第18卷第2期中國組織化學與細胞化學雜志Vol. 18. No.22009年4月CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISIRY AND CYTOCHEMISTRYApr. 209Gas7在大鼠關節(jié)軟骨中的表達及意義李金生王建超"解杰陳華劉俊2王小麗’劉勝洪'(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院骨科;'華中科技大學同濟醫(yī)學院組織胚胎教研室;武漢430030;2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院外科，武漢430022)[摘要]目的 探討生長體止蛋白 7 (Gas7)在成年大鼠關節(jié)軟骨中的表達及意義。方法雄性 SD大鼠(3個月、12個月)各12只取膝關節(jié)和股骨上端關節(jié)部分，經(jīng)脫鈣石蠟包埋并切片，采用HE染色和免疫組化SABC法檢測。檢測各關節(jié)軟骨組織中Gas7的表達及其定位。結(jié)果關節(jié)軟骨切線層與移行層Gas7的表達呈現(xiàn)強陽性，而在輻射層及軟骨鈣化層則弱陽性或陰性。結(jié)論Gas7 在成年大鼠關節(jié)軟骨各層細胞的表達不同，可能與各層軟骨細胞的生長發(fā)育及代謝狀況有關[關鍵詞]生長休止蛋白7; 關節(jié)軟骨[中圈分類號] R322. 71[文獻標識碼]1DOI: 10. 3870/zgzzhx 2009. 02. 020EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF GAS7 IN THE ARTICULAR CARTILAGE OF RATSLi Jinsheng, Wang Jianchao" ，Xie Jie, Chen Hua, Liu Jun2，Wang Xiaoli' , Liu Shenghong'(De partment of Orthopadics of Tongji Hospital ;' Department of Histology and Embryology,Tongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430030;2Department of Surgery , Union Hospital , Wuhan 430022, China)[Abstract]Objective To explore the expression and the effect of Gas7 in the articular cartilage of a-dult rats (aged 3 or 12 months)。Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression ofGas7 in the articular cartilage of rat long bones. Results The expression of Gas7 was positive in the tangen-tial zone and the transitional zone of the articular cartilage of matured rats. The expression of Gas7 in theradial zone and the calcified cartilage zone was weakly positive or negative. Conclusion The diversity ofGas7 expression in different zones of rat articular cartilage may be related with the growth, developmentand metabolism of chondrocytes.[Key words] Growth arresting specific protein (Gas) 7; Articular cartilage1988年Schneider等首次從小鼠成纖維細胞中參與了調(diào)控胚胎干細胞(embryonic stem cell,分離出生長休止蛋白(growth arresting specificESC)的倍增過程[6]。盡管在Gas7在神經(jīng)組織，protein GAS )印,其后的研究發(fā)現(xiàn)GAS基因參與血液和腫瘤等方面有較多的文獻報道，而作為分化機體多種細胞活動，具有較廣泛的生物學功終末細胞之一的關節(jié)軟骨細胞中，有無Gas7表能L.3.4]。Gas7 是GAS家族中的一個亞型，于達，目前尚不明確。本實驗擬通過免疫組織化學方1998年從小鼠無血清培養(yǎng)的成纖維細胞中首次分法，顯示Gas7在成年大鼠關節(jié)軟骨細胞中的表達離出來，它主要表達在分化終末細胞，如神經(jīng)細及定位，為進一步揭示Gas7對分化終末細胞的作胞，周圍血細胞等5。它可抑制腫瘤細胞生長，使用機制，以及研究關節(jié)軟骨生長發(fā)育、損傷和修復之向正常方向分化，促進神經(jīng)發(fā)育分化過程。提供依據(jù)。Moorthy等在實驗中發(fā)現(xiàn)細胞受損時，Gas7 可能中國煤化工[收稿日期] 2008-04-13 [修回 日期] 2008-09-20YHCNMHG齡、12月齡各12[作者簡介]李金生，男(1974年),漢族，碩上研究生。只(同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供)，體重250-*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)第2期李金生等. Gas7在大鼠關節(jié)軟骨中的表達及意義223400g。經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌注后，取大鼠膝關節(jié)相對較薄，細胞數(shù)目較少，輻射層與鈣化層之間未和股骨.上端關節(jié)部分，后固定6小時，經(jīng)10%ED-見明顯的潮線形成，干骺端的骺板較厚(圖A,TA脫鈣10-14d、酒精脫水、石蠟包埋、切片。C)。12 月齡大鼠關節(jié)軟骨的表層、移行層、輻射2. SABC免疫細胞化學反應:切片脫蠟至水后層分層不明顯且厚度較3月齡組薄，細胞數(shù)目相對部分行HE染色透明封片;部分經(jīng)300mg/L H2(h要少。在輻射層與鈣化層之間可見多條潮線形成,10min;正常牛血清封閉，37C30min;兔來源干骺端骺板與干骺端相融合(圖B, D)。anti- Gas7 (1: 100) 37C 2h后室溫過夜，再37"CSABC法染色結(jié)果見3月齡組大鼠關節(jié)軟骨切2h;生物素標記的羊抗兔抗體IgG (1 : 300,北京線層、移行層的軟骨細胞中Gas7表達呈現(xiàn)強陽中杉金橋生物技術有限公司) 37C孵育1h; SABC性，輻射層軟骨細胞偶見陽性表達，鈣化層和干骺復合物37C孵育1h; DAB顯色，8-10min, 終止端骺板的軟骨細胞則為陰性表達，各陽性細胞主要反應。蘇木素精復染后切片經(jīng)酒精脫水，二甲苯透表達于胞漿中，少數(shù)細胞在胞核中同時也呈陽性表明，樹膠封片。顯微鏡下觀察。達(圖E, G)。12 月齡大鼠關節(jié)軟骨細胞Gas7表達結(jié)果與3月齡相似，在切線層、移行層軟骨細胞果中呈現(xiàn)陽性表達，輻射層可見少數(shù)細胞弱陽性表HE染色見3月齡大鼠關節(jié)軟骨的表層、移行達，而鈣化層和干骺端骺線區(qū)的軟骨細胞未見細胞層、輻射層各層分層明顯，細胞數(shù)目較多，鈣化層陽性表達(圖F. H).G圖A、B為3月齡、12月齡大鼠正常關節(jié)軟骨組織。HE染色X200圖C、D為3月齡大鼠骺板和12月齡大鼠骺線區(qū)組織。HE染色X200.圖E. F為3月齡、12月齡大鼠正常關節(jié)軟骨細胞Cas7表達。X200圖G、H為3月齡大鼠骺板和12月齡大鼠骺線K軟骨細胞(ias7表達。X200.Fig.A. B The articular cartilage tissue of rat (3 month, 12 month) . HE staining X 200Fig.C、D The epiphyseal plate of rat (3 month, 12 month) . HE staining. X200Fig.E. F The articular carilage tssue of rat (3 month. 12 montl中國煤化工Fig.G. H The epiphyseal plate of rat (3 month, 12 month), GaYHCNMHG224中國組織化學與細胞化學雜志第18卷細胞活性的標記作用(marker), 它對于判定關節(jié)討論軟骨不同層次內(nèi)細胞的機能狀態(tài)可能具有意義。Gas7在骨細胞或關節(jié)軟骨細胞的定位研究目成年體內(nèi)的軟骨組織是一-種較特殊的組織，損前尚未見報道。本實驗首次觀察到Gas7在關節(jié)軟傷或退化后一般不能再生。本實驗初步觀察了骨中的表達主要位于成年大鼠關節(jié)軟骨表層與移行Gas7在關節(jié)軟骨中的表達及定位特征，但關于層細胞，在輻射層也有少許細胞呈弱陽性表達，但Gas7對關節(jié)軟骨的正常生理或病理方面存在的影在軟骨鈣化層及斷板處則呈陰性表達。響及機制，仍有待進-一步研究。關節(jié)欽骨主要由大量細胞外基質(zhì)與散在分布其參考文獻中的高度特異性細胞(軟骨細胞)組成。從關節(jié)欽骨表而至軟骨下骨，關節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)呈分層變化,[1] Schneider C, King RM, Philipson L Genes seifially主要表現(xiàn)在細胞的形狀與大小，膠原纖維的粗細與expressed at growth arrest mammalian cells. Cell,走向，蛋白多糖的濃度及水含量多少等。關節(jié)軟骨1988，54 (6): 787-793其表面向下可被分成四層:切線層、移行層、輻射[2] Brancolini C, Bottega S, Schneider C. Gas2, a growtharrest-specific protein, is a component of the microfila-層、鈣化軟骨層。欽骨細胞叮以對許多環(huán)境刺激產(chǎn)ment network system. J Cell Biol, 1992, 117 (6);生反應，包括可溶性調(diào)節(jié)因子，如:生長因子、白1251-1261細胞介素、藥物;基質(zhì)分子;機械負重;流體壓力3] Zoidl G, Blass- Kampmann S, D'"Urso D, Schmalenbach的變化等[6,7,8]。Yang Xia等研究發(fā)現(xiàn)在某些關節(jié)C, Muller HW. Retroviral-mediated gene transfer of軟骨中央，可以觀察到明顯軟骨分層現(xiàn)象，即上述the peripheral myelin protein PMP22 in Schwann Cell:表層等四層;然而，在關節(jié)的周邊區(qū)發(fā)現(xiàn)更復雜的modulation of cell growth. EMB3O J, 1995, 14 (6):多層次軟骨區(qū)，如在關節(jié)軟骨組織殺層的周邊區(qū)發(fā)1122-1128現(xiàn)了類似切線層和移行層存在[9]。這些實驗結(jié)果表[4] Lih CJ, Cohen SN, Wang C, Lin-Chao S The plateletderived growth factor alpha-receptor is encoded by a明關節(jié)軟骨形成和分化的復雜性。growth arrest specifie (gas) gene Proc Natl Acad Sei作為特異性表達于細胞分化終未期(G0期)USA, 1996, 93 (10); 4617-4622的蛋白質(zhì)5，Gas7具有抑制細胞繁殖分裂促進細[5] Ju YT, Chang AC, She BR, et al. Gas7: A gene ex-胞進一步分化成熟的功能。本實驗中也發(fā)現(xiàn)在細胞pressed preferentially in growth arrested fibroblasts and增殖分裂明顯的骺板區(qū)軟骨細胞Gas7表達呈陰terminally differentiated Purkinje neurons affects neurite性，而在細胞停止增殖分裂、細胞分化成熟明顯的formation. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95 (19);成年大鼠關節(jié)軟骨區(qū)域軟骨細胞為陽性表達，提示11423-11428Gas7的表達與軟骨細胞的成熟或分化狀態(tài)有關，[6] Moorthy PP, Kumar AA, Devaraj H. Expression of但其機制仍不清楚。Wong等觀察到，關節(jié)軟骨表the Ggas7 and Oct4 in Embryonic Sterm Cells of mice.Sterm cells Dev, 2005, 14: 664-670面所受物理因素的不同可以影響軟骨細胞形態(tài)的分[7] Chao CC, Su LJ, Sun NK, et al. Involverment of Gas7化、成熟或退化，甚至可以表現(xiàn)為--系列的基因上in nerve growth factor-independent and dependent cell調(diào)或下調(diào)[0]。Hayes 等觀察從幼年到成人關節(jié)軟processes in PC12 cells. J Neurosci Res, 2003, 74:骨的形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中發(fā)現(xiàn)各層軟骨細胞的分裂周期248-254不同，與移行層相比，表層軟骨細胞的分裂周期較[8] Joseph A, Buckwalter MD, MS Thomal A, et al,陳短叫。此外，他們也研究發(fā)現(xiàn)，隨著次級骨化中啟明等澤，骨科基礎科學(骨關節(jié)肌肉系統(tǒng)生物學和心的形成，TGF- (逐漸分布到關節(jié)軟骨的切線層生物力學第二版) . 北京:人民衛(wèi)生出版社，2001與移行層，說明內(nèi)源性因子對機體關節(jié)軟骨的生長C9] Xia Y, Moody JB, Alhadlag H, et al. Imaging the發(fā)育產(chǎn)生- -定影響11。physical and morphological properties of a muliZoneYoung articular cartilage at microscopic resolution. J根據(jù)上述報道，結(jié)合本實驗結(jié)果分析，我們推Magn Reson Imaging, 2003, 17 (3): 365-374測Gas7在成年大鼠關節(jié)欽丹各層細胞表達的差異[10] Wong M，Carter DR. Articular cartilage functional性，或許與關節(jié)所受物理因素影響有關，使基囚表histomorphology and mechanobiology: a research per-達發(fā)生變化，導致Gas7在成年大鼠關節(jié)軟骨各層spective. Bone, 2003, 33 (1); 1-13細胞表達不同，從而關節(jié)軟骨細胞發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。[11) Haves AJ, Macpherson S, Morrison H, et al, The de-此外由于關節(jié)軟骨的輻射層和鈣化層細胞逐漸肥artirunlar artilape. evidence for an appo-大、退化，而在此區(qū)域內(nèi)的軟骨細胞Gas7表達是中國煤化工at Embryol (Berl),弱陽性或陰性，因而提示Gas7可能具有顯示軟骨YHCNMHG