙酮醇酶基因、磷酸轉(zhuǎn)乙中國煤化工 rom xylose]Ac酰酶基因、乙醛脫氫酶基因引入代謝木糖的酵母工程菌,從而引入一條新的途徑:5-磷酸木酮(12】WCNMHGm。(下轉(zhuǎn)第60頁)可耳生能源2009,27(5)terials for ethanol production: a review [J]. 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