西北植物學(xué)報2001,21(2):257261 Acta Bot. Boreal. -Occident. Sin.文章編號:1000-4025-(2001)02-0257-05聚乙二醇對東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長及紫杉醇生產(chǎn)的影響陳正山,王勤(蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)和分子生物學(xué)系,蘭州730000)摘要:在改良的B培養(yǎng)基中加入不同濃度的聚乙二醇對東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞進行搖瓶培養(yǎng)通過不同時期取樣并測定細(xì)胞鮮、干重及用HPLC測定紫杉醇的含量。發(fā)現(xiàn)聚乙二醇對東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長及紫杉醇生產(chǎn)均有明顯的促進作用。聚乙二醇為10g/L時,對細(xì)胞生長最為有利,細(xì)胞培養(yǎng)16d就可達到最大生物量,其平均鮮重為28.73g/瓶,增重3.8倍,平均干重為2.14g/瓶,增重3.1倍。聚乙二醇為20g/L時,對紫杉醇的生產(chǎn)最有利,細(xì)胞培養(yǎng)25d時,培養(yǎng)基中紫杉醇的含量達到最高水平,其含量為2350μg/L,是不加聚乙二醇的11倍。關(guān)鍵詞:東北紅豆杉;紫杉醇;聚乙二醇;高壓液相色譜儀中圖分類號:Q946.8文獻標(biāo)識碼:A Effects of polyethylene glycol on cell growth and taxol production in suspension cultures of Taxus cuspidata CHEN Zheng-shan, WANG Qin* (Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life Science, Lanzhou University Lanzhou 730000.China) Abstract: Cells of Taxus cuspidata were suspensively cultured in modified B, medium supplemented with different concentratioin PEG (Polyethylene glycol). Great effects of PEG on cell growth and taxol production were observed by determining fresh weight and dry weight of cells and taxol contents was determined with HPLC at different days of culture. 10 g/L PEG is the best concentration for cell growth. The highest biomass was achieved in 16 day's culture with 28. 73 g/flask of fresh weight and 2. 14 g/flask of dry weight, which increasing 3. 8 times and 3. 1 times respectively. 20 g/L PEG is good for258西北植物學(xué)報21卷 accumulation of taxol. Taxol concentration in medium amounted to the highest levels with 2 350 ug/L when the cells were cultured for 25 days, which is 11 times of that of PEG-free. Key words: Taxus cuspidata; taxol;e;l紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉屬(Taxus.)植物中分離得到的一種二萜烯類化合物12,它是一種新型、高效、廣譜抗癌藥物特別是對卵巢癌、乳腺癌、肺癌有較好的療效5現(xiàn)在市場上供應(yīng)的紫杉醇主要從紅豆杉樹皮中提取,但是樹皮中的紫杉醇含量極低(0.01%)4,僅靠樹皮來提供紫杉醇難于滿足市場需要,而且長期砍伐紅豆杉樹又會導(dǎo)致資源枯竭,破壞生態(tài)平衡。因此,目前紫杉醇價格比較昂貴,一般患者難于支付。為滿足社會對紫杉醇的需求,開辟新藥源已成為國內(nèi)外研究的熱點,其中利用細(xì)胞工程法生產(chǎn)紫杉醇是一種行之有效的方法2,3自 Christen等1991年獲得紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)的第一個專利以來有關(guān)通過細(xì)胞培養(yǎng)法來生產(chǎn)紫杉醇的研究已取得巨大進展101,但如何降低成本、提高產(chǎn)量一直是人們討論的熱點。我們試圖利用PEG大分子反滲透法誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物向細(xì)胞外排放的原理,將PEG應(yīng)用于東北紅豆杉(Taxus cuspidata)細(xì)胞培養(yǎng)用以提高培養(yǎng)細(xì)胞的生物量和紫杉醇的化學(xué)量,而到目前為止,有關(guān)這方面的研究還未見過報道。本文初步研究PEG對東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長及紫杉醇生產(chǎn)的影響。1材料和方法1.1材料外植體取自本試驗室栽培的東北紅豆杉幼苗的幼嫩莖段,用改良的B培養(yǎng)基誘導(dǎo)成愈傷組織后繼續(xù)傳代培養(yǎng)。紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品, Sigma公司生產(chǎn),純度為97%;PEG為廣東汕頭化工廠生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品,分子量為6000;培養(yǎng)基為我們設(shè)計的改良B培養(yǎng)基,即B5基本培養(yǎng)基附加5mg/LNAA、3mg/L6-BA、2mg/L2,4-D、0.2mg/Lk、1g/L水酪蛋白解(Sigma)、1g/L甜菜堿(Sigma)、1g/Lpvp(Polyvinylpyrrolidone)和30g/L蔗糖,pH值5.8。1.2細(xì)胞培養(yǎng)及生長參數(shù)的測定1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用改良的B3培養(yǎng)基將傳代培養(yǎng)24代的東北紅豆杉莖愈傷組織配制成6g/100mL的細(xì)胞液,然后每250mL三角瓶中裝100mL細(xì)胞液,即接種鮮重為6g/瓶(誤差小于0.2g),接種干重為0.52g/瓶再分別加入5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L6個不同濃度的PEG,以不加PEG的細(xì)胞液為對照,于25C±1C下暗處搖瓶培養(yǎng)28d,轉(zhuǎn)速為120r/min1.2.2細(xì)胞生長參數(shù)的測定培養(yǎng)第4天開始取樣,以后每隔3d取樣1次,每次每個梯度重復(fù)取樣3次收集細(xì)胞,并稱量鮮重,記錄鮮重和平均鮮重,于恒溫烘箱中40C烘2期陳正山等:聚乙二醇對東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長及紫杉醇生產(chǎn)的影響2591.3紫杉醇的提取及HPLC測定1.3.1培養(yǎng)基中紫杉醇的提取量取50mL培養(yǎng)基,用CH2Cl2按1:1配比(培養(yǎng)基:CHCl2)萃取3次,合并CH2Cl2部分,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海生化儀器廠)在45C±10下濃縮至干。所得粗提取物用CH2O定溶至5mL,然后用HPLC測定紫杉醇含量1.3.2細(xì)胞中紫杉醇的提取干細(xì)胞經(jīng)碾碎后用100m的濾網(wǎng)濾出細(xì)胞干粉,稱取1g細(xì)胞干粉,用50mLCH2O浸泡3次,每次先用超聲波振蕩15min后繼續(xù)浸泡過夜濾出CH2O部分,在80C1C下用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。所得粗提物先用50mL蒸餾水溶解,然后加入50mLCH2Cl2萃取3次,后面其它操作和提取培養(yǎng)基中紫杉醇的相同。1.3.3Hplc檢測高壓液相色譜儀: Waters510泵,991二極管矩陣檢測器;柱長15cm,內(nèi)徑3.9mm;流動相:甲醇:CH3CN:水=29:27:44;固定相:4uC18;溶劑:甲醇;檢測:Uv227nm;進樣量:10L;流速:1.0mL/min;標(biāo)準(zhǔn)品:紫杉醇(Sigma)保留時間 11. 8 min.2實驗結(jié)果2.1PEG濃度對東北紅豆杉莖愈傷組織生長的影響經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),PEG對東北紅豆杉莖愈傷組織的生長具有明顯的促進作用。鮮、干重差異均達到極顯著水平(表1)PEG濃度為1g/L時,對愈傷組織的生長最有利,表現(xiàn)為細(xì)胞生長快速,褐化程度低,細(xì)胞呈微黃色,分散比較均勻,大多以單細(xì)胞或微小細(xì)胞團為主(顯微鏡觀察)。細(xì)胞培養(yǎng)16d就可達到最大生物量,其平均鮮重為28.73g/瓶,增重3.8倍,平均干重為2.14g/瓶,增重3.1倍(表1)當(dāng)PEG濃度小于或等于10g/L時,隨PEG濃度的增加,細(xì)胞平均鮮、干重呈上升趨勢,而PEG濃度大于10g/L時,情況剛好相反(圖1)。表1PEG濃度對東北紅豆杉莖愈傷組織生長的影響及差異顯著性分析(培養(yǎng)16d) Table 1 Influence of PEG on cell growth and statistical analyses (cultured for 16 days)PEG濃度平均鮮重平均鮮重增長倍數(shù)平均干重平均干重增長倍數(shù) PEG concentrations Mean FW Mean FW Mean Dw(g/L) (g/flask) (g/flask) Mean Dw0511.18±0.620.860.89±0.050.7114.63±1.061.441.18±0.081.251028.73±1.133.802.14±0.083.121524,88±1.293.152.03±0,092.902019.88±0.372.311.59±0.022.062515.26±0.591.541.14±0.031.193010.21±1.230.700.67±0.080.29鮮重方差分析千重方差分析 FW statistical analyses DW statistical analysesF值 Fvalue106.51101.80臨界值 Critical valueF01=4.46F0.01=4.46顯著性異極著極顯著260西北植物學(xué)報21卷2500200032.51500210001.55000.500051015202530101316192225 PEG(/L) Days圖1PEG濃度對東北紅豆杉莖圖2PEG為20g/L時培養(yǎng)基中愈傷組織最大生物量的影響紫杉醇的積累曲線 Fig. Influence of PEG on the Fig. 2 Accumulation curves of Taxol in highest biomass of callus medium supplemented with 20 g/L PEG2.2PEG對紫杉醇生產(chǎn)的影響PEG對紫杉醇的生產(chǎn)也有明顯的影響。當(dāng)濃度為20g/L時,對紫杉醇的生產(chǎn)最有利(表2)。培養(yǎng)10d時在培養(yǎng)基中開始檢測到紫杉醇,其含量為43μg/L(圖2),培養(yǎng)25d時培養(yǎng)基中紫杉醇積累達到最高峰,其含量為2350g/L(圖2、圖3)是對照組中紫杉醇含量的11倍PEG濃度小于或等于20g/L時,對細(xì)胞中紫杉醇含量無明顯影響,但PEG濃度大于20g/L時,細(xì)胞和培養(yǎng)基中紫杉醇含量均呈下降趨勢(表2)表2PEG濃度對紫杉醇生產(chǎn)的影響(培養(yǎng)25d) Table 2 Influence of PEG on Taxol production (cultured for 25 days)PEG濃度 PEG concentrations51015202530(g/L)胞外紫杉醇 Extracellular Taxol 2205506906402350160 (pg/L)胞內(nèi)紫杉醇 Taxol in cells583853666380 (ug/g DW)3討論PEG是一種高分子量有機化合物,植物細(xì)胞一般不能吸收如此大分子的物質(zhì)。PEG的主要作用是改變細(xì)胞膜的微結(jié)構(gòu),從而改變細(xì)胞膜的通透性和作為高滲劑。因此,理論上講,向東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中加入一定濃度的PEG可促進細(xì)胞間的相互作用,從而有利于細(xì)胞生長,PEG改變細(xì)胞膜的微結(jié)構(gòu)則有利于紫杉醇的釋放,較高濃度的PEG提高2期陳正山等:聚乙二醇對東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長及紫杉醇生產(chǎn)的影響261 mV1290.7853.8416.90.01.53.04.56.07.9.010.512.013.515.0 (Minute)圖3HPLC圖譜PEG為20g/L時細(xì)胞培養(yǎng)25d紫杉醇的積累達到最高水平,其含量為2350g/L Fig. 3 HPLC determination The highest amount of Taxol was 2350 pg/. when cells were cultured in medium supplemented with 20 g/. PEG for 25 days本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的PEG對東北紅豆杉莖愈傷組織的生長及紫杉醇的生產(chǎn)具有不同的影響。其中10g/LPEG為細(xì)胞生長最適濃度,細(xì)胞培養(yǎng)16d就可達到最大生物量,其平均鮮重增加了3.8倍,平均干重增加了3.1倍。PEG為20g/L則有利于培養(yǎng)基中紫杉醇的積累,培養(yǎng)25d時培養(yǎng)基中紫杉醇的積累達到最高水平(和 Penstechanker等報道的24d達到最高峰基本一致),其含量為2350g/L本研究還發(fā)現(xiàn),當(dāng)PEG濃度為20g/L時,96%的紫杉醇都積累在培養(yǎng)基中,這給紫杉醇的分離提純帶來了方便。目前,雖然通過細(xì)胞培養(yǎng)法來生產(chǎn)紫杉醇的研究已取得巨大進展910,但離商業(yè)化生產(chǎn)還有一段距離。其主要原因是目前培養(yǎng)細(xì)胞的生物量和紫杉醇的化學(xué)量還未達到商業(yè)化生產(chǎn)水平的要求因此本研究為今后有關(guān)提高培養(yǎng)細(xì)胞的生物量和紫杉醇的化學(xué)量方面的研究及紫杉醇的商業(yè)化生產(chǎn)提供了有益的參考。參考文獻: [] ELLIS D D,ZELDIN E L, BRODHAGEN M, et al. Taxol production in Nodule cultures of Taxus]. Journal of Natural Products, 1996,59(3): 226-250.2]李家儒,曹孟德,劉曼西,等前體物對紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中紫杉醇生物合成的影響[J]植物學(xué)研究,199919(3):356-360. [3] THOMAS J H, LUIS P. VENKATEST S,et al. Taxol production in suspension cultures of Taxus baccata[]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1996,44: 99-102.4孫彬賢章國瑛劉滌等紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)與紫杉醇生產(chǎn)[J]植物生理學(xué)通訊1999.35(2):135-140. [5] COLLINS-PAVAO M. CHIN C K. PEDERSEN H. Taxol portitioning in two-phase plant cell cultures of Tazus brevifolia[)]. Journal of Biotech, 1996,49: 95-100.[6]黃遵錫,慕躍林,周玉敏,等,發(fā)根農(nóng)桿菌對短葉紅豆杉的轉(zhuǎn)化及毛狀根中紫杉醇的生產(chǎn)云南植物研究199719(3):292-296.[7甘煩遠(yuǎn)鄭光植.紅豆杉的細(xì)胞工程學(xué)研究進展[J]國外醫(yī)學(xué)·植物分冊19949(4):156-159. [8] CHRISTEN AA. GIBSON D, BLAND J. Production of taxol or taxol-like compounds in cell cultures[P]. US Patent5019504.1991. [9] KINGSTON D G I. Taxol: The chemistry and structure-activity relationships of a novel anticancer agent []. Trends Biotechnology, 1994,12(6): 222-227.[10]邢建民查麗杭,李佐虎,等植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究進展[J]植物學(xué)通報1997.14(3):22-29. LUIS J. PENSTECHANKER SC. ROBERTS et al. Kinetics of taxol production and nutrient use in suspension