中國(guó)病理生理雜志Chinese Joumal of Pahopyialogy 2001 ,17(7): 668[文章編號(hào)] 1000- 4718(2001)07 - 0668 -01TUNEL技術(shù)改良鄭佩娥'，陳小琳2， 張海偉'， 黃丹|(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院'病理解剖教研室，2發(fā)熱研究室,廣東廣州510632)[主題詞]獼亡;方法[MeSH] Apoptoi; Methods[中圖分類號(hào)] 0Q95.336[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B細(xì)胞凋亡的研究已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外形態(tài)學(xué)和分3 染色程序子生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)中。檢測(cè)細(xì)胞凋亡的主要方3.1 每塊蠟塊作連續(xù)切片 2張,分為A、B2組A法有形態(tài)學(xué)和基因組DNA的分析。原位檢測(cè)法由于組用改 良的方法EDTA. SDS處理;B組按操作手冊(cè)進(jìn)可在組織原位同時(shí)顯示凋亡細(xì)胞的形態(tài)和分布而被行。廣泛采用[2]。原位檢測(cè)法主要包括:①末端脫氧核3.2操作步驟①切片按常 規(guī)脫蠟至水。②3%苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUIP缺口末端標(biāo)記(TUNEL);②H202 阻斷內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶10 min。③2組切DNA聚合酶1或Klenow大片段介導(dǎo)的原位觖口平移片分別按如下溶液處理15 min(室溫):A組,0.5 mol/(INST)。我們采用Intergen公司生產(chǎn)的原位末端標(biāo)L Tis. CI(pH7.8) 0.2 mL, 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)記試劑盒,對(duì)福爾馬林固定、石蠟包埋的腦組織進(jìn)行0.1 mL, 10% SDS(pH 7.2) 0.5 mL,用去離子水加至TUNEL染色,在操作手冊(cè)和已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行10mL;B組,蛋白酶K20mg/L,以下一切步驟相同。方法改進(jìn),旨在比較酶消化法與EDTA和SDS消化法④PBS漂洗3次,各2 min。⑤平衡緩沖液室溫10的優(yōu)劣,提供研究細(xì)胞凋亡的新技術(shù)。min,輕輕擦去多余液體。⑥加TUNEL反應(yīng)液37C溫材料和方法育1h。⑦阻斷液室溫10 min。 ⑧PBS洗3次,各2min。⑨加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體室溫301標(biāo)本處理鼠腦凍傷組織,常規(guī)10%福爾馬林固定,石蠟包min?！騊BS洗3次,各2min。①DAB顯色5-10min。②陰性對(duì)照片為省去TUNEL反應(yīng)液。埋,5 pm切片。2試劑準(zhǔn)備結(jié)果Intergen公司生產(chǎn)的原位末端標(biāo)記試劑盒;0.51 A 組陽(yáng)性細(xì)胞的核呈棕色著染,核固縮,染色質(zhì)mol/L EDTA( pH 8.0);10% SDS( pH 7.2); 0.5 mol/聚生成致密的團(tuán)協(xié)或地色質(zhì)沿核膜凝集而呈新月L Tris.Cl( pH7.8);蛋白酶K:20 mg/L,用0.01 mol/中國(guó)煤化工~膜包繞的凋亡小體LPBS配制;DAB- -H202 顯色液:DAB用0.1 mol/LTris. Cl(pH 7.6)配成0.4% ,分裝- 20C避光保存,用.H2 B組組織中,陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域累及全部細(xì)胞,含澗CNMHG前稀釋10 倍,并加人H202,終濃度為0.001%。亡及非凋亡者,呈現(xiàn)極為強(qiáng)烈的非特異性染色(圖2,見加頁(yè)I )。[收稿日期] 2001-03-26[修回日期] 2001-04-29(下轉(zhuǎn)第686頁(yè))(上接第668頁(yè))方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)，特別適應(yīng)于福爾馬林固定,石臘包埋的某些難處理的組織。討論[參考文獻(xiàn)]TUNEL染色的結(jié)果常常受諸多因素的影響,如.細(xì)胞的壞死，固定劑的類型,預(yù)處理的方法等。在實(shí)[1] 蘇長(zhǎng)青.細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控及應(yīng)用展望[J].臨床與驗(yàn)過(guò)程中,我們感到蛋白酶K的濃度,作用時(shí)間的長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 1997, 13(i):137- 143.短均是影響TUNEL染色成敗的關(guān)鍵,也是較難掌握[2] Wijsman JH, Jonker R, Keijzer R, et al. A new method to的一環(huán)。有研究表明,蛋白酶K的作用有可能引起delect apoptosis in parafn sctions: in siu end - labeling offragmented DNA[J]. J Histochem Cytochen, 1993 ,41(6):7內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的釋放，造成假陽(yáng)性反應(yīng)3]。所以消化時(shí)間長(zhǎng),非特異染色增多,使一些正常細(xì)胞也中國(guó)煤化工，et al, False positive staining著染,而消化時(shí)間太短,細(xì)胞膜達(dá)不到應(yīng)有的通透性,影響標(biāo)記效果。后來(lái)我們省去蛋白酶K這一步，YHC N M H Gof endogenous Dhaee and im-hibited by diethyl - pyrocarbornate ( DEPC) in liver tsse[J].改用EDTA, SDS緩沖液預(yù)處理,獲得滿意結(jié)果。該Hepatology, 1996, 4(3):268 - 273.