環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學202年10月第19卷第5期 Chin J Environ Occup Med Oct200Vl.19N.5293文章編號1006-3617200)509303中圖分類號R13文獻標識碼:A【論著】乙醇對大鼠神經(jīng)行為及相關(guān)酶的影響項翠琴,陳自強2,傅慰祖摘要∶[目的]探討乙醇對大鼠神經(jīng)行為效應(yīng)及腦組織中相關(guān)酶的影響。[方法]體重160g左右的雄性SD大鼠25只隨機分為三組每組為98、8只分別以0%對照組)25.64%低劑量組)51.28%(高劑量組)乙醇溶液(濃度以ⅤⅤ表示按1.0ml/100g體重一次性灌胃染毒。30min后進行自發(fā)活動、轉(zhuǎn)棒實驗和方位水迷宮測試。在染毒1h后斷頭處死取血測血中乙醇濃度BAC)取腦組織測丙二醛MDA超氧化物歧化敵SOD巰基化合物(-SH廂和膽堿酯酶活性。[結(jié)果]高劑量組自發(fā)活動中的行走次數(shù)顯著高于低劑量組和對照組轉(zhuǎn)棒測試高、低劑量組在棒上停留時間均顯著低于對照組P<0.01)水迷宮試驗學習次數(shù)在染毒前對照組明顯高于染毒組而在染毒后各組間差異無統(tǒng)計學意義沮上述改變與BAC相關(guān)顯著。高劑量組SoD活性顯著低于低劑量組和對照組。丙二醛、巰基水平及膽堿酯酶活性各組間無明顯差異。[結(jié)論]乙醇可降低大鼠對新環(huán)境的適應(yīng)性、肌肉運動協(xié)調(diào)能力下降和學習記憶能力的減退并和腦組織中SOD活性呈一定相關(guān)關(guān)鍵詞:乙醇;神經(jīng)行為;神經(jīng)生化Effect on Neurobehavioral Function and related Enzymes of the brain in Rats Exposed to Ethanol XIANGCui-qin, CHEN Zi-qiang, FU Wei-zu' ( 1. Department of Environmental and Ocmal Health ShanghCenter for Disease Prevention and Control Shanghai 200336, China ; 2. Department of Occupational Health, Schoolof Public Health, Fudan Uniersity Shanghai 200032, ChinaAbstract: Objective To explore the effects on neurobehavioral function and neurobiochemical changes induced by ethanol inrats.[ Methods 25 male Sprague-Dawley rats weighed about 160 g were randomly divided into 3 groups. Each group was onceadministered intragastrically with ethanol solution( 0% 25 64% 51. %, V/V). The intragastrical volume was 1.0 ml/100 g bwBehavioral functieng Locomotor Activity , Rotarod and Spatial Water Maze ,they were tested at one week before and 30 minutesl. Rats were sacrificed by decapitation in one hour after ethanol administration. The blood was sampled and thebrains were rapidly removed. The following indicators were assayed :1 )Blood alcohol concentration( BAC ) 2 )Levels of lipid peroxideglutathione and activity of superoxide dismutas SOD ) Results The BAC in the high dose group low dose group and control groupwere 67. 50 mM 63. 15 mM 2.88 mM respectively, The scores of ambulation of locomotor activity increased in the high dose group. Thesustaining time of rotarod in the high and low dose groups were shorter than that in the control group. The learning numbers of SpatialWater Maze in the control group were higher than those in the exposure groups before exposure ,but there was no statistical differenceamong the control and exposure groups after exposure. Furthermore the behavioral alternations above in rats were correlated with BACThe activity of SOd was significantly decreased in higher exposure group Conclusion The ethanol could diminish the adaptation tonew surrounding impair the abilities of motor coordination ,learning and memory in rats. There was a correlation betweermentioned above and the SOd activity of the brainKey Words: ethanol neurobehavior neurobiochemistry乙醇是一種親神經(jīng)性毒物,也是酒的主要成分。最近的研究多集中于乙醇的神經(jīng)化學效應(yīng)2但未見絕大多數(shù)乙醇中毒發(fā)生于飲酒,急性酒中毒主要表現(xiàn)有關(guān)乙醇攝入量與神經(jīng)行為改變及其神經(jīng)化學效應(yīng)之為神經(jīng)行為的改變嚴重時可致昏睡、意識喪失甚至間關(guān)系的報道。為進一步探索乙醇的神經(jīng)行為效應(yīng)及可引起呼吸中樞麻痹而死亡1其可能的神經(jīng)化學機制通過動物實驗初步探討了乙乙醇致機體神經(jīng)行為功能改變的機制尚未弄清。醇所致中國煤化工圣化學的定量聯(lián)系CNMHG基金項目:上海市衛(wèi)生局項目基金編號98417)1材料和方法作者簡介:項翠歇(1952-)女大學副研究員。研究方向職業(yè)步′1.1實驗動物及分組實驗動物和飼料由復旦大學毒理學。作者單位:1.上海市疾病預(yù)防控制中心上海20036:旦大學公共上海醫(yī)學院實驗動物部提供。雄性SD大鼠25只體衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生學教研室上海200032重160g左右隨機分為3組對照組、低劑量組和高劑294環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學2002年10月第19卷第5期 Chin J Environ Occup Med Oct202Vol.19No.5量組分別為9、8、8只。動物室按自然晝夜節(jié)律采光,膽堿二硫代雙硝基苯甲酸分光光度法4測定。動物在不銹鋼籠中分籠飼養(yǎng)自由進食和飲水。1.3.4統(tǒng)計分析方法實驗結(jié)果用方差分析、相關(guān)性1.2試劑,染毒劑量、途徑和時間①試劑:無水乙分析方法進行統(tǒng)計。醇分析純,乙醇含量不低于9.9%,由復旦大學上海醫(yī)學院試劑中心提供。②染毒劑量:用蒸餾水配置2結(jié)果成乙醇溶液(w八),高劑量組51.28%,低劑量組2.1血液中乙醇濃度25.64%對照組為0%。灌胃體積為1.0ml/100g體對照組為(2.88±1.17)mmo/L,低劑量組為重。一次性灌胃染毒在染毒后1h處死動物。(63.15±32.58)mm/L高劑量組為(67.50±19.70)觀察指標mmol/l。經(jīng)方差分析三組間血中乙醇濃度有顯著性1.3.1血中乙醇濃度BAC的測定灌胃染毒1h后差杲P<0.01)兩兩比較高劑量組與低劑量組間斷頭處死大鼠取全血肝素抗凝用頂空氣相色譜法無顯著性差異。染毒劑量與血中乙醇濃度的相關(guān)分測定血中乙醇濃度3析有極顯著的相關(guān)相關(guān)系數(shù)為0.73P=0.00011.3.2神經(jīng)行為功能測定分別在染毒前1周和染2.2神經(jīng)行為功能測試毒后30min測定測試內(nèi)容包括:①自發(fā)活動測試2.2.1自發(fā)活動測試染毒前自發(fā)活動各指標在各locomotor activity)實驗在一透明的有機玻璃箱(25×9組間無顯著差異。染毒后高劑量組行走次數(shù)顯著高×35cm3)內(nèi)進行箱底部按中線分為兩部分。將大鼠于低劑量組和對照線(P<001)自發(fā)活動總數(shù)隨染放入箱內(nèi),記錄大鼠在3min內(nèi)行走( AM ambulation)毒劑量增加而上升P=0.054直立 RE , rearing擦臉 PR, preening)的次數(shù)和排便顆2.2.2轉(zhuǎn)棒實驗表1)染毒前各組大鼠在棒上停粒數(shù) DE ,defecation)以及各指標之和( T,total)②轉(zhuǎn)留時間無顯著性差異。染毒后低劑量組和高劑量組棒實驗 Rotarod test)實驗裝置為-30×30×40cm3的在棒上停留時間均顯著低于對照組(P<0.01木箱木箱中裝有直徑為7cm的木棒木箱底部鋪有表1各組大鼠染毒前后轉(zhuǎn)棒實驗測試結(jié)果x±s)間距為1.0cm的銅柵欄。通電時木棒以18r/min速 able 1 The results of rotarod test in rats after and before exposure to ethanol(x+x)度轉(zhuǎn)動銅柵帶電以防大鼠主動跳下。實驗時將大鼠動物數(shù)棒上停留時間)組別放在轉(zhuǎn)動的棒上,記錄大鼠在棒上停留的時間染毒前染毒后(RPM8),每只動物測試3次取最高值。③方位水迷對照組宮測試 spatial water maze test)水迷宮是一個83×45×低劑量組n988l1.50±6.2819.64±13.4610.87±10.733.75±2.93高劑量組35cm3的水泥池池中有兩塊木板將池等分為3個8592±0.38值×15×35cm2的小池木板上有缺囗使得3個小池可P值0.34000互通。在左測小池頂頭有一個高出水面1cm的安全興經(jīng)方差分析與對照組比較,P<0.01。臺。池中水深15cm水溫保持20℃。實驗時輕提大鼠尾巴從中間小池頂端放入水中,記錄大鼠登陸安全2.2.3水迷宮測試三組大鼠水迷宮測試結(jié)果見表2。染毒前對照組與高、低劑量組學習次數(shù)有顯著性臺的游泳路線及時間。大鼠到達安全臺后休息30s,差異P<0.05)而染毒后各組間學習次數(shù)無顯著性進行第2次測試。大鼠的正確反應(yīng)定為大鼠入水后直接通過左測邊門游向并登陸安全臺,學習標準定為大差別。正確反應(yīng)時間在各組間無顯著差別。鼠連續(xù)4次岀現(xiàn)正確反應(yīng)。大鼠達到學習標準所需的表2各組大鼠水迷宮測試結(jié)果(訓練次數(shù)和到達安全臺的時間作為動物學習能力的衡Table 2 The results of spatial water maze test in rats(x+ s)量標準動物數(shù)指標學習次數(shù))正確反應(yīng)時間s)組別染毒前1.3.3腦組織神經(jīng)化學分析灌胃染毒1h后斷頭染毒后染毒前染毒后對照組911.89±5.446.44±2.605.61±2.364.50±0.90處死大鼠,在冰浴中迅速剝離出大腦,取腦組織低劑量組5.21±1,204.38±1.3800用冷生理鹽水做勻漿介質(zhì)經(jīng)研離心取高劑中國煤化工s04.3+1.224.06±0.62上清液備用。通過加入不同量的勻漿介質(zhì)制成1%F值CNMHG0.4122%、10%的勻漿分別作丙二醛(用10%勻漿硫代巴0.0440.333比妥法)超氧化物歧化釀用1%勻漿黃嘌呤氧化酶興與對照組比較,P<0,05。法巰基化合镢用2%腦組織勻漿二硫代雙硝基苯2.3腦組織神經(jīng)化學分析甲酸法)膽堿酯酶活性用1%腦組織勻漿硫代乙酰高劑量組SOD活性顯著低于對照組(P<0.05環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學202年10月第19卷第5期 Chin J Environ Occup Med Oct200Vl.19N.5295MDA、巰基化合物、膽堿酯酶含量在各組間無顯著性差結(jié)果顯著相關(guān)5說明乙醇中毒可引起動物肌肉運動異協(xié)調(diào)能力下降。乙醇所致的運動失調(diào)與腦內(nèi)腺苷能調(diào)表3各組大鼠神經(jīng)化學結(jié)果比較x±s)節(jié)有關(guān)。方位水迷宮是一種簡單的學習模式用來測Table 3 The results of neurochemical test in rats(x+s)試動物解決簡單問題的能力綜合反映了動物的學習組別動物數(shù)巰基化合物膽堿酯酶和記憶能力。乙醇可使大鼠學習記憶能力改變這可n(mod/L腦勻漿)(NU/m腦勻漿)(Pg/g腦組織)(mm/L腦勻漿)對照組9323,15±106,38101.35±77,463.79±0.471,68±3.00能與乙醇染毒后膜蛋白磷酸化的改變有關(guān)6]。低劑量組8346.88±108.1960.63±17.014.19±0.981.54±2.39乙醇進入體內(nèi)經(jīng)乙醇脫氫酶作用生成乙醛大部2836+2040見4310332458分乙醛由乙醛脫氫酶代謝變?yōu)橐宜岫^多的乙醛會由黃嘌呤氧化酶作用生成大量的超氧陰離子自由基0.7930.0470.563乙醇也可通過細胞色素P450催化環(huán)增加超氧陰離子與對照組比較,P<0.05自由基和過氧化氫的生成。MDA是脂質(zhì)過氧化物的進一步作大鼠神經(jīng)化學指標與血中乙醇濃度相關(guān)種測定MDA的量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程性分柢表4)血中乙醇濃度與大鼠腦組織SOD活性度間接地反映出細胞損傷的程度。超氧化物歧化酶呈負相關(guān)SOD對機體的氧化及抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作表4神經(jīng)化學指標與血中乙醇濃度相關(guān)性分析用此酶能清除體內(nèi)的超氧陰離子(O2)保護細胞免受Table 4 Correlation between the results of neurochemical testand ethanol concentration in blood損傷。巰基含量代表了體內(nèi)還原性基團的含量是反MDASOD巰基化合物膽堿酯酶映細胞保護機制的指標之一。本文結(jié)果中MDA與巰乙醇濃度r值0.083-00.2170.033基含量均無顯著性變化SOD活性高劑量組明顯低于值0.297低劑量組和對照組且SOD活性與血中乙醇濃度顯著米P<0.05相關(guān)這可能是乙醇進入體內(nèi)后導致機體產(chǎn)生一些氧化性的自由基或基團SOD為了清除體內(nèi)的這些基團3討論而含量減少但保持了體內(nèi)MDA及巰基含量的平衡。乙醇可經(jīng)消化道和呼吸道進入人體飲酒后1h周君富等研究也表明飲酒后人體紅細胞內(nèi)SO活性內(nèi)血液中乙醇含量最高以后很快減少。本研究采用顯著降低呈劑量效應(yīng)關(guān)系且SOD活性與飲酒量明次性灌胃染毒并在染毒后1h后斷頭取血以模擬顯相關(guān)4。酒中毒者體內(nèi)的氧自由基反應(yīng)病理性加人飲酒時急性中毒模型。日本宇留野的實驗說明飲劇氧化和抗氧化平衡嚴重失調(diào)?？梢娨掖紝δさ挠熬屏颗c血中乙醇濃度有關(guān)。本研究結(jié)果也表明灌胃響可能是由于其致體內(nèi)氧化和抗氧化失調(diào)所致。膽堿乙醇量與血中乙醇濃度顯著相關(guān)(選用頂空氣相色譜酯酶可分解乙酰膽堿維持膽堿能遞質(zhì)系統(tǒng)的正常功法進行測定該法不需對樣品作特殊處理且敏感、特能。膽堿能突觸的功能與短時或近期記憶有關(guān)稱為異是一種較為簡便迅速的方法31)記憶突觸6。乙醇所致的膽堿能系統(tǒng)功能的下降行為功能是機體的一種重要功能被視為最敏感、可表現(xiàn)出認知或記憶功能的異常。而本研究結(jié)果各最復雜的功能在受罹機體尚未出現(xiàn)明顯的癥狀體組間膽堿酯酶活性無顯著性差異。這可能是本研究中征、病理形態(tài)學或生化學改變時可表現(xiàn)為功能性或主只進行了一次染毒染毒時間太短的原因觀認識感覺上的異常所以常首先被用來評價環(huán)境危害因素對機體的影響。自發(fā)活動是用來測定動物對環(huán)參考文獻境的適應(yīng)能力的其中行走和直立反映動物的激奮、[1張鏞秦震酒精中毒和神經(jīng)損割J醫(yī)學綜述19503)1214煩躁情緒狀態(tài)而排便和擦臉分別反映動物的緊張情[2 ]Faingold CL Ngouemo P Riaz A. Ethanol and neurotransmitter interactions-from緒和對新環(huán)境的適應(yīng)性。本研究結(jié)果高劑量組行走lecular to integrative effect[ J ]. Progress in Biology 1998 55 509-535[3]金念祖趙人崢戴建國等.頂空氣相色譜法同時測定血中乙醇和次數(shù)顯著高于低劑量組和對照組表明飲用較大劑量乙科大堂學據(jù)1004142)46-148的乙醇可使大鼠情緒煩躁不安處于激奮狀態(tài)。自發(fā)[4]周中國煤化工與抗氧化劑和抗氧化酶的關(guān)活動總和有升高趨勢且行走次數(shù)與自發(fā)活動均與血系CN MHG303-305中乙醇濃度呈顯著相關(guān)5]表明乙醇可降低大鼠對新5汪根盛陳自強菜友信飲酒對機體神經(jīng)行為功能的影1環(huán)境的適應(yīng)性。轉(zhuǎn)棒實驗主要用來評價動物的肌肉協(xié)中華預(yù)防醫(yī)學雜志19993x6)3793806]許紹芬莫浣英黃登凱.神經(jīng)生物敩M]上海:上海醫(yī)科大學出版調(diào)能力。本次研究結(jié)果高劑量組、低劑量組在棒上停社990留的時間顯著低于對照組血中乙醇濃度與轉(zhuǎn)棒測試(收稿日期20020403修回日期2002-05-24)