第24卷第1期分析試驗(yàn)室ol.24.No.12005年1月Chinese Journal of Analysis Laboratory澤瀉乙醇提取物的HPCE分離研究馬少妹*1王巧娥2李琦2沈陽2王小如21廣西民族學(xué)院化學(xué)化工系,南寧5300062.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院現(xiàn)代分析科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廈門361005)摘要采用高效毛細(xì)管電泳的膠束電動毛細(xì)管色譜的分離模式MEKC)對澤瀉的乙釀σ5%湜取物進(jìn)行分離研究。以十二烷基硫酸鈉(SDS)膠束為準(zhǔn)固定相翮砂為緩沖體系甲醇為有機(jī)添加劑考察了Ss濃度、硼砂濃度、pH、甲醇用量、電泳電壓、電泳溫度等對分離的影響。結(jié)果表明:硼砂緩沖體系為運(yùn)行緩沖溶液(p9.18~9.20)硼砂濃度30 mmol/I sdS濃度45mmol/I甲醇體積分?jǐn)?shù)30%分離電壓25kV分離溫度25℃時分離效果最好。在此條件下得到分離度和重現(xiàn)性均較好的澤瀉乙醇提取物的HCE色譜圖。關(guān)鍵詞澤瀉膠束電動毛細(xì)管色譜汾離中圖分類號x657.8文獻(xiàn)標(biāo)識碼∶文章編號:000070(2005)1-0006003澤瀉是一味常用中藥有利水濕、化痰飲、降火械廠)澤瀉藥材采于福建建甌經(jīng)鑒定為澤瀉科氣、去濕熱、補(bǔ)陰益氣等功效1歷經(jīng)300多年至澤瀉屬植物 Alisma orientalis(Sam.) Juzep.十二烷今仍具有誘人的開發(fā)前景,為世界醫(yī)藥學(xué)所關(guān)注?；蛩徕c(色譜純 Sigma公司),NaH2PO4NaOH、目前澤瀉主要以23-乙酰澤瀉醇B為質(zhì)控指標(biāo)采硼砂無水乙醇均為分析純。23-乙酰澤瀉醇B、24-用薄層掃描泫LCλ高效液相色譜汯HC對其乙酰澤瀉醇A〔南京中醫(yī)藥大茡植物藥深加工工質(zhì)量進(jìn)行評價23程研究中心高效毛細(xì)管電泳HPCE)前正廣泛應(yīng)用于中1.2實(shí)驗(yàn)方法草藥指紋圖譜的研究45]本文采用高效毛細(xì)管1.2.1分析液制備將澤瀉的干燥埉根粉粹過電泳的膠束電動毛細(xì)管色譜的分離模式對澤瀉的250{m篩混合均勻后準(zhǔn)確稱取5.0g,置于50乙釀嚦5%湜取物進(jìn)行的分離研究得到了分離度mL磨口瓶錐形中加25mL%5%乙醇超聲提取2和重現(xiàn)性均較好的澤瀉藥材的HE色譜圖譜,為次每次30mi。提取液合并離心分離取上清液建立澤瀉藥材HPCE指紋圖譜庫提供實(shí)驗(yàn)方法和為分析液。依據(jù)從而為全面評價澤瀉藥材的質(zhì)量提供參考。1.2.2HPCE分離按要求配制實(shí)驗(yàn)用操作緩沖1實(shí)驗(yàn)部分液運(yùn)行前超聲脫氣15mi。毛細(xì)管柱使用前依次1.1儀器與試劑用0.1mol/ L Naoh和水及緩沖液沖洗5min然后HP3DCE型高效毛細(xì)管電泳儀(美國惠普公在運(yùn)行電壓下平衡30min。以后每次進(jìn)樣依次用司)石英毛細(xì)管(60-m×75;mⅩ河北永年光纖乙醇、水、0.1 mol/L NaOH溶液和水及緩沖液沖洗廠)828型pH測試儀美國Oron公司)SK320H3min進(jìn)樣前在運(yùn)行電壓下平衡5min本實(shí)驗(yàn)采超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司),M-用壓力進(jìn)樣(250kPa),二極管陣列DAD)檢測器CRO2R臺式冷凍離心機(jī) Hettich)MlQ超純水裝檢中國煤化工置JD-06A型高速中藥粉碎機(jī)溫嶺市大海藥材器CNMHG*收稿日期200308-17修訂日期200404-19作者簡介馮少妹(1964-),女,工程師第24卷第1期分析試驗(yàn)室ol.24.No.1Chinese Journal of Analysis Laboratory2005-12結(jié)果與討論pH大于10,遷移時間延長,分離效果也不好。為2.1提取溶劑的選擇確定最佳的硼砂溶液濃度、pH和Ss濃度以色譜據(jù)文獻(xiàn)報道61澤瀉的主要藥效成分為三萜醇優(yōu)化函數(shù)-COμ7(其值取決于所有峰的分離度)酮類化合物易溶于醇類等有機(jī)溶劑。制備分析液作為評價指標(biāo)分離度小于1作為0處理峰高表時分別采用無水乙醇、95%乙醇、無水甲醇、95%示響應(yīng)值的大小)在檢測波長202mm分離電壓甲醇、乙腈、95%乙腈等溶劑進(jìn)行提取結(jié)果表明以25kⅤ工作溫度25℃,甲醇體積分?jǐn)?shù)為30%的條95%乙醇、95%甲醇提取效果為佳?？紤]到甲醇的件下進(jìn)行了三因素三水平正交試驗(yàn)方案L34毒性最后選用95%乙醇為提取劑。正交實(shí)驗(yàn)的因素、水平以及結(jié)果見表1和表2。2.2毛細(xì)管電泳分離條件的選擇根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果(表1)通過方差分析和顯2.2.1毛細(xì)管電泳模式的選擇澤瀉乙醇提取物著性檢驗(yàn)得岀洇素A即SS濃度對分離效果影大部分是難溶于水的中性分子故選用MEKC非響最顯著因素C即硼砂濃度次之因素B即pH水毛細(xì)管電泳模式分別進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果表明MKC最小表2)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了擴(kuò)展試驗(yàn)最終得的分離度優(yōu)于非水毛細(xì)管電泳出分離澤瀉乙醇提取物的最佳HCE條件為:DS222緩沖試劑的選擇毛細(xì)管的電滲流(EOF)濃度為45mmo/L,硼砂濃度30mmol/LplH9.20是MEKC技術(shù)的基礎(chǔ)。由于實(shí)驗(yàn)過程選擇表面活甲醇體積分?jǐn)?shù)30%分離電壓25kV、分離溫度25性劑SDs為準(zhǔn)固定相,因此只有在中性或堿性條℃件下才能確保膠束最終從負(fù)極經(jīng)過檢測器一端)2.3重復(fù)性試驗(yàn)流出。如果p過小膠束向正極運(yùn)動的速度大于在最佳緩沖體系和電泳條件下對同一樣品進(jìn)EO速度而無法分離如果pH過大EOF增大,可行1天內(nèi)連續(xù)3次和連續(xù)2天檢測得到遷移時間能會使樣品中的組分未完全分離就被洗脫出系統(tǒng)。的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.31%據(jù)此選擇了磷酸鹽和硼砂緩沖體系進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)和0.43%;峰面積的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差果表明弸砂緩沖體系優(yōu)于磷酸鹽緩沖體系。RSD玢別為0.65%~0.72%和0.97%~1.04%2.2.3甲醇用量在本實(shí)驗(yàn)中,甲醇的主要作用各峰面積與樣品濃度成正比。通過內(nèi)標(biāo)法對23-乙是增溶。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇的體積分?jǐn)?shù)小于10%時,酰澤瀉醇B24-乙酰澤瀉醇A進(jìn)行定性從圖1可分離效果不好,且毛細(xì)管容易堵塞而甲醇的體積分?jǐn)?shù)大于40%時分離效果也不好這可能是甲醇表1正交試驗(yàn)方案與結(jié)果量過多影響膠束的形成從而影響分離效果。甲Tab 1 Arrangement and results of orthogonal experiment醇的體積分?jǐn)?shù)為30%時,可獲得滿意的分離因素A因素B素C實(shí)驗(yàn)2.2.4電泳電壓的選擇采用了17、20、23、25、SDS濃度硼砂濃度電滲流序號28、30kV不同的分離電壓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨cA mmol/L) phcA mmol/L) COF著電壓的增大分離時間縮短但電壓越高分離度〔1)8.1)151)3(1)9.(2)252)越低。綜合考慮選擇25kV為分離電壓。30(1)9.53)353)38.002.2.5電泳溫度的選擇實(shí)驗(yàn)觀察了分離溫度為32)8.1)220、23、25、28、30℃時的遷移時間和分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對遷移時間和分離效果的影響均不明顯。所以選擇接近室溫的25℃。456783(2)9.02)33)32)9.53)11)41.924(3)8.31)353)572.2.6硼砂溶液濃度、p和SDs濃度的選擇根40(3)9.02)151)61.99)252)64.01據(jù)初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果硼砂溶液濃度、pH、SDS濃度對中國煤化工HPCE分離影響顯著。當(dāng)SDS濃度小于35mmol/LCNMHG時23-乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉A不分離。K3/3mmo/L時遷移時間延長分離效果也不好。同樣最佳組合0.149.221.91SDS濃度大于50mmo/L時或硼砂濃度大于A, B,Co第24卷第1期分析試驗(yàn)室ol.24.No.12005年1月Chinese Journal of Analysis Laboratory表2方差分析表Tab 2 Variance analysis方差來源平方和自由度均方差顯著性B153.51218.08109.0441.94誤差)5K總和)990.4FF0.o22)=99Fo(22)=19tionalities, Nanning 530006), WANG Qiao-e, LI QiSHEN Yang and WANG Xiao-ru( The key Laboratory ofytical Science of MOE361005), Fenxi Shivanshi,2005,241):8~10Abstract: The separation of the compounds extractedfrom rhizoma of Alisma orientalis( Sam.)vep usIn95% ethanol by micellar electrokinetic capillary chro-matography MKCC ) with sodium dodecyl sulphate( SDS )as the micellar phase, borax as a buffer and圖1澤瀉藥材的毛細(xì)管電泳譜圖methanol as an organic additive was studied which esFig. 1 Electrophorograms of alisma orientalis1-24-乙酰澤瀉醇A;2-23-乙酰澤瀉醇Btablished a fingerprint technique for the rhizoma of Alisma orientalis. The effects of sds micellar and borax看出24乙酰澤瀉醇A較23-乙酰澤瀉醇B先洗脫 concentration, pH buffer; methanol volume fraction,p出來。plied voltage and temperature on the separation were in-vestigated by the orthogonal test using chromatography參考文獻(xiàn)optimization function( COF )as the evaluation index. It[1]中華人民共和國藥典[M]北京:化學(xué)工業(yè)出版社, was found that the optimalseparation conditions of thesecomponents might be achieved by using a fused silica[2]彭國平潘林梅文紅梅.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報自然 capillary with60 cm long and75;mm, in which30科學(xué)版)2001,K3):154mmol/L borax buffer solution( pH 9. 20 containing 45[3]文紅梅李偉彭國平.中藥材1998212)595mmoVL SDS and 30% methanol was filled under the[4]謝培山.世界科學(xué)技術(shù)一中藥現(xiàn)代化2001x3)8voltage of 25 kV and a temperature of 25C. HPCE fin[5]王天松.中成藥20002x6)397[6]龔樹生張建軍曹廣智等.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,agerprint of the rhizome of Alisma orientalis with perfect2000K(1)28;b.K(2)22separating size and repeatability couldpected[7]吳惠芳關(guān)福玉羅毅.分析化學(xué)19962410)117Thus the method provides a basic information for thewhole quantity control of the rhizoma of Alisma orientalisSeparation of ethanol extract of Rhizoma of Al- in the productsisma Orientalis by High Performance Capillary elec中國煤化工: Micellar electroktrophoresis( HPCE MA Shao-mei( Department ofCNMH GationGuangxI