第40卷第3期解剖學報Vol 40, No. 3200年6月ACTA ANATOMICA SINICAJun.2009·395乙醇對大鼠腦內5HT能神經體系的影響李雙成12康云霄!石葛明1“崔慧先2王磊2李學平(1.河北醫(yī)科大學神經生物學研究室;2.河北醫(yī)科大學解剖學教研室,石家莊050017[摘要]目的觀察乙醇處理大鼠腦內色氨酸羥化酶(TPH)、5羥色胺(5Hr)和5羥色胺轉運體(sERT)的表達改變判斷乙醇對腦內5HT能神經體系的影響。方法以20%乙醇代替飲水飼養(yǎng)30只Wisr大鼠6個月;利用免疫組織化學、免疫印跡及流式細胞術等方法,分析乙醇處理大鼠有關腦區(qū)5HT能神經體系相關指標的改變。結果1.免疫組織化學法可見,乙醇處理組大鼠腦內中縫背核TH5H免疫反應陽性神經元數量少于對照組(P<00);TH免疫陽性神經元直徑小于對照組(P<001);相關腦區(qū)TPH5-H和SERT免疫反應灰度值比對照組增高(P<0.05)。2.流式細胞術檢測可見,乙醇處理組大鼠TPH、5HT和SERT的表達量低于對照組(P<0.05)。免疫印跡法檢測可見乙醇處理組大鼠SERT和TPH與actn相對吸光度比值均小于相應對照組(P<0.05)。結論乙醇降低腦內TP5-HT和SERT的表達,可能改變腦內5HT能神經體系的功能活動[關鍵詞]乙醇;色氨酸羥化酶;5羥色胺;5-羥色胺轉運體;免疫組織化學;流式細胞術;免疫印跡法;大鼠[中圖分類號]Q952.4[文獻標志碼]A[Do10.3969/j,in,05291356.2009.03.010Effect of ethanol on the serotonergic systems in rat brainL Shuang-cheng",Kang Yun-xiao, SHI Ge-ming", CUI Hui-xian, WANG Lei, LI Xue-ping(I. Department of Neurobiology: 2. Department of Anatomy Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)[Abstract] Objective To study the effect of ethonal on the serotonergic systems by analyzing the altered expression oftryptophan hydroxylase(TPH), serotonin(5-HT)and serotonin transporter( SERT)in the brain of ethanol-treated rats. MethodsWistar rats were treated with 20% ethanol for 6 months. Immunocytochemistry, flow cytometry and Westem blotting were usedto analyze the altered expression of the serotonergic markers in different brain regions of the ethanol-treated rats. Resultsmistry showed the number of TPH or 5-Ht positive neurons in dorsal raphe nucleus( DRN)is leas in ethanol.treated rats than that in control(P<0.01), the diameter of TPHin dRN is smaller than that in control(P<0.01)andthe mean gray value of tpH, 5-ht and SERT in observed regions of the ethanol-treated rats is larger than that in control (P<0.05).2. Flow cytometry showed the expression of TPH, 5-HT and SERT in the studied regions of the ethanol-treated ratsdecreased significantly compared with control(P<0.05).3. Westem blotting showed the ratio of SERT/B-actinin or TPH/B-actinin in analyzed regions of the ethanol-treated rats is smaller than that in control(P <0.05). Conclusion Ethanol decreasesthe expression of TPH, 5-HT and SERT of rat brain, which may result in the altered activity of serotonergic systemsKey words] Ethanol; Tryptophan hydroxylase; Serotonin; Serottometry; Western blotting: Rat近年有關酗酒對腦內5-羥色胺(5T)能神經基有關。為進一步確定酗酒對腦內5HT能神經體系影響的研究主要集中于觀察腦內5羥色胺轉運體系的影響本研究利用免疫組織化學法、免疫印跡體( serotonin transporter,sERT)結合信號的改變“,法以及流式細胞術等觀察乙醇處理大鼠有關腦區(qū)5但所獲結果并不一致。表現為降低36無變H能神經體系的不同指標、特別是SERT蛋白的改化甚至增高,這很可能與所觀察的酗酒個體例變,從而判斷乙醇對腦內5H能神經體系的影響。數少、酗酒并發(fā)癥各異以及缺乏SET特異性配材料和方法[收稿日期]2008-01403[修回日期]2003031.動物模型基金項目]河北省教育廳計劃攻關項目資助(2007129);河北60只(河北醫(yī)省科學技術研究與發(fā)展指導課題資助項目科大H中國煤化為對照組和乙醇作者藺介]李雙成(1971-),男(漢族),河北省石家莊市人,處理CNMHG大鼠參照More醫(yī)學博士,副教授等的方法每天以20%乙醇代替飲水,每只實驗動物通訊作者( To whom correspondence should be addressed)每日飲入20%乙醇量為(1642±1.35)ml。飼養(yǎng)6E-mail:shigml23@126.comTel:(0311)86265503個月后處死。396解剖學報40卷,3期2.實驗方法隆抗體(1:500),4℃過夜。PVDF膜以TTBs洗32.1免疫組織化學染色:大鼠于深麻醉下次,每次10min。洗膜后加HRP標記的羊抗兔或小40g/L多聚甲醛(4℃)經心灌注固定h,取腦置相同鼠g(1:500037℃孵育1.5h。TTBs洗膜(3次,固定液后固定4h,300gL蔗糖液4℃過夜。所需部10min/次),TBS洗膜1次。增強型化學發(fā)光試劑位行冠狀位冷凍連續(xù)切片(厚40m),間斷集片,PB(ECL)增強化學發(fā)光后入X線片暗盒曝光,顯影洗片后行免疫組織化學反應。相關切片分別以小鼠定影。底片透掃,用 Lab Works45軟件測量免疫印抗色氨酸羥化酶( try tophan hydroxylase,TPH)單克隆跡條帶相對吸光度值,計算與內參免疫印跡條帶相抗體(1:100,Sigm公司)、兔抗5-HT多克隆抗體對吸光度值的比值,進行分析。(尾殼核1:50、腦干1:800,sigm公司)兔抗2.4統(tǒng)計學方法:所得上述相關數據以均值±標SERT多克隆抗體(1:1000,1 mmunostar公司)4℃孵準差(x±s)表示,經方差齊性檢驗后發(fā)現,該資料育48h;依一抗種屬以生物素化羊抗小鼠lgG(1:服從正態(tài)分布且方差齊行成組設計的t檢驗,P<500)或羊抗兔lgC(1:500)室溫孵育切片2h,1:5000.05為差異具有統(tǒng)計學意義。HRP鏈霉卵白素室溫孵育1h。每步間以TBs洗片DAB呈色、貼片、封片、觀察。用100g/L正常羊血清結果代替一抗,相同步驟孵育,作為陰性對照免疫組織化學結果細胞計數:40倍物鏡下,參照 James等的方法,般觀察發(fā)現,乙醇處理組大鼠中縫背核(B7)按 Paxinos大鼠腦圖譜,分別計數中縫背核(B7)lcm2TPH、5-HT以及SERT免疫反應強度比對照組減弱面積中TPH和5HT免疫反應陽性神經元數量。(圖1A,1B,2A,2B,3A,3B)。TPH5HT免疫反應細胞直徑:40倍物鏡下,參考 James等的方法,選陽性細胞數量少于對照組(1A,1B,2A,2B);高倍取中縫背核胞核明顯、無重疊的TPH陽性神經元,測鏡下,乙醇處理組大鼠中縫背核、尾殼核、隔核以及量其最長徑及最短徑,取平均值作為細胞直徑。扣帶皮質SERT陽性纖維比對照組稀疏(3A,3B,灰度測量: HPIAS-1000圖文系統(tǒng)分析乙醇處理4A,4B,5A,5B)。和對照組中縫背核(B7)(TPH5-HT和SERT)、尾細胞計數顯示,與對照組相比,乙醇處理組中縫殼核(5H和SET)、隔核、扣帶皮質(SERT)的5HT背核TPH、T免疫反應陽性神經元數量明顯減能神經元有關指標的灰度值。TPH、5T和SERT少,減少程度分別達到3564%和35.33%(P<的表達強度與測得灰度值負相關。0.01,表1)。細胞直徑測量顯示,與對照組相比,乙2.2流式細胞術檢測:大鼠快速斷頭取腦冰板醇處理組中縫背核背側部和腹側部TPH陽性神經上取所需腦組織,制備單細胞懸液并取1x10/m細元直徑減小程度達569%、腹外側部達861%(P胞,分別加入小鼠抗TPH單克隆抗體、兔抗SERT多<0.01,表1)克隆抗體及兔抗5-HT多克隆抗體各0.1ml(1:100灰度測量顯示,與對照組相比,乙醇處理組各指室溫孵育30min,人PBs1oml洗滌,離心棄上清,入標灰度值均有增高。其中TPH在中縫背核(B7)增異硫氫熒光素免疫球蛋白G(FmCG)及藻紅素免高幅度達19.91%(P<0.05,表2);5H在中縫背疫球蛋白G(PE1c)0.1ml避光室溫孵育30min,加核(B7)和尾殼核的灰度值分別增高了30.47%和入PBs1ml離心,棄上清,PBS0.1ml經500目銅10.05%(P<0.05,表2);SERT在中縫背核(B)、扣網過濾上機檢測,對蛋白免疫熒光標記物測定時設帶皮質尾殼核和隔核的增加也分別達到16.30%、一抗或二抗的本底對照和陰性對照。電腦記錄,分0.45%、19.17%和357%(P<0.05,表2別計數乙醇處理組和對照組TPH、5-H和SERT的2.流式細胞術檢測表達量 X-mode值,所得結果轉變成線性數據,取log乙醇處理組TPH、5-HT和SERT的表達量與對( X-mode)×340。照組相比減少,比各自相應的對照組分別減少了23免疫印跡法檢測:大鼠快速斷頭取腦,冰板68%、13.88%和73%(P<0.05,表3,圖6)。上取上下丘腦之間的腦組織入液氮速凍后入低溫冰3.免疫印跡檢測箱備用。取所需腦組織入4℃裂解液勻漿5min,冰中國煤化工與Bm免疫浴靜置1h,4℃離心,取上清, Bradford法測定蛋白濃印帶皮質、尾殼核和中度。每個樣品取50總蛋白經100g/ L SDS-PAGE縫CNMHG76%(P<005,表凝膠電泳分離,電轉移至硝酸纖維素(PVDF)膜上,4,圖7);而中縫背核的TPH與 B-actin條帶相對吸光用50g/L脫脂奶粉室溫封閉2h,分別入50g/L脫脂度比值則減少了141%(P<005,表4圖8)奶粉稀釋的小鼠TPH單克隆抗體和兔抗SERT多克Vol, 40, No. 3李雙成等.乙醇對大鼠腦內5H能神經體系的影響397圖1A免疫組織化學法示對照組大鼠中縫背核TPH免疫反應。ABC法染色,DAB顯色(下同)x16圖1B免疫組織化學法示乙醇處理組大鼠中縫背核TPH免疫反應。x16圖2A免疫組織化學法示對照組大鼠中縫圖2B免疫組織化學法示乙醇處理組大鼠1A1B中縫背核5HT免疫反應。x圖3A免疫組織化學法示對照組大鼠中縫背核SERT免疫反應。x13.2圖3B免疫組織化學法示乙醇處理組大鼠中縫背核SERT免疫反應圖4A免疫組織化學法示對照組大鼠尾殼核SERT免疫反應2A2B圖4B免疫組織化學法示乙醇處理組大鼠尾殼核SERT免疫反應。x50圖5A免疫組織化學法示對照組大鼠隔核sERT免疫反應圖5B免疫組織化學法示乙醇處理組大鼠隔核SERT免疫反應ABC. DAB3A3B Fig 1B TPH immunoreactivity in the drn ofFig- 2A 5-HT immunoreactivity in the dRn ofcontrol group using the method ofFig2B 5HTeactivity in the drn ofethanol treated group using the method4Bof ABC. DABFig 3A SERT imrctivity in the DRN ofcontrol group using the methodABC. DAB staFig 3B SERT immunoreactivity in the drn ofethanol treated group using the meFig 4A SERT immunoreactivity in theCaudate-Putamen CPu)of control5A5Bgroup using the method of ABC. DABFig 4B SERT immunoreactivity in the CPu of ethanol treated group using the method ofFig 5A SERT immunoreactivity in the septal nucleus of control group using the method of ABC. DAB stain x50Fig5B SERT immunoreactivity in the septal nucleus of ethanol treated group using the method of ABC. DAB stain x50表1乙醇處理大鼠腦內5H能神經元的變化(均值±標準差)Table 1 The changes of of 5-HT energic neurons in ethanol-treated group(i+ s)5羥色胺(5-HT)色氨酸羥化酶(TPH)分組數目(個cm2)( number)數目(個/cm2)( number)直徑( diameter,pm)中縫背核(DRN)中縫背核(DRN中國煤化工腹外側部(Dv對照組( control24.57:0.7024.86±1.28乙醇處理組( ethanol)CNMHG 11.84+1.5015.89±0.6716.00±1.0010.82±1,69與對照組比較( Compared with control group)P<0.01398解學報40卷,3期表2乙醇處理組大鼠腦內相關腦區(qū)TPH5H和SERT的灰度比較(均值±標準差)Table 2 The comparison of the mean gray scale value of TPH, 5-HT and SERT in ethanol-treated group(i t s)色氨酸羥化酶TPH5羥色胺5HT5羥色胺轉運體SERT分組中背縫核尾殼核中縫背核尾殼核中背縫核扣帶皮質DRN8880±1.29164.94±1.844578±543102.68±7.72109.57±280149.44±14.16118.16±8.13乙醇處理組( ethano)106.48±681.52±2.4549.73±1.67122.36±754·120.45±665·180.00±1.85·157.83±9.46與對照組比較( Compared with control group)“P<0.01;P<0.05表3流式細胞術檢測大鼠中縫背核TH5HT和SERT的表達變化(均值±標準差)Table 3 The altered expression of TPH, 5-HT and SERT in DRN of rat by flow cytometry(i t s)分組(goup)色氨酸羥化酶(TPH)5羥色胺(5-HT)5羥色胺轉運體(SERT)對照組( contro)638.30±1.37439.2±19.99553.36±1513乙醇處理組( ethanol)595,20±13.5378.25±6,84513.11±12.05與對照組比較( Compared with control group)“P<0.05函10101021010°101021010°10102103FL2 LOGFL2 LOG相對含量( relative contaet相對含量( relative contaet相對含量( relative contrnet)1010101010°1010210≤10°1010210FL2 LOGFLI LOGFL2 LOG相對含量( relative contract)相對含量( relative contaet)相對含量( relative contaet)5-羥色胺(5-H色氨酸羥化酶(TPHD5-羥色胺轉運體(SERT)圖6流式細胞術檢測乙醇處理組大鼠中縫背核5 HT. TPH和SERT的表達變化Fig.6 The expression of 5-Hr, TPH and SERT in DRN o brain rat by flow cytometry表4免疫印跡法檢測乙醇處理大鼠腦內SERT和TPH的表達變化(比值均值±標準差)Table 4 The altered expression of SERT and TPH in ethanol-treated group(Ratio, i t s)分組色氨酸羥化酶(TPH)5羥色胺轉運體(SERT)中縫背核(DRN)中縫背核(DRN尾殼核(cPu)扣帶皮質(對照組( control)00064±1.13×10-4037:1.310-30.004:8.97×10-0.034±5.6乙醇處理組( ethanol0.0055±6.17X100.0034±1.53×10*0.002:1.35×100031:6.9×10與對照組比較( Compared with control group)“P<0.01ContreEthanol中國煤化工NMHG圖7免疫印跡檢測乙醇對大鼠扣帶皮質、尾殼核和中縫背核SERT表達的影響d ehanol on SERtin Cingulate gyrus(Cg), CPu andVol 40, No. 3李雙成等乙醇對大鼠腦內5H能神經體系的影響399進一步的研究證實。Control以往的研究表明腦內5H能上行投射纖維主要來自腦干中縫核群頭側組,其中中縫背核是最重要的5H能神經核團,與前腦如大腦皮質海馬等諸多腦區(qū)具有廣泛的投射聯系。5-H受體具有多圖8免疫印跡法檢測乙醇處理對大鼠中縫背核TPH種亞型,參與腦內多種神經活動,如情感、認知及睡表達的影響眠等的調控。酗酒者6或酗酒人腦標本3sERTFig. 8 The effect of Ethanol on TPin drn of結合信號的減弱,以及我們在長期攝入乙醇大鼠腦內所發(fā)現的5H能神經體系多個指標降低,表明長討論期攝入乙醇導致了5HT能神經體系功能活動的障礙,從而可能影響腦內5HT能神經體系所參與的功限速酶TPH決定神經遞質5I的合成效率,位能活動。于5HT能神經末梢的膜蛋白SERT則通過再攝取突近年對酗酒者腦內是否存在5HT神經體系改觸間隙的5H而中止其對突觸后神經元的作用。變的研究主要以配基放射自顯影術檢測酗酒人腦標SERT既是反應5H能神經元功能活動的重要指本、以 CIT PET/SPECT配基顯像技術檢測酗酒者腦標,也是反應5H能神經末梢多寡的敏感指內的SERT結合信號變化,這些研究由于檢測的只標。SET和TPH的表達變化都將直接影響5H是單一指標的改變,而SET蛋白表達受多種因素能神經元參與的神經活動。本研究通過對大鼠5HT的影響除與個體的遺傳背景有關外“m,死后取材能神經元的免疫組織化學、免疫印跡以及流式細胞術的時間以及伴發(fā)疾病都可能影響SERT表達變化;結果的分析發(fā)現,乙醇處理引起腦內5HT能神經體另外,配基顯像技術所用配基PCr,并非只結合系多個指標的降低。我們發(fā)現,無論是5-Ⅲ能神經SERT,有研究發(fā)現,βCT除結合SERT還能結合多元投射源區(qū)(中縫背核B7),還是其投射靶區(qū)(尾殼巴胺轉運體( dopamine transporter,DAT)",而多數腦核扣帶皮質及隔核)SET的表達均顯著減弱。這與區(qū)都有SERT和DAT的交織分布,因此,應用pcr近年應用配基放射自顯影技術發(fā)現酗酒人腦標本杏配基顯像技術難以確定SERT在酗酒者腦內的真實仁核和尾狀核SET結合信號減少-,應用配基顯水平。同時酌酒還可能引起DAT的表達改變而混像技術發(fā)現酗酒者SERT標記信號顯著降低以及淆SERT變化的真實本質,這些都可能是造成目前免疫放射自顯影發(fā)現SERT表達減少的結果一研究報道結果不完全一致的原因。本研究采用致。SERT在所觀察腦區(qū)的低標記信號的結果表明,SERT特異性抗體識別抗原的方法,檢測的是組織內長期攝入乙醇可能干擾了5H能神經元的代謝活蛋白的含量高低,真實地反映了腦內SERT含量的動降低了SERT蛋白的表達。我們應用免疫組織化改變,并從多個方面觀察到腦內5H能神經體系的學免疫印跡以及流式細胞術在乙醇處理組大鼠5-變化,為酗酒引起腦內5H能神經活動的障礙提供HT能神經元投射源區(qū)所觀察到的TPH低表達以及其了直接的形態(tài)學依據反應產物5H在中縫背核、尾殼核降低的結果更進參考文獻步說明長期攝人乙醇可能導致5HT能神經體系【1Mmr,mphE,HB,A. Serotonin transporter distribution功能活動的減弱。本研究在乙醇處理大鼠所觀察到o alcoholic and nonalcoholic的SET、TPH以及5H的減少推測可能是乙醇處理companion糾lct: a whole-hemisphere autoradiog-y時[刀的毒性作用引起了大鼠腦內5-HT能神經元的變性所Am J Psychiatry,2002,159(4):599606,致。近年的研究發(fā)現長期乙醇處理可引起小腦普肯2】sokM, Thienen J, Haukijavi T,l. Amygdala Serotonin耶細胞樹突內滑面內質網擴張,且部分這樣的樹突出Transporters in alcoholics measured by wholehemisphere autoradiography刀]. Synapse,200,61(8現衰老和缺氧過程中常見的變性體( degenerating【3 STorvik M, Tiihonen J, Haukijavi T,l. Lower serotonin transporterbodie)y,這些改變可能與神經元的內在特性有關同樣的動物模型小腦顆粒細胞則無類似的超微結[4] Brown aK,CDr, Fujita M, et al.rr["c] DASB imaging構變化。盡管在普肯耶細胞未發(fā)現其他顯著的超微中國煤化工=[.AcmP結構變化,但樹突內變性體的存在至少提示這些[5]HCNMH神經元的功能受到一定的損傷,只是損傷程度可能較transporters in alcoholism[J]. Am J Psychiatry, 1998, 155(11):1544輕而未累及到神經元胞體。長期乙醇處理是否引起5HT能神經元相似的病理改變及損傷機制尚有待于[6】 Heinz A,JmpWG, et al. Relationship between cortisol解剖學報40卷,3期nd serotonin metabolites and transporter in alcoholism [ J]2005,20(20):1153-1155Pharmacopsychiatry, 2002, 35(4): 127-134李雙成,石雄,石葛明,等,附酒與扣帶回前部滕周皮質5羥色[7 I Starvik M, Tihonen J, Haukijarvi T, e al. Nucleus accumbens胺轉運體的表達[J.臨床薈萃,200,20(20):1153155serotonin transporters in alcoholics meaaured by whole-hemiaphere [13]Shi GM, Li ShCh. Cui HX, e al. Expression of serotonin transporter inautoradiography[J].Alcohol, 2006, 40(3):177-184.rostral raphe nuclei of brainstem in aleo holiehuman[J]. Chinese Joumal[8 OKada T, Fujita M, Shimada S, et al. Assessment of affinities o B-of Anatomy,2006,29(2):213215-219CIT, B-CIT-FE, and B-crr-FP for monoamine transporters permanently石葛明,李雙成,崔慧先,等.5羥色胺轉運體在酒人腦干頭ssed in cell lines[ J]. Nucl Med Biol, 1997. 25(1): 53-58側中縫核群的表達[].解剖學雜志,2006,29(2):213-215-219[9 ]Miner L, Schroeter S, Blakely RD, et al. Ultrastructural localization o [14 ]Dlugos CA. Ethanol-related smooth endoplasmic reticulum dilation inthe serotonin transparter in superficial and deep layen of the rotpurkinje dendrites of aging at[J]. Alcohol Clin Exp Ree, 2006,30terminals [J]. J Comp Neurol, 2000, 427 (2):220-234[15]Chen S, Hillman DE. Dying-back of Purkinje cell dendrites with[1o]Hariri AR, Holmes A.Gof emotional regulation: the role of theynapse Low in aging ms[J]. J Neurocytol, 1999, 28(3):187-196serotonin transporter in neural function[J]. Trends Cogn Sci, 2006, 10 [16]Heinz A, Coldman D, allinat J, et al. Pharmacogenetic insights to4):182-191monoaminergic dysfunction in alcohol dependence J][11] Nielsen K, Brask D, Knudsen GM, e al. Immunodetection of thePsychopharmacology(Ber), 2004, 174(4):561-570serotonin transporter protein is a more valid marker for serotonergic fibers [17] Heinz A, Jones DW, Mazzanti C, et a. A relationship betweenhan serotonin[JI. Synapse, 2006, 59(5):270-276serotonin transporter genotype and in tito protein expression and alcohal[12]Li ShCh, Shi X, Shi GM, et a. Expression of serotonin transporter inneurotoxicity[ I]. Biol Psychiatry, 2000, 47(7): 643-649pregenual anterior cingulate cortex of alcoholics[J]. Clinical Focus(編舞鄒尚敏)《解剖學報》第十一屆編委會主編章靜波常務副主編周長滿主編徐群淵李云慶于恩華許增祿顧曉松羅建紅何大澄唐軍民高福祿編委D. Brynmor Thomas Elaine F, Reed Stephen W. Carmichael Leonard L. Seelig JR安威柏樹令蔡文琴常智杰陳東陳曉春陳耀星丁文龍竇犟華段相林方秀斌郭順根韓代書韓卉何欣黃東陽姜宗來金國華金連弘景雅鞠躬李和李繼承李金蓮林建銀劉斌劉佳劉樹偉盧光琇羅學港馬文麗穆祥牛建昭歐陽鉤饒志仁桑建利宿寶責蘇國輝唐茂林唐勇王海杰汪華僑王懷經王亞平吳燕婉王云川席煥久謝富康徐存拴徐慧君羊惠君姚大衛(wèi)姚志彬應大君原林曾園山張傳森張雷張志謙張欽憲張紹祥張世馥張衛(wèi)光張遠強趙玲輝周國民朱長庚鄒仲之左伋左明雪(躺要以漢語拼音為序)中國煤化工CNMHG