第24卷第7期農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)VoL 24 No.2008年7月Transactions of the CSaeJul.2008甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇研究康利平,劉莉,劉萍,胡錦榮,孫君社(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京100083)搞要:該文通過(guò)研究甜高粱莖稈M8E固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的主要影響因素,確定發(fā)酵條件為:耐高溫釀酒酵母接種量為3%,發(fā)酵初始基質(zhì)含水率為76%,添加0.25%CaCl2,0.25%MgSO4H2O,40℃發(fā)酵24h,乙醇得率為642g(100g)甜高粲莖稈,轉(zhuǎn)化率為905%,殘?zhí)呛康陀?3%;添加10FUg纖維素酶和10CBU/gB葡萄糖苷酶進(jìn)行同步糖化固態(tài)發(fā)酵,乙醇得率為753g(100g甜高粱莖稈,與不添加纖維素酶和B葡萄糖苷酶的相比,乙醇得率提高了14.6%關(guān)鍵詞:甜高梁莖稈;國(guó)態(tài)發(fā)酵;燃料乙醇中圖分類號(hào):S2162文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼文章編號(hào):10026819(2008)-7-0181-04康利平,劉莉,劉萍,等.甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(7):181-184Kang Liping, Liu Li, Liu Ping, et al. Production of fuel ethanol from sweet sorghum stalks by solid-state fermentation]Transactions of the CSAE, 2008, 24(7): 181-184.(in Chinese with English abstract)0引言材料與方法甜高粱( Sorghum bicolor Moench L),又稱糖高粱、1.1實(shí)驗(yàn)材料蘆粟或甜稈,既是一種糧食作物、糖料作物,又是能源甜高粱莖稈:品種M8E,產(chǎn)地濱州,由山東濱州作物。每畝甜高粱產(chǎn)400-000kg富含糖分和纖維的莖光華生物能源有限公司提供,2006年5月種植,10月收稈,200~500kg的糧食籽粒,其中70%~80%的干重割,生長(zhǎng)期為150d。新鮮甜高粱莖稈中含水率7280%組分可被利用生產(chǎn)燃料乙醇。隨著國(guó)家對(duì)糧食燃料乙醇總糖含量1392%,粗纖維含量9.61%的限制,發(fā)展甜高粱燃料乙醇是發(fā)展清潔生物能源的重耐高溫釀酒酵母:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保要途徑存菌種甜高粱莖稈液態(tài)發(fā)酵乙醇工藝已有廣泛研究17,但纖維素酶:湖南尤特爾生化有限公司提供。其中濾存在著廢液治理難、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題,而固態(tài)發(fā)酵紙酶活200FPU/g,β葡萄糖苷酶酶活69cBUg具有能耗小,產(chǎn)物濃度高,產(chǎn)生廢水少,運(yùn)作費(fèi)用低等Novoye188: Sigma公司購(gòu)買,其中β葡萄糖苷酶優(yōu)點(diǎn)9,而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)甜高粱固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的酶活301CBUL。研究仍較少, Mamma(0等人利用 Fusarium arysporun和斜面保藏培養(yǎng)基:2%葡萄糖,1%酵母膏,2%蛋白Saccharomyces cerevisiae混菌糖化發(fā)酵甜高粱莖桿,利用胨,0.2%KH2Po,01%MgSo47H2O,自然pH值,121Fusarium oxysporum產(chǎn)酶水解纖維素和半纖維素等不可滅菌5min溶性糖,其發(fā)酵周期非常長(zhǎng): bryan)時(shí)未火菌甜高粱莖種子活化培養(yǎng)基:2%葡萄糖,1%酵母膏,2%蛋白稈進(jìn)行自然固態(tài)發(fā)酵,副產(chǎn)物較多;宋俊萍等對(duì)甜高胨,自然pH值,12l℃,滅菌15min粲莖稈直接粉碎固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了研究,僅利用了甜1.2實(shí)驗(yàn)方法高粱莖稈中的可溶性糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。本文通過(guò)對(duì)甜高1)固態(tài)發(fā)酵粱莖稈粉碎后固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行研究的同時(shí),還探索了將甜高粱莖稈粉碎至粒度大小0.1~0.3cm。于纖維素酶對(duì)甜高粱莖稈同步固態(tài)發(fā)酵的作用,充分利用121℃,滅菌15min往500mL三角瓶中裝入100g甜高甜高粱莖稈中的可溶性糖和部分纖維素發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙梁粉碎莖稈,接入培養(yǎng)18h的種子培養(yǎng)基,根據(jù)發(fā)酵條醇,提高了甜高粱莖稈的乙醇得率,且在發(fā)酵時(shí)間、副件進(jìn)行調(diào)節(jié),塞上發(fā)酵栓,放入恒溫箱靜止發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物及環(huán)境保護(hù)上具有優(yōu)勢(shì),為將來(lái)甜高粱莖稈乙醇固設(shè)置兩個(gè)重復(fù)態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)2)含水率測(cè)定將粉碎后甜高粱莖稈于60℃烘箱中烘干至恒重。根收稿日期:200709修訂日期:200802-25據(jù)質(zhì)中國(guó)煤化工作者簡(jiǎn)介;康利平(1983-),女,主要從事甜高粲莖稈生產(chǎn)燃料乙醇的研究。北京清華東路17號(hào)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,100083CNMH已醇,150w超聲波50℃程方面的研究北京清華東路17號(hào)中國(guó)衣業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)分次浸提40m,過(guò)濾定容院,100083還原糖測(cè)定:DNs法18農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)2008年總糖測(cè)定:浸提濾液用12NHC1于60℃水解7min,呼吸、傳熱等過(guò)程受到抑制:而發(fā)酵中后期,乙醇生成用1 N NaOH中和至中性,DNS法測(cè)定。同時(shí)產(chǎn)生的水,能夠滿足酵母發(fā)酵過(guò)程所需水分,和部4)粗纖維測(cè)定1分水分蒸發(fā),因此只要考慮發(fā)酵過(guò)程的起始含水率即可5)乙醇含量測(cè)定從保護(hù)環(huán)境和節(jié)約成木的角度出發(fā),選擇基質(zhì)含水率在將發(fā)酵后醪糟,用大約100mL的蒸餾水多次洗滌倒76%左右進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵比較合適入250mL的蒸餾燒瓶中,蒸餾,用50mL的容量瓶收集餾分,當(dāng)餾分接近50mL時(shí),停止蒸餾,用蒸餾水定容乙醇轉(zhuǎn)化率一殘?zhí)呛繗庀嗌V條件; PerkinElmer Autosystem xI,色譜柱:DikmaCap Capillary Columns(30m×053μm),柱升溫程序:從38℃升溫,10℃/min升溫到60℃,20℃/min升溫到150℃,30℃min升溫到205℃,進(jìn)樣量1μ,分流比1:1,進(jìn)樣口溫度200℃,檢測(cè)器溫度230℃,氫火焰離子檢測(cè)器。6)發(fā)酵殘?zhí)呛繙y(cè)定:DNS法1固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)含水率/7)CO2失重測(cè)定:重量法。圖2初始基質(zhì)含水率對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的影響Fig 2 Influence of original water content on solid結(jié)果與分析fermentation of sweet sorghum stalks2.1接種量對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的影響2.3無(wú)機(jī)鹽對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的影響酵母菌在種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)18h達(dá)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期CaCl2和MgSO4被認(rèn)為對(duì)微生物的生長(zhǎng)和發(fā)酵影后,按甜高粲莖稈質(zhì)量的1%,3%,5%,8%,10%6,響較大6,鈣離子是一些酶的穩(wěn)定劑和激活劑(如蛋白12%接入菌懸液,36℃,添加0.5%CaCl,02%酶等),它還能與果膠等雜質(zhì)的作用,減小雜質(zhì)對(duì)發(fā)酵過(guò)MgSO7H1oO,含水率74%,進(jìn)行發(fā)酵。從圖1可以得出,程的抑制:鎂離子參與酵母代謝過(guò)程中許多反應(yīng),并且接種量為3%時(shí),乙醇產(chǎn)率最高,100g甜高粱莖稈能夠提供酵母中含硫氨基酸的成分。本文研究了CaCl2及生成614g乙醇,此時(shí)發(fā)酵基質(zhì)中殘?zhí)呛恳蚕鄬?duì)比較MgSO7HO對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的影響分別在添加低,小于04%。而接種量過(guò)低或者過(guò)高,都不利于乙醇量為0.00%,0.25%,0.50%,1.00%,1.50%在36℃,濕的生成?？赡墚?dāng)接種量較少時(shí),酵母利用過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)物基含水量為76%進(jìn)行實(shí)驗(yàn),如圖3,圖4所示,當(dāng)CaC2質(zhì)進(jìn)行組織分裂和生長(zhǎng),沒有進(jìn)入乙醇發(fā)酵途徑;當(dāng)接種量過(guò)大時(shí),發(fā)酵空間及養(yǎng)分都不能滿足酵母需要,影響最終乙醇產(chǎn)率。殘?zhí)呛縯超5.50乙醇轉(zhuǎn)化率8500殘?zhí)呛縆0.250.501.001505caCl2添加量/圖3CaCl2對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的彩響圖1接種量對(duì)甜高梁莖稈國(guó)態(tài)發(fā)酵的影響Fig 3 Influence of CaCl2 on solid fermentation1 Influence of different inoculation on solidof sweet sorghum stalksfermentation of sweet sorghum stalks10002.2基質(zhì)含水率對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的影響一乙醇轉(zhuǎn)化率]08一殘?zhí)呛刻鸶吡磺o稈在放置貯藏過(guò)程中,極易失水15,而060基質(zhì)含水率是固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中一個(gè)重要的因素,影響著酵母的生長(zhǎng)代謝、傳質(zhì)導(dǎo)熱,因此發(fā)酵過(guò)程中需要對(duì)基質(zhì)進(jìn)行水分調(diào)節(jié)。試驗(yàn)中調(diào)節(jié)甜高粱莖稈濕基水分含量至70%,72%,74%,76%78%80%,接種3%,添加中國(guó)煤化工05%CaC2,0.2%MgSO47H2O,36℃進(jìn)行發(fā)酵。CNMH001.50從圖2可以看出,隨著基質(zhì)含水率的增加,乙醇產(chǎn)gwxy量/率呈上升趨勢(shì),最后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)中含水率低于74%時(shí),乙醇產(chǎn)率受到較大影響,主要原因是發(fā)圖4MgSO47H2O對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的影響Fig 4 Influence of MgSO,7H,O on solid fermentation酵前期,酵母繁殖生長(zhǎng)需大量水分,當(dāng)含水率低時(shí),其of sweet sorghum stalks第7期康利平等:甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇研究和MgSO47H2O的添加濃度都為025%,乙醇轉(zhuǎn)化率最發(fā)酵以20~24h合適。高,然而無(wú)機(jī)鹽添加濃度過(guò)高時(shí),發(fā)酵基質(zhì)滲透壓過(guò)高,不利于酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵,使得乙醇轉(zhuǎn)化率下降添加纖維素醇2.4發(fā)酵溫度對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的影響本文研究溫度刈甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的同時(shí),還研究了纖維素酶對(duì)固態(tài)發(fā)酵的作用效果。比較了添加酶(10FPUg纖維素酶和10cBU/g葡萄糖苷酶,以甜高粱莖稈干重計(jì)算)與不添加酶在各溫度下固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的情況,從表1可以看出,40℃發(fā)酵時(shí)乙醇得率均達(dá)到發(fā)酵時(shí)間/h最高,溫度過(guò)低或過(guò)高都不利于乙醇生成,此時(shí),添加圖5甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中CO2的失重纖維素酶發(fā)酵的乙醇得率可達(dá)到753g/(100g)甜高粱莖g 5 COz emission in sweet sorghum stalks by solid稈,比不添加酶提高了148%各溫度下加酶發(fā)酵的乙醇fermentation得率均高于未加酶發(fā)酵,這是因?yàn)樵谝掖及l(fā)酵的同時(shí)纖維素酶對(duì)甜高粱莖稈中大量存在的纖維素進(jìn)行糖化分3結(jié)論解,從而生成了乙醇。而甜高粱莖稈中粗纖維含量約1)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇最優(yōu)發(fā)酵條件10%,與可溶性糖含量相差不大,可加酶同步糖化固態(tài)發(fā)為:耐高溫酸酒酵母接種量為3%,發(fā)酵基質(zhì)初始含水率酵過(guò)程中乙醇得率提高量不超過(guò)15%,說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中為76%左右,發(fā)酵溫度40℃,添加025%CaC2,025%纖維素的利用率非常低,原因還在于甜高莖稈纖維素MgSO47HO,發(fā)酵時(shí)間為24h,乙醇得率為642g(100g)沒有經(jīng)過(guò)預(yù)處理,結(jié)構(gòu)緊湊,空間間隙小,纖維索酶甜高粱莖稈,轉(zhuǎn)化率為90.5%,殘?zhí)呛繛?.3%以下與之接觸面積少,加上甜高粱莖稈本身含糖量高,底物2)在最優(yōu)發(fā)酵條件下添加10FPUg纖維素酶和反饋抑制使纖維素酶水解效率低。10CBU/gB葡萄糖苷酶,進(jìn)行甜高粱莖稈同步糖化固態(tài)添加纖維素酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的殘?zhí)呛勘炔惶砑用赴l(fā)酵,乙醇得率為753g/(100g甜高粱莖稈,與不加纖維要高,前者殘?zhí)呛?.6%左右,后者在0.3%以下。這素酶和β-葡萄糖苷酶的相比,乙醇得率提高了146%,殘可能是酵母菌優(yōu)先利用葡萄糖而使半纖維素分解產(chǎn)生的糖含量為05%左右木糖過(guò)剩造成,也可能是可溶性糖發(fā)酵完全后,纖維素3)將含水率728%,總糖含量1392%,粗纖維含量酶繼續(xù)分解甜高粱莖稈的木質(zhì)纖維素,產(chǎn)生還原糖,而9.61%的甜高粱莖稈粉碎,在優(yōu)化條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,使得殘?zhí)呛枯^高不添加酶生產(chǎn)It燃料乙醇需要155t甜高粱莖稈;添加表1發(fā)酵溫度對(duì)甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵的影響10FPU/g纖維素酶和10 CBU/gB葡萄糖苷酶進(jìn)行同步糖Table 1 Temperatures influence on solid fermentation of sweet化固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)1t燃料乙醇需要132t甜高粱莖稈sorghum stalks添加纖維素酶未添加纖維素酶1]黎大爵.調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu),發(fā)展甜高粱乙醇燃料產(chǎn)業(yè)[門農(nóng)乙醇得率戎糖含量乙醇得率殘?zhí)呛繕I(yè)工程學(xué)報(bào),2003(19):168-17g·(100g莖稈)%g·(100g莖稈[2 Billa E, Koullas D P, Monties B, et al. Structure andcomposition of sweet sorghum stalk components[J]. IndustrialCrops and Products, 1997,(6): 297-302[3]劉榮厚,李金葭,沈飛,等.甜高粱莖稈汁液固定化酵母乙醇發(fā)酵的研究[門農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2005,(21):137140[4]呂欣,段作營(yíng),毛忠貴.氮源與無(wú)機(jī)鹽對(duì)高濃度乙醇發(fā)2.6甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵時(shí)間的確定酵的影響門西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,根據(jù)酵母發(fā)酵途徑,其反應(yīng)方程式為CH12O6(31):159-163→2C2H3OH+2CO2↑由該式可知,CO2釋放量:乙醇=22S沈飛.甜高粱莖稈汁液發(fā)酵制取乙醇的試驗(yàn)研究D].沈23,可以根據(jù)CO2的失重確定乙醇的發(fā)酵程度。甜高陽(yáng):沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),2006[6王鋒,成喜雨,吳天祥,等.甜高粱莖稈汁液乙醇發(fā)酵粱莖稈發(fā)酵過(guò)程中,每隔2h稱取發(fā)酵瓶重,得CO2失重及其經(jīng)濟(jì)可行性研究[門.釀酒科技,2006,(8):41-43.的曲線(圖5),甜高粱固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵時(shí)間主要集中在[7B中國(guó)煤化工lication of第6~16小時(shí),其中第10小時(shí)達(dá)到發(fā)酵的高峰,其中添ation of sweet stem加纖維素酶的失重比沒有添加纖維素酶的要大。20h后CNMHGIndustrial Crops andProduCO2失重不明顯,但添加纖維素酶的發(fā)酵瓶中CO2失重張管生.甜高粱莖稈制燃料乙醇工程路線探討門.中外能仍緩慢進(jìn)行,說(shuō)明酵母仍在利用甜高粱莖稈中的木質(zhì)纖源,2006,(11):104-107維素進(jìn)行同步固態(tài)發(fā)酵,綜合發(fā)酵時(shí)間和乙醇轉(zhuǎn)化率,(⑨肖明松,楊家象.甜高粱莖稈固體發(fā)酵制取乙醇產(chǎn)業(yè)化示農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)2008年范工程[農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2006,(22):207-210[4】吳國(guó)峰,李國(guó)全.工業(yè)發(fā)酵分析[M,北京:化學(xué)工業(yè)出[10] Mamma D, Koullas D, Fountoukidis G et al. Bioethanol from版社,2006:29-30sweet sorghum. simultaneous saccharification and[]曹文伯.甜高粱莖稈貯存性狀變化的觀察[.中國(guó)種fermentation of carbohydrates by a mixed microbial culture業(yè),2005,(4):43U. Process Biochemistry, 1996,(31): 377-381[16]張?jiān)搞?劉榮厚,孫清,等,營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)甜高粲莖稈汁液乙[11] Bryan W L. Solid-state fermentation of sugars in swsorghum[]. Enzyme and Microbial Technology, 1990,(12)醇發(fā)酵的影響[門,農(nóng)機(jī)研究,2005,(6):175-177437-442[17] Ballesteros M, Oliva J M, Negro M J, et al. Ethanol fromlignocellulosic materials by a simultaneous saccharification[2]末俊萍,陳洪章,馬潤(rùn)宇,甜高粱稈圊態(tài)發(fā)酵制取乙醇的and fermentation process(SFS)with Kluyveromyces marxianus研究門,釀酒,2007,(34):81-84.CECT 10875] Process Biochemistry, 2004,(39): 1843[13]張龍翔,張庭芳,李令嬡,生化實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)(第2l848版川DM北京:高等教育出版社,1997Production of fuel ethanol from sweet sorghum stalks by solid-statefermentationing Liping, Liu Li, Liu Ping, Hu Jinrong, Sun Junshe( College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Bejing 100083, China)Abstract: Sweet sorghum stalks convert to fuel ethanol by solid-state fermentation with simple technology process anlow pollution. The paper mainly studied critical factors of solid-fermentation from sweet sorghum stalks to ethanol, theresults showed that under the optimum conditions, 3% inoculation, original water content about 76%, 0.25%CaCI,0. 25% MgSO4 7H2O, the ethanol yield was 6.42 g/(100 g) sweet sorghum stalks conversion rate was 90.5% at 40Cfor 24 h, and residue sugar was less than 0.3%. Adding 10 FPU/g cellulase, 10 CBU/g B-glycosidase for simultaneoussaccharification and fermentation, the ethanol yield was 7.53 g/(100 g)sweet sorghum stalks, which was enhanced by14.6% due to the bioconverserion polysaccharides to ethanolKey words: sweet sorghum stalks; solid-fermentation; fuel ethanol中國(guó)煤化工CNMHG