第29卷第5期可再生能源Vol 29 No52011年10月Renewable Energy Resources0ct.2011雙菌共發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)燃料乙醇的新方法奚立民,張昕欣,柯中爐,于紅艷,曹樹勇(臺州職業(yè)技術(shù)學院生物與化學工程系,浙江臺州318000摘要:試驗對分離得到的霉菌進行淀粉酶和纖維素酶活性鑒定,獲得了一株同時具有淀粉酶和纖維素酶活性的新霉菌。經(jīng)形態(tài)學及分子生物學方法鑒定,初步認定其為一株未被報道過的米根霉,將其命名為 Rhizopusoryzae TZY1。 Rhizopus oryzae TZY與保藏釀酒酵母進行餐廚垃圾共發(fā)酵在沒有外加任何酶類的條件下發(fā)酵后大部分的淀粉及纖維素被利用,發(fā)酵乙醇產(chǎn)率與糖化發(fā)酵結(jié)果大致相等。發(fā)酵后經(jīng)檢測,淀粉的利用率在88%以上,纖維素的利用率在84%左右,較之同步糖化發(fā)酵,該方法可以部分避免由于酶失活而使乙醇產(chǎn)率降低的問題,并且不需外加糖化酶類,節(jié)約了成本,具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞:共發(fā)酵;餐廚垃圾;米根霉;燃料乙醇;乙醇產(chǎn)率中圖分類號:TK6;X705文獻標志碼:A文章編號:1671-5292(2011)05-0084-0The co-fermentation of fuel ethanol produced from kitchengarbage by double strainsXI Li-min, ZHANG Xin-xin, KE Zhong-lu, YU Hong-yan, CAO Shu-yongDepartment of Biology and Chemistry Engineering, Taizhou Vocation Technical College, Taizhou 318000, China)Abstract: A mildew which had the amylase and cellulase activities simultaneously was screenedy activity identification of fungi sample. The result of morphological and molecular identification showed that the strain was a new Rhizopus oryzae(named TZY 1). Rhizopus oryzae tZY1 andaccharomyce scerevisiae were co-inoculated into the kitchen garbage for fuel ethanol fermentation. Without any enzymes addition, most starch and cellulose were consumed after fermentationAccording to the result of detection, the ethanol productivity was approximately equal to the si-multaneous saccharification fermentation (SSF), the utilization of starch was more than 88%, andcellulose was about 84%. Compared with SSF, the method could partly avoid the decrease ofethanol production caused by inactivation of enzymes. For it is relatively simple and inexpensive,the method in the paper provided a good prospect of industrialized applicationKeywords: co-fermentation; kitchen garbage; Rhizopus oryzae; fuel ethanol; ethanol productiv-0引言不適于傳統(tǒng)的焚燒、填埋方法處理;由于其含鹽量餐廚垃圾是指產(chǎn)生于餐飲經(jīng)營與居民生活的高,用于做堆肥原料也受到很大的限制叫。因此食物加工下腳料(廚余)和食用殘余(泔腳),主要利用餐廚垃圾生產(chǎn)燃料乙醇具有環(huán)境保護及可再含有淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和動植物油等有機質(zhì),生能源開發(fā)的雙重意義。收稿日期:2010-08-12?；痦椖?浙江省臺州市科研計劃項日(08KY13)。作者簡介;奚立民(1957-),男,教授,從事有機合成與催化專業(yè)技術(shù)的研究與教學。E-mil;xilm@Ptzvtc.com中國煤化工CNMHG奚立民,等雙茵共發(fā)酵餐廚垃媛生產(chǎn)燃料乙醇的新方法餐廚垃圾制備燃料乙醇的基本工藝可以分為合進行共發(fā)酵,垃圾中纖維素淀粉兩種多糖可同預處理、水解發(fā)酵和純化等4部分。預處理主時被利用,則餐廚垃圾發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的效率會大要是為了去除垃圾原料中影響水解及發(fā)酵的物大提高。質(zhì),同時采取一定措施,破壞淀粉、纖維素等多糖據(jù)報道,工業(yè)上纖維素酶或淀粉酶生產(chǎn)菌主的高級結(jié)構(gòu),提高后續(xù)水解糖化的效率及乙醇發(fā)要為霉菌,細菌所產(chǎn)的纖維素酶或淀粉酶一般都酵的產(chǎn)率。水解是將淀粉、纖維素等多糖水解轉(zhuǎn)化存在于胞內(nèi)或吸附在細胞壁上,不易分泌到培養(yǎng)為可供乙醇發(fā)酵的還原糖類國。發(fā)酵工藝是采用液中。據(jù)此,本試驗對分離得到的霉菌,進行淀粉微生物將還原糖類酵解為乙醇;純化過程主要是酶和纖維素酶活性鑒定,獲得了一株同時具有淀通過蒸餾、過濾等手段,獲得純度較高的乙醇粉酶和纖維素酶活性的霉菌。經(jīng)形態(tài)學及分子生在這4部分中,水解和發(fā)酵是影響垃圾降解物學方法鑒定,初步認定其為一株未被報道過的效率及乙醇發(fā)酵產(chǎn)率的關(guān)鍵步驟,目前主要應(yīng)用米根霉,將其命名為 Rhizopus oryzae TErI。Rhi的方法為酶水解微生物發(fā)酵的生產(chǎn)工藝。此工藝 opus oryzae TZY1與保藏釀酒酵母進行餐廚垃可分為分步水解發(fā)酵工藝 (Separate Hydrolysis and圾共發(fā)酵,在初步確定的發(fā)酵條件下,得到了較好Fermentation,SHF)、同步糖化發(fā)酵工藝 Simultane的發(fā)酵效果ous Saccharification and Fermentation,SF)兩種。1材料與方法同步糖化發(fā)酵工藝將水解與發(fā)酵同時進行,水解1.1菌種、酶及培養(yǎng)基得到的還原糖同時被微生物利用,避免了水解過111菌種程中由于產(chǎn)物抑制而降低酶解效率的問題,同時釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)TZY0縮短了生產(chǎn)時間,簡化了工藝,比分步水解發(fā)酵工筆者所在單位保存;米根霉( Rhizopus oryzae)藝更具有實際應(yīng)用價值。但由于酶活性受環(huán)境影T%Y1,本試驗篩選鑒定。響較大四,很難保證在發(fā)酵全過程中都具有較好1.12培養(yǎng)基的催化水解效果,若要充分利用垃圾中的糖類原富集培養(yǎng)基為麥芽汁液體培養(yǎng)基,采用PDA料,則需要在發(fā)酵過程中補加酶類,或者在發(fā)酵初培養(yǎng)基分離霉菌,保藏用培養(yǎng)基采用麥芽汁固體期大大提高酶添加量這樣會使發(fā)酵工藝復雜化,培養(yǎng)基;使用纖維素-剛果紅培養(yǎng)基鑒定菌株產(chǎn)同時也提高了發(fā)酵成本纖維素酶能力,使用淀粉-無機鹽培養(yǎng)基鑒定產(chǎn)某些微生物可以產(chǎn)生相應(yīng)的水解酶,將其接淀粉酶能力,使用察氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基鑒定入垃圾培養(yǎng)基產(chǎn)生某些水解酶,水解垃圾中淀粉、菌株;采用YFPD液體培養(yǎng)基活化釀酒酵母,采用纖維素等大分子有機物產(chǎn)生還原糖,同時酵母菌PDA液體培養(yǎng)基活化米根酶,采用麥芽汁液體培等乙醇發(fā)酵菌種可以快速利用這些還原糖生成乙養(yǎng)基發(fā)酵種子培養(yǎng)基間醇,反過來刺激其分解多糖的速度,二者協(xié)同作用1.2萬種的分離篩選共同發(fā)酵,避免了由于同步糖化發(fā)酵工藝中酶活121菌種采集性降低所引發(fā)的問題。因此,以混菌共發(fā)酵的方法收集酒廠發(fā)酵糟及市售小曲樣品若干,粉碎來改進同步糖化發(fā)酵工藝,可以提高生產(chǎn)效率,降混勻處理后進行富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)物梯度稀釋低生產(chǎn)成本。后涂布于分離平板,所得單菌落經(jīng)過鏡檢,并接種目前,工業(yè)上應(yīng)用最多的乙醇生產(chǎn)菌為釀酒于斜面試管保藏。酵母,因此已報道的混菌共發(fā)酵工藝大多為能產(chǎn)122目的菌株的篩選纖維素酶或淀粉酶的細菌/霉菌與釀酒酵母共發(fā)用生理鹽水沖洗保藏霉菌斜表面,對獲得的酵,利用纖維素或淀粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。直接采用此細胞懸浮液進行梯度稀釋,選取合適梯度稀釋液方法發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)燃料乙醇時,垃圾中的纖涂布于纖維素-剛果紅培養(yǎng)基表面,于25℃下進維素淀粉兩種多糖原料會有一種不被利用,降低行培養(yǎng);分別用兩種鑒定培養(yǎng)基對初步篩選得到了乙醇生產(chǎn)效率,造成資源浪費剛。若將具有淀的既可以產(chǎn)生纖維素酶又可以產(chǎn)生淀粉酶的茵株粉酶和纖維素酶活性的細菌/霉菌與釀酒酵母混進行復篩。中國煤化工.85CNMHG可再生能源2011,29(5)1.23目的菌株的形態(tài)鑒定柱;固相支持物為聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-di-將所得的菌株劃線接種于察氏和PDA培養(yǎng) ethylene glycol succinate DEGS);鍍膜物為聚酰亞基上,取無菌的蓋玻片以45°角插入培養(yǎng)基中,25胺。載氣為N2,氣化室溫度為250℃,柱溫為80℃恒溫培養(yǎng),不定期觀察菌落、菌絲以及孢子形℃,尾吹為50ml/min;檢測器采用氫火焰離子化態(tài),并以魏景超《真菌鑒定手冊》為依據(jù),對其進行檢測器。以色譜級無水乙醇為標準品,對上述餾出形態(tài)學鑒定。液樣品進行GC分析,上樣量為5μL1.24目的菌株的分子生物學鑒定1.52垃圾原液及發(fā)酵液組分的檢測采用CTAB法提取該菌總DNA,以所得到的采用比色一分光光度法方法測定垃圾原料及總DNA作為模板,依 Takara Fungi identi-- fication發(fā)酵液中可溶性糖——還原糖含量;采用GBPCR Kil進行26 SrDNA DI/D2區(qū)域擴增。擴增完T50099-2003所列方法測定淀粉含量;采用GB成后,取其2μL在1%的瓊脂糖凝膠上作電泳檢05009-10所列方法測定纖維素含量。查,其余PCR擴增產(chǎn)物用UNQ-10柱式PCR產(chǎn)2結(jié)果與分析物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限2.1菌種的分離篩選公司產(chǎn))回收純化,并由該公司進行序列測定。經(jīng)初步分離,從酒藥酒曲樣品中共獲得5株1.3餐廚垃圾的預處理疑似為霉菌的菌株。將5株霉菌分別稀釋涂布在首先將收集的餐廚垃圾進行人工分揀,揀出纖維素剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng),兩天后觀察其透明如大塊骨頭等體積較大的塊狀物及金屬物、塑料圈的產(chǎn)生情況,計算其相對酶活力,結(jié)果見表1。等不能做發(fā)酵原材料使用的物質(zhì);然后將垃圾打表1纖維素分解菌相對酶活力的測定漿粉碎,并加入5%的氨水進行超聲處理,對纖維Tablel Detection of relative cellulase activities by cellulose-decomposing fungi素進行破晶處理。處理后的垃圾添加3倍體積的編號CMC酶相對活性A′/cmd水進行高溫滅菌,即作為乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基,pH為0.355±0.5自然值0433±0.314釀酒酵母與米根霉共發(fā)酵餐廚垃圾釀酒酵母菌株單克隆接人50 mL YEPD液體,培養(yǎng)活化24h;按10%的接種量接入麥芽汁″A=溶解圈直徑/菌體培養(yǎng)時間種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,以獲得釀酒酵母種子。無菌將所得的3株具有纖維素酶活性的霉菌稀釋水沖洗米根霉斜面培養(yǎng)物獲得孢子懸浮液,血球涂布于淀粉-無機鹽培養(yǎng)基上進行淀粉酶產(chǎn)生能計數(shù)板對懸浮液中的孢子進行計數(shù),在懸浮液中力鑒定,只有3號菌(表1)產(chǎn)生了明顯的淀粉水加入無菌水調(diào)整每毫升懸浮液中孢子的數(shù)目為解透明圈,淀粉透明圈直徑與菌落直徑比值為106個,取5mL孢子懸浮液接入50 mLPDA液體(251±04),將其具有纖維素酶活性和淀粉酶活培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24h;按10%的接種量接入麥芽性的菌株初步命名為TZY1l汁種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,以獲得米根霉種子。以發(fā)2.2菌株TzY1的鑒定酵原液作為培養(yǎng)基,接入一定比例的釀酒酵母種經(jīng)察氏和PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn):TZY1子和米根霉種子,在25r/min條件下培養(yǎng)進行乙菌落稠密,最初呈白色,后變?yōu)楹稚?圖1a)。菌絲醇發(fā)酵。匍匐爬行,無色;假根發(fā)達,分枝呈根狀;孢囊梗直1.5分析方法立多分支,與假根對生(圖1b);囊軸為卵圓形、淡1.5.1乙醇提純與檢測褐色;孢子囊近似球形,孢囊孢子呈橢圓形、黃灰發(fā)酵液以5000r/min離心10min,取出上清色(圖1c)。液后,控制溫度為85~90℃,蒸餾30min,氣相色測序結(jié)果表明,TZY1的26 S rDNA DI/D2區(qū)譜檢測餾出液中乙醇的濃度及其他組分含量。氣域擴增共得到575bp的核苷酸序列,將得到的序相色譜分析按如下條件進行:儀器為FUL9790列在NCB數(shù)據(jù)庫中作 BLAST分析,發(fā)現(xiàn)其與Ⅱ氣相色譜儀,0.32mm×30mm彈性石英毛細管 Rhizopus oryzae strain WWFP84628 ribosomal中國煤化工CNMHG奚立民,等雙菌共發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)燃料乙醇的新方法(a)在PDA固體培養(yǎng)基上(b)顯微鏡下的(c)顯微鏡下的孢子囊、培養(yǎng)的菌落形態(tài)菌絲、孢囊梗孢囊孢子圖1菌株TZY1形態(tài)鑒定結(jié)果Fig. I Morphological identification of TZYlRNa gene序列的相似度最高,為99%。利用菌共發(fā)酵餐廚垃圾生成燃料乙醇的工藝路線。ClustalX軟件構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹(圖2),由圖2可知TY1與 Rhizopus oryzae及 Rhizopus homothallicus形成一個類群,其序列同源性最高。結(jié)10-7.5%合形態(tài)學鑒定結(jié)果,初步判定TZY1為一種未報道過的米根霉( Rhizopus Oryzae tZY)。88-×-12%未命名毛毒( M. armphibionum雅紋鱗質(zhì)霉(A. elegans)8421000時間h(a)不同TZY1l接種量發(fā)酵液中乙醇產(chǎn)率隨時間變化情況華是勝枝莓(H, pulchrum)為異常倚囊霉( Anomala)4%為莫勒接霜( Zoeller)凍土毛霉( M hiemalis)圖2基于26 SeDNA序列和 Neighbor- Joining法構(gòu)建一米一15%的系統(tǒng)進化樹Fig 2 Phylogenetic tree of TZTI, based on 26s rDNAsequence and Neighbor-Joining method2、3釀酒酵母與米根霉共發(fā)酵餐廚垃圾生成乙醇時間h在乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中接入15%的釀酒酵母(b)不同TzY1接種量發(fā)酵液中還原糖殘留量種子,同時接人不同比例的米根霉種子,在28℃隨時間變化的情況下進行乙醇發(fā)酵,檢測發(fā)酵液乙醇的產(chǎn)量及還原圖3不同TzY1接種量發(fā)酵液中乙醇的產(chǎn)率及還原糖糖殘留量隨時間變化的情況(圖3)的殘留量隨時間變化的情況從圖3a可見,在不添加淀粉酶及纖維素酶的Fig 3 Ethanol productivity and residue of reducing sugalong with time in different incubation amount of TZY1情況下,當米根霉的接種量為75%~12%,發(fā)酵72為檢驗大分子多糖在發(fā)酵過程中被利用的h后,乙醇的產(chǎn)率達到最高(1lmL∥100mL左右),情況,按上述條件進行餐廚垃圾乙醇發(fā)酵,以發(fā)與前期試驗中所得的同步糖化發(fā)酵乙醇的產(chǎn)率酵培養(yǎng)基中只接入15%的釀酒酵母種子及不進大致相同。米根霉的接種量超過75%時,對基質(zhì)行任何微生物接種的空白發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照,中還原糖的消耗量2h后幾乎達到了最大(圖同時進行發(fā)酵,發(fā)酵后比較發(fā)酵液還原糖、總糖、3b)。因此,15%釀酒酵母接種量,7.5%TXY1接種淀粉及纖維素殘留量,結(jié)果如圖4所示。在接入量,28℃,25rmin發(fā)酵72h是一條初步可行的雙75%的TZYl的情況下(1號),發(fā)酵液中的淀粉及中國煤化工87CNMHG可再生能源2011,29(5)纖維素都得到了利用,雖然發(fā)酵后淀粉及纖維素DA KHRAISHEH. Bioconversion of municipal solid都有一定的殘留(淀粉11%左右,纖維素15%左waste to glucose for bio-ethanol Production[J].Biopro-右),但殘留量較低。如再經(jīng)過工藝改進,可以獲cess Biosyst Eng, 2007, 30(3): 189-196得更高的乙醇產(chǎn)率及更低的多糖殘留率。[4 WANG QUNHUI, NARITA JUN-YA, XIE WEIMINet al. Effects of anaerobic/aerobic incubation and stor5口還原糖age temperature on preservation and deodorization of24口總糖kitchen garbage [J]. Bioresource Technology, 2002, 84□淀粉(3):213-220纖維素[5 TOSHIYUKI MURAL, TOMOKO YOSHINO, MIT-SUYOSHI UEDA. ef aL. Evaluation of the function arm-ing yeast displaying glucoamylase on its cell surface bydirect fermentation of corn to ethanol[].Journal of Fer-mentation and Bioengineering, 1998, 86(6): 569-572圖4發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖、總糖、淀粉及纖維素殘留量[6] ELIA TOMAS -PEJO, JOSE M OLIVA, MERCEDESFig 4 Residue of reducing sugar, total sugarBALLESTEROS, et al. Comparison of SHF and SSFstarch and celluloseprocesses from steam -exploded wheat straw for ethanol1-15%的釀酒酵母接種量,7.5%的TZY1接種量發(fā)酵;2-只production by xylose-fermenting and robust glucose人15%的釀酒酵母種子發(fā)酵;3-不進行任何微生物接種發(fā)酵fermenting saccharomyces cerevisiae strains [Biotechnology and bioengineering, 2008, 100(6): 1122-1131討論[7 HANNE R SORENSEN, SVEN PEDERSEN. Efficiencies(1)本試驗新篩得一株具有淀粉酶及纖維素of designed enzyme combinations in releasing arabinose酶活性的米根霉菌株( R Oryzae)TzY1,將其與釀and xylose from wheat arabinoxylan in an industrial酒酵母一同接入餐廚垃圾進行乙醇發(fā)酵,乙醇的ethanol fermentation residue[J]. Enzyme and Microbial產(chǎn)率與同步糖化發(fā)酵大致相等。經(jīng)檢測,發(fā)酵后Technology,2005,36(5):773-784淀粉的利用率在88%以上,纖維素的利用率在8 JORGEN SAUER, BENT W SIGURSKJOLD.ULA84%左右,工藝簡單,節(jié)約成木,具有良好的產(chǎn)業(yè)CHRISTENSEN, et al Glucoamylase: structure/function化應(yīng)用的前途。relationships, and protein engineering[J]. Biochim Bio-(2)本試驗中釀酒酵母的接種量、發(fā)酵溫度、[9] GOPAL KEDIA, RUOHANG WANG, HEMANT PATELH以及同步糖化發(fā)酵的檢測結(jié)果均由前期試驗et al. Use of mixed cultures for the fermentation of cere-結(jié)果比較得出,具體試驗過程本文未列出。(3)與其他餐廚垃圾乙醇發(fā)酵不同,本試驗Process[J]. Biochemistry, 2007, 42(1): 65-70選擇了低濃度培養(yǎng)基(3倍體積的水)的發(fā)酵條件10 HARUHIKO YOKIO, AKIO SAITSU, HIROYUK1進行發(fā)酵,底物利用充分、反應(yīng)完全。釀酒酵母具UCHIDA, et al. Microbial hydrogen production from有一定的乙醇耐受度,低濃度發(fā)酵不易引起由于sweet potato starch residue[J].Joural of Bioscience and乙醇濃度升高而引起的釀酒酵母活力降低乃至Bioengineering, 2001, 91(1): 58-63死亡的現(xiàn)象。[11J KRISZTINA KOVACS, GEORGE SZAKACS, GUIDOZACCHI Comparative enzymatic hydrolysis of pretreated參考文獻spruce by supernatants, whole fermentation broths and[1] MURPHY J D, MCCARTHY K Ethanol production fromwashed mycelia of Trichoderma reesei and Trichodermaenergy crops and wastes for use assport fuel inatroviride [J]. Bioresource Technology, 2009, 100(3):Ireland J). Applied Energy, 2005, 82(2):148-1661350-1357.[2] YAN LIN, SHUZO TANAKA. Ethanol fermentation from[12]沈萍,范秀容,李廣武微生物學實驗(第3版川M北biomass resources: current state and prospects JI.Appl京:高等教育出版社,200249-77Microbiol Biotechnol, 2006, 69(6):627-642[3]杜連祥工業(yè)微生物實驗技術(shù)M]天津:天津科學技術(shù)3] AIDUAN LI, BLANCA ANTIZAR-LADISLAO, MAJE出版社,199232-50中國煤化工CNMHG