1662010年第32卷第3期中國(guó)麻業(yè)科學(xué) PLANT FIBER SCIENCES IN CHINA文章編號(hào):1673-7636(2010)03-016605纖維燃料乙醇生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進(jìn)展曹秀華,阮奇城,林海紅,胡開(kāi)輝,孫淑靜,祁建民(福建農(nóng)林大學(xué)教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福州350002)摘要:木糖是木質(zhì)纖維質(zhì)水解產(chǎn)物中含量?jī)H次于葡萄糖的單糖,由半纖維素水解生成。研究表明,將木質(zhì)纖維素原料中的木糖發(fā)酵生成乙醇,可提高纖維燃料乙醇的轉(zhuǎn)化效率25%左右。天然菌種在發(fā)酵過(guò)程中具有副產(chǎn)物多、乙醇得率低、易污染、耐乙醇能力差等缺點(diǎn),難以工業(yè)化應(yīng)用。近年來(lái)許多研究者構(gòu)建了可以高效代謝五碳糖和六碳糖的基因重組菌。雖然這些重組菌株在木糖轉(zhuǎn)化酒精方面均顯示出良好的應(yīng)用前景,但仍存在諸多問(wèn)題。本文介紹了近年來(lái)代謝工程改造微生物菌種發(fā)酵木糖生產(chǎn)酒精的研究進(jìn)展,以期為利用農(nóng)作物秸稈轉(zhuǎn)化燃料乙醇研究提供參考依據(jù)。關(guān)鍵詞:纖維燃料乙醇;木糖;發(fā)酵;代謝工程中圖分類(lèi)號(hào):TQ92文獻(xiàn)標(biāo)志碼:AProgress of Xylosic Fermentation of Lignocellulosic Materialsfor bioethanol ProductionCAO Xiu-hua, RUAN Qi-cheng, LIN Hai-hong, HU Kai-hui, SUN Shu-jing, QIJian-min*(Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics Breeding and Multiple Utilization of Cropsujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, ChinaAbstract: Xylose is a monosaccharide from the hydrolysis of hemicellulose of lignocellulosicmaterials, it is second only to glucose levels. The fermentation of xylose from lignocellulosic materials canincrease the production of ethanol about 25%. There are many microorganisms in nature, but currently thereis no natural micFor the last two decades, many improvements have been done in the metabolic engineering of yeasts andbacterium including Z mobilis and E. coli for the fermentation of xylose to selectively produce ethanolthrough introducing either xylose metabolic genes or ethanol production genes into the above hosts and aserial of recombinant strains have been constructed. Although some of them have shown great promise forindustrial exploitation, there are still a lot of problems existing. The review tries to outline some majorfforts for developing microbial strains to ferment xylose to ethanol efficiently through metabolicengineering,offering useful reference for transforming lignocellulosic biomass into bioethanolKey words: bioethanol; xylose; fermentation; metabolic engineering農(nóng)作物秸稈是一種具有多用途的可再生生物資源也是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)之一我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)農(nóng)作物秸稈數(shù)量大種類(lèi)多、分布廣,長(zhǎng)期以來(lái)則作為主要燃料或廢棄、焚燒。嚴(yán)重污染了大氣環(huán)境制約了農(nóng)村經(jīng)濟(jì)可持續(xù)性發(fā)展。能源危機(jī)已迫在眉睫開(kāi)發(fā)可再生能源已成為我國(guó)必須面對(duì)的重要課題。以淀粉類(lèi)和糖類(lèi)為原料生產(chǎn)燃料乙醇考慮到糧食安全已被叫停。以農(nóng)作物中國(guó)煤化工收稿日期:201004-16基金項(xiàng)目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金( nyaya-19-E05)CNMHG作者簡(jiǎn)介:曹秀華(1983-),女,頑士研究生,Emal: riuhuacao418@163cm通訊作者:杯建民(1948-)男,研究員。Emil:qjm863l63a第3期曹秀華等:纖維燃料乙醇生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進(jìn)展161纖維素類(lèi)生產(chǎn)燃料乙醇適應(yīng)我國(guó)國(guó)情發(fā)展方向。目前,國(guó)際上纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化仍存在三大技術(shù)瓶頸,一是將木質(zhì)纖維素類(lèi)原料降解產(chǎn)生的木糖轉(zhuǎn)化成乙醇較難,二是纖維素酶生產(chǎn)成本仍然偏高,三是原料要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理。木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量?jī)H次于葡萄糖的種單糖,可達(dá)植物纖維原料水解糖液的30%叫但木糖等五碳糖不能由傳統(tǒng)釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。因此,篩選到能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的高效菌株在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化燃料酒精的研究中具有重大意義。1木糖發(fā)酵菌種,包括天然菌種和基因工程菌株目前在自然界中篩選到的能將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的微生物主要有:細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌。代謝木糖產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌種類(lèi)很多除了能發(fā)酵單糖外還能發(fā)酵纖維素生物高聚糖等但細(xì)菌在發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物且乙醇得率低易染雜菌等。 Lynda等發(fā)現(xiàn)一株極端嗜熱的產(chǎn)乙醇細(xì)菌(Ther-moanerobacter ethanolicus)可在68℃高溫下采用連續(xù)培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化木糖獲得乙醇,其得率可達(dá)014yg絲狀真菌中能利用木糖產(chǎn)乙醇的菌種較少,相關(guān)研究不多。有粗糙脈孢菌( Neurosporacrassa)和尖鐮孢菌( Fusarium oxysporum)等。絲狀真菌能產(chǎn)半纖維素酶和纖維素酶適于植物纖維原料的同步糖化發(fā)酵。與細(xì)菌的乙醇發(fā)酵相比,酵母菌具有酒精轉(zhuǎn)化率高得率高酒精耐受能力高、副產(chǎn)物少、發(fā)酵過(guò)程不易污染等優(yōu)點(diǎn)。酵母菌中可發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的菌有:嗜鞣管囊酵母( Pachysolen tannophilus)休哈塔假絲酵母( Candida shehatae)樹(shù)干畢赤酵母( Pichia stipiti)季也蒙畢赤酵母( Pichia guilliermondii)酒香酵母( Bret tanomyces anomalus)和產(chǎn)朊假絲酵母( Candidauil)等。宋安東等曾用嗜鞣管囊酵母( Pachysolen tannophilus)對(duì)木糖和葡萄糖混合液共發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇發(fā)酵過(guò)程中糖利用率較高發(fā)酵過(guò)程中先利用葡萄糖,在葡萄糖利用完后再利用木糖。菌體生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)生隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而改變發(fā)酵醪液中乙醇濃度為2%。近年來(lái)許多研究者構(gòu)建了可以同時(shí)高效代謝五碳糖和六碳糖的基因重組菌,對(duì)纖維質(zhì)乙醇發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率有很大提髙。2木糖發(fā)酵乙醇機(jī)理將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌的木糖代謝途徑是不同的。大多數(shù)細(xì)菌(如Ecol和 bacillus等)首先在木糖異構(gòu)酶作用下,將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖,然后在木酮糖激酶的作用下磷酸化成磷酸木酮糖,繼而進(jìn)入磷酸戊糖循環(huán)(pp途徑)代謝,ED途徑與pp途徑耦聯(lián),ED途徑產(chǎn)生乙醇。利用木糖的酵母和絲狀真菌的木糖代謝途徑,首先是在依賴(lài) NADPH的木糖還原酶(XR)的作用下將木糖還原成木糖醇然后在依賴(lài)NAD+的木糖醇脫氫酶(XDH)作用下氧化形成木酮糖,再經(jīng)木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖,進(jìn)入磷酸戊糖途徑(PP)PP途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通過(guò)酵解途徑形成丙酮酸。丙酮酸或是經(jīng)丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶還原為乙醇;或在好氧條件下,通過(guò)TCA循環(huán)及呼吸鏈徹底氧化成COP。酵母的木糖發(fā)酵在兼性厭氧條件下進(jìn)行,其總反應(yīng)式為:6CHlO3→9C2HOH+12CO2所以,木糖乙醇發(fā)酵乙醇的最高理論產(chǎn)率為046g酒精/葡萄糖。低于葡萄糖酒精發(fā)酵的理論得率05lg酒精/葡萄糖。3木糖發(fā)酵菌的基因工程改良能進(jìn)行木糖乙醇發(fā)酵的天然菌種很少,通過(guò)基因工中國(guó)煤化工糖乙醇發(fā)酵能力宿主菌株主要集中在大腸桿菌(Ecol)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞3.1木糖發(fā)酵重組細(xì)菌的構(gòu)建CNMHGerevisiae上。大腸桿菌(Ecal)含有利用木糖的所有必需酶但厭氧條件下發(fā)酵形成的產(chǎn)物很復(fù)雜,包括乳中國(guó)麻業(yè)科學(xué)第32卷酸、乙酸琥珀酸和甲酸等乙醇只是其中很少的一部分。生成乙醇的最后階段是由丙酮酸脫羧酶(pd)和乙醇脫氫酶(adh)催化進(jìn)行的,E.co缺少pd,且adh水平低。KOl1即是E.col的基因重組菌株能過(guò)量表達(dá)來(lái)自 a mobilis的丙酮酸脫羧酶基因pd和乙醇脫氫酶基因adhB,從而能高效地將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇,乙醇產(chǎn)率為理論值的85%-92%。孫金鳳等從Zmob的DNA中擴(kuò)增出 pdc,adhB,分別用ac啟動(dòng)子控制表達(dá),構(gòu)建了可以在 E coli JM109中表達(dá)的重組質(zhì)粒pKK-PA、 pEtac-PA,得到的重組菌幾乎專(zhuān)一的發(fā)酵產(chǎn)生乙醇楊秀山等構(gòu)建的大腸桿菌 E coli(pCM-PA)使乙醇產(chǎn)量有了明顯的提高,固定化Ecol(pGM-PA)發(fā)酵混合糖的乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論值的85%木糖利用率達(dá)到80%混合糖利用率達(dá)83%Zhang等利用基因克隆在 Z. mobilis中構(gòu)建了能產(chǎn)生木糖異構(gòu)酶(xyLA)木酮糖激酶(xylB)轉(zhuǎn)酮酶(ttA)、轉(zhuǎn)醛酶(tal)的菌株。獲得的重組菌Z. mobilis CP4(pZB5)可以五碳糖為碳源乙醇產(chǎn)量可達(dá)理論產(chǎn)率的86%;在含木糖和葡萄糖各為25gL的混合碳源中培養(yǎng)兩種糖的乙醇產(chǎn)率均達(dá)到理論值的95%同 Mohagheghi等將發(fā)酵木糖和阿拉伯糖所需的7個(gè)基因整合到 Z mobilis染色體上的特異位點(diǎn)——乳酸脫氫酶基因(h)中獲得了一株穩(wěn)定的整合重組菌株AX101,在賦予新菌株發(fā)酵利用木糖和阿拉伯糖能力的同時(shí),也減少了副產(chǎn)物乳酸的生成。但重組菌株由于引入的基因存在于質(zhì)粒上穩(wěn)定性較差經(jīng)連續(xù)發(fā)酵后質(zhì)粒容易丟失而使發(fā)酵能力下降,并且對(duì)乙醇及纖維原料水解液中的抑制物耐受性差。32酵母菌的木糖代謝工程改造釀酒酵母( S. cerevisia)是傳統(tǒng)的酒精生產(chǎn)菌株,具備良好的工業(yè)生產(chǎn)性狀其全序列已測(cè)定遺傳操作技術(shù)也已經(jīng)成熟嗎。雖然釀酒酵母不能直接利用木糖卻具備木酮糖代謝的完整酶系。不過(guò)酒精代謝屬于初級(jí)代謝,大多數(shù)微生物分享大量共同代謝途徑因此擴(kuò)大釀酒酵母的底物范圍提高其對(duì)木糖的利用只需添加少數(shù)幾個(gè)酶反應(yīng)步驟即可。通常,微生物經(jīng)2條獨(dú)立路線將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖,一是在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的共同作用下分2步反應(yīng)完成,常存在于酵母中;二是通過(guò)木糖異構(gòu)酶直接轉(zhuǎn)化為木酮糖該反應(yīng)在細(xì)菌中很典型嗎通過(guò)途徑工程理念,改造釀酒酵母代謝途徑,使其具有共發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)生酒精的能力以此提高酒精轉(zhuǎn)化率嗎早在1990年 Kotter等將樹(shù)干畢赤氏酵母的木糖還原酶基因(XYL)與木糖醇脫氫酶基因(XYL2)克隆到釀酒酵母中。重組酵母能在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),但不能發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇所利用的木糖全部被氧化叫。但研究發(fā)現(xiàn)XYLl與XY2相對(duì)表達(dá)水平的變化影響乙醇轉(zhuǎn)化率;XYL2表達(dá)量的進(jìn)一步提高會(huì)導(dǎo)致木酮糖的累積分泌。木酮糖激酶催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖成為木糖代謝的限速步驟之-。木酮糖激酶是木糖代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶釀酒酵母自身的表達(dá)活性很低。如果過(guò)量表達(dá)木酮糖激酶對(duì)木酮糖無(wú)限制的磷酸化催化在某種程度上會(huì)耗盡胞內(nèi)ATP,從而引起細(xì)胞生長(zhǎng)的毒害°。因此木酮糖激酶的表達(dá)必須維持較適宜的水平。最近 Karuma等對(duì)嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus的Ⅺ基因、XK基因及眾多非氧化磷酸化途徑酶基因的酵母菌株進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對(duì)木糖的有效利用不僅依賴(lài)于從木糖到木酮糖的有效轉(zhuǎn)化也依賴(lài)于非氧化磷酸化途徑對(duì)木酮糖的進(jìn)一步有效代謝。轉(zhuǎn)酮酶( Transketolase,Tk)和轉(zhuǎn)醛酶( Transaldolase,Tal)是PP途徑中的關(guān)鍵酶影響重組菌發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇的能力但釀酒酵母的這兩種酶酶活都較低。鮑曉明等以E.col-s. cerevisiae穿梭質(zhì)粒YEp24為骨架,將 Pichia stipitis CBS6054的xyl及xy2分別放在釀酒酵母的乙醇脫氫酶I(ADH1)啟動(dòng)子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子下構(gòu)建不同的xy及xy2重組質(zhì)粒并在重組菌株中引入Tl和Tall基因,使酵母菌在原有水平的基礎(chǔ)上超表達(dá)合成轉(zhuǎn)酮酶及轉(zhuǎn)醛酶,這樣得到的重組菌株可以中國(guó)煤化工生長(zhǎng)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,xl!xyl2比值為006的菌株,木糖較YHCNMHG下降乙醇得引入細(xì)菌木糖異構(gòu)酶基因(xylA)是使釀酒酵母轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的又一途徑。細(xì)菌的木糖異第3期曹秀華等:纖維燃料乙醇生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進(jìn)展169構(gòu)酶因不需要任何輔助因子,最初被認(rèn)為是構(gòu)建利用木糖釀酒酵母代謝工程菌株的便利途徑。早期多個(gè)研究將多種來(lái)源如E.coli、 Bacillus subtilis.Actinoplanes missouriensis等的木糖異構(gòu)酶基因克隆轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中,甚至已從重組酵母中得到外源xylA基因正確大小的蛋白產(chǎn)物,但均沒(méi)有得到活性表達(dá),其可能原因是細(xì)菌和酵母最適pH不同酶折疊不正確或者后期翻譯模式不合適叫。直到1996年, Walfridsson等將古細(xì)菌嗜熱細(xì)菌( Thermus thermophilu)的木糖異構(gòu)酶基因(xylA)轉(zhuǎn)入釀酒酵母,首次在釀酒酵母突變株Ⅺ中得到了活性表達(dá)叫。Ion等用易錯(cuò)PCR方法對(duì)Tthermophilus的xylA進(jìn)行定向改造以此解決其最適反應(yīng)溫度過(guò)高的問(wèn)題但效果仍不理想。突變株Ⅺ最適反應(yīng)溫度降至60℃,但其熱穩(wěn)定性卻大大降低啁。鮑嘵明等從 Thermus thermophilus克隆得到xyA,轉(zhuǎn)化釀酒酵母,成功地在釀酒酵母中得到木糖異構(gòu)酶活性表達(dá),同時(shí)表達(dá)xylA和超表達(dá)TKll和TA的釀酒酵母重組菌可以在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),經(jīng)搖瓶發(fā)酵,該菌株可以發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇,產(chǎn)量為13g/L四。4展望木質(zhì)纖維原料的主要成分為纖維素、半纖維素木質(zhì)素,在木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為酒精過(guò)程中,如果能高效的將木糖轉(zhuǎn)化為酒精在理論上可提高乙醇產(chǎn)量達(dá)25%,可降低生產(chǎn)成本。由于很難在自然界中篩選到高效的木糖發(fā)酵菌,所以研究者開(kāi)始致力于構(gòu)建能高效利用六碳糖和五碳糖產(chǎn)乙醇的基因重組菌。目前基因重組菌的構(gòu)建主要包括兩個(gè)方面:一是將戊糖代謝途徑引入只能代謝六碳糖產(chǎn)乙醇的菌株中;二是將髙效產(chǎn)乙醇關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)入能代謝六碳糖和五碳糖但乙醇產(chǎn)量低的菌株中。目前研究表明,通過(guò)基因重組可以獲得能高效轉(zhuǎn)化六碳糖和五碳糖產(chǎn)乙醇的重組菌株。但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在問(wèn)題,主要包括:菌種底物范圍小;乙酸等抑制物耐受性低;乙醇耐受性較低;重組菌株不穩(wěn)定;發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生副產(chǎn)物并影響其發(fā)酵;發(fā)酵工藝需改良優(yōu)化等。另外,所得重組菌株的應(yīng)用還限制在實(shí)驗(yàn)室范圍,還沒(méi)有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此,繼續(xù)并加強(qiáng)對(duì)重組菌株構(gòu)建和木糖代謝的研究,對(duì)提高木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化乙醇有十分重要的意義。參考文獻(xiàn)[U] Rodney JB, Nancy N, Bruce SD Fermentations with new recombinant organisms[]. 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