2012 Joumal期 of Qingdao Uni技大學學報自然科學 Vol. 33 No.2 nce and Technology( Natural Science Edition) Apr. 2012文章編號:1672-6987(2012)02-0131-04聚乙醇修飾纖維素酶的性能研究謝娟,李露蘇忠亮,于世濤(青島科技大學化工學院,山東青島266042)摘要:以單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD5KD)為修飾劑,對纖維素酶進行化學修飾,得到修飾纖維素酶(mPEG-Cell)用mpe-Cll降解微晶纖維素,以所得還原糖量為標準(DNS比色法測定),考察各種因素對其催化性能的影響,確定最佳修飾條件。結果表明:在0.1mol·L-pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉的緩沖溶液中,纖維素酶質(zhì)量濃度為5mgmL-1,m(mPEG-ALD):m(酶)=1:1,35℃修飾24h,所得到的 mPEG-Cell具有最佳的催化性能,在50℃下降解微晶纖維素,24h后可得還原糖量達到2.58mg·mL,比同條件下天然酶降解微晶纖維素得到的還原糖量多0.53mgmL-,即多26%關鍵詞:纖維素酶;聚乙二醇丙醛;化學修飾中圖分類號:Q556文獻標志碼:A Chemical Modification of Cellulase with Polyethylene Glycol-aldehyde XIE Juan, LI Lu, SU Zhong-liang, YU Shi-tao (College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042. China) Abstract: The modified cellulase(mPEG-Cell)was obtained by using polyethylene glycol- aldehyde (mPEG-ALD) as modifier. The mPEG-Cell was used to degrade microcrystal- line cellulose and the effects of various factors on its catalytic properties were investiga- ted based on the amount of obtained reducing sugar( by DNS colorimetric analysis) The obtained optimum conditions were using 0. 1M citric acid-sodium citrate as buffer (pH=4.8), concentration of cellulase 5 mg.mL-I m(mPEG-ALD): m(Cellulase)= 1: 1, temperature 35 C and time 24 h. The mPEG-Cell obtained under above condi- tions was used to degrade microcrystalline cellulose at 50 C for 24 h, the amount of re- ducing sugar could reach 2. 58 mg. mL-', which was 0.53 mg. mL-I(26%)more than that obtained by using natural cellulase. Key words: cellulase; polyethylene glycol-aldehyde; chemical modification隨著石化資源的逐漸枯竭,利用可再生資源進而轉(zhuǎn)化成乙醇丙酮、丁醇等燃料和化工原生產(chǎn)生物能源的研究越來越受到國內(nèi)外研究者的料。但是纖維素酶降解纖維素存在酶活性低,關注纖維素作為世界上最豐富的天然可再生資與纖維素可及性差,酶穩(wěn)定性差,條件苛刻等問源,其開發(fā)與利用對解決人類面臨的資源和能源題阻礙了纖維素酶解的進一步發(fā)展,降低了對纖危機具有重要意義。作為纖維素資源化利用有效維素的利用率2,因此對纖維素酶進行化學改性途徑之一的酶解反應,可使纖維素降解為葡萄糖,成為改善其不足的有效手段之一收精日期:2011-10-17基金項目:國家自然科學基金項目(31070520)山東省高等學校科技計劃項目(J09LG16);華南理工大學制漿造紙工程國家重點實駿室項目200912作者簡介:謝娟(1986一),女,碩士研究生,通信聯(lián)系人132青島科技大學學報(自然科學版)第33卷目前國內(nèi)外對纖維素酶化學改性的研究比較1.3實驗方法少有研究者采用聚氧乙烯馬來酸酐聚合物聚1.3.1化學修飾方法乙二醇和順丁烯二酸酐、三聚氯氰活化聚乙二醇在裝有溫度計、冷凝管、轉(zhuǎn)子的50mL三口(PEG)和單甲氧基聚乙二醇(mPEG)焦碳酸二瓶中加入15mL一定pH的檸檬酸檸檬酸鈉緩乙酯和碳二亞胺對纖維素酶進行修飾,以上方?jīng)_溶液。設定一定溫度,待溫度穩(wěn)定后加入相應法存在活化劑毒性大、步驟繁瑣、修飾酶不穩(wěn)定等量酶粉,慢速攪拌溶解。稱取相應量修飾劑缺點。聚乙二醇類修飾劑現(xiàn)多用于藥物修飾,普(mpeg-ald)計時,混合均勻,再加入相應量還遍取得較好效果,與其它聚乙二醇類修飾劑相原劑(NaCNBH33)攪拌溶解,使終濃度保持在20比,單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)對蛋白mmol·ml-反應一定時間,加入3.0g甘氨質(zhì)N末端氨基的選擇性高,反應pH范圍較寬,酸終止反應30min透析過夜,得到修飾酶液對蛋白質(zhì)活性影響較小10,修飾產(chǎn)物均一性較(mpeg-Cell)高,有利于修飾產(chǎn)物的質(zhì)量控制。因此,本研究嘗1.3.2修飾酶活性測定試用單甲氧基聚乙二醇丙醛為修飾劑對酸性纖維按文獻[11]繪制標準葡萄糖曲線,用于換算素酶進行化學修飾,以期提高纖維素酶的穩(wěn)定性吸光度值對應的還原糖量進而提高其催化活性。以降解微晶纖維素為模型取15mL修飾酶液,加入0.30g微晶纖維素反應,明確修飾條件對酶活性的影響。(20gL-1),50℃下降解1h,采用DNS顯色法1實驗部分檢測對應吸光度A值,根據(jù)標準葡萄糖曲線換算成相應還原糖量,衡量不同修飾條件得到的修飾1.1材料與儀器酶降解微晶纖維素的效果,以確定最佳修飾條件。單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)5KD,北京凱正生物工程有限公司;氟基硼氫鈉2結果與討論(NaCNBH3),阿拉丁試劑;微晶纖維素(MCC),2.1修飾溫度對mpeg-cell催化活性的影響成都科隆化工試劑廠;纖維素酶,上海源葉生物科在pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液技公司;透析袋,美國Aikb公司;3,5-二硝基水楊中,酶質(zhì)量濃度3mg·mL-1,m(mPEG-ALD):酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、甘氨酸、EDTA、碳酸氫鈉m(酶)=1:1,修飾24h的條件下,考察不同修等試劑均為分析純。飾溫度對纖維素酶修飾效果的影響,結果見圖1.紫外光度計,UV755B型,上海精密科學儀器有限公司。2.71.2修飾反應原理2.42單甲氧基聚乙二醇丙醛與蛋白質(zhì)分子N端1.8的氨基通過曼尼希反應生成希夫堿,經(jīng)氰基硼氫151.2鈉(NaCNBH3)還原形成比較穩(wěn)定的亞胺連接體。畫09反應式如下:0.60.3005101520253035404505560 mPEG-CH+NH2蛋白質(zhì)冷凝℃圖1溫度對 mPEG Cell催化活性的影響N蛋白質(zhì) Fig.1 Influence of temperature on catalytic activity of mPEG-Cell mPEG-CH +H2ON蛋白質(zhì)由圖1可見,起初隨著溫度的升高,修飾酶活還原性逐漸提高;修飾溫度為35℃時,達到最大值;再 mPEG-CH+NaCNBH3升高溫度,活性反而下降。這是因為纖維素酶的mpech2-nh-蛋白質(zhì)化學本質(zhì)是具有催化活性的蛋白質(zhì),其活性具有最適宜溫度,在此溫度以下,其活性隨溫度的升高第2期謝娟等:聚乙二醇修飾纖維素酶的性能研究133而增強,超過該溫度,酶的構象將發(fā)生改變,其飾效果逐漸平緩,再增加酶用量對增加修飾效果活性減小,當溫度過高,纖維素酶將完全變性,喪不大。因此,適宜的酶用量為5mgmL-1失催化活性。因此,適宜的修飾溫度為35℃2.2修飾體系pH對mpeg-ell催化活性的影3.0響25在酶質(zhì)量濃度為3mg·mL-1,m(mpe82.0ALD):m(酶)=1:1,35℃修飾24h的條件1.5下,考查不同pH的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液對1.00.5纖維素酶修飾效果的影響。在修飾劑類型、相對分子質(zhì)量固定的情況下,修飾反應條件對單修飾c(纖維素mgm產(chǎn)物體外活性保留的影響主要取決于修飾位點。只有修飾位點遠離蛋白質(zhì)活性部位的時候,修飾圖3纖維素酶濃度對 mPEG-Cell催化活性的影響 Fig.3 Influence of cellulase concentration on蛋白才能得到較高的活性保留。不同氨基酸殘 catalytic activity of mPEG-Cell基,其pK,值不同,因而在不同的pH值條件下,其親核性有較大差別因而溶液的pH值影響了2.4mpeg-ald用量對mpeg-cel催化活性的蛋白質(zhì)的修飾位點,是影響修飾產(chǎn)物活性的最主影響要的因素。圖2顯示了pH對 mPEG-Cell催在pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液化活性的影響?？梢钥闯?mEGCell的活性隨中,酶質(zhì)量濃度為5mg·mL-,35℃修飾24h著pH值的增大先增大后減小,在pH=4.時的條件下,考查不同的修飾劑與酶質(zhì)量比對纖維 mPEG-Cll活性最高。在pH=4.8的條件下,素酶修飾效果的影響,結果見圖4由圖4可見,有利于纖維素酶非活性氨基基團的暴露,增加其隨著修飾劑和酶配比逐漸增加,修飾酶效果先增與 mPEG-ALD修飾基團的接觸位點,提高修飾大后減小,在質(zhì)量比1:1時達到最大值?？赡苁嵌?以利于保持和穩(wěn)定 mPEG-Cell的空間構象,由于修飾劑和酶配比的增加,使得酶和修飾劑分使其具有較高的活性12。因此,適宜的修飾pH子的碰撞機會增大,促進了修飾反應的進行,但是為4.8修飾反應消耗活性氨基基團,使酶活性明顯下降,導致修飾酶解效果下降。因此,適宜的配比為272.4212.7261.5251.22.40.92.30.62.20.32.103.24.04.85.66.42.01.9 pH1.81.7圖2反應體系pH對 mPEG-Cell催化活性的影響23 Fig.2 Influence of pH on catalytic activity of mPEG-Cell m(mPEG-ALD): m()圖4修飾劑 mPEG用量對Cell催化活性的影響2.3纖維素mPEG-Cell酶濃度對催化活性的影響 Fig.4 Influence of modi fier dosage on在pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液 catalytic activity of mPEG-Cell中,m(mpeg-ald):m(酶)=1:1,35℃修飾2.5反應mPEG-Cell時間對催活性的影響24h的條件下,考查不同酶質(zhì)量濃度對mEG在pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液Cell催化活性的影響,結果見圖3.由圖3可見,中,m(mPEG-ALD):m(酶)=1:1,酶質(zhì)量濃度起初隨著酶用量的增加, mPEG-Cell催化活性逐為5mg·mL-1,35℃的條件下考查不同反應時漸上升,但是當酶用量超過5mgmL之后修間對 mPEG-Cell催化活性的影響,結果見圖5134青島科技大學學報(自然科學版)第33卷由圖5可見,隨著修飾時間的加長,修飾效果逐漸原糖量比天然酶多0.53mg·mL-1(即多26%)。增強,24h后趨于平緩。隨著反應時間的增加在聚乙二醇鏈的作用下纖維素酶的穩(wěn)定性增強, mPEG-ALD與酶之間的結合量增加促使酶的結同時修飾酶活性中心外露更易與纖維素接觸結合位點外露,增加其構象穩(wěn)定性,mPEGCell催合,使修飾酶催化中心更好的降解纖維素,從而增化效果顯著增加,到24h后, mPEG-ALD與酶之加還原糖的量間的結合度基本達到飽和, mPEG-Cell催化效果變化不明顯。因此,適宜的修飾時間為24h3結論采用單甲氧基聚乙二醇丙醛化學修飾纖維素3.0酶,使得修飾后的纖維素酶mpeG-Cell比天然酶25具有了更好的穩(wěn)定性和催化活性。在0.1mol20L-1pH=4.8的檸檬酸檸檬酸鈉的緩沖溶液中,1.纖維素酶質(zhì)量濃度為5mg·mL-1,m(mEG1.0ALD):m(酶)=1:1,35℃修飾24h,所得到的纖維素酶 mPEG-Cell,在50℃下降解微晶纖維0.5061218243036424854素,24h后得到的還原糖量比同條件下天然酶降解微晶纖維素得到的還原糖量多0.53圖5反應時間對 mPEG-Cell催化活性的影響mgmL-(即多26%)本研究為提高纖維素酶 Fig. 5 Influence of reaction time on的活性和穩(wěn)定性又開辟了一條新的途徑。 catalytic activity of mPEG-Cell參考文獻2.6mpeg-cell與天然酶降解微晶纖維素催化效果比較] Ragauskas J. The path forward for biofuels and biomaterials mPEG-cell(50mL3mg.ml-)與天然酶488.(50mL3mg·mL-1)在50℃下降解140mg微[2]夏梅吳紅平,張玥,等離子液體的制備及其在酶催化反晶纖維素,分別檢測降解1,3,6,9,12,24h后得應中的應用[化學進展,2006,18(12):1660-1671化學進到的還原糖量。[3]張松平王平化學修飾提高酶催化性能的重要工具]生物加工過程,2006,4(1):4-15.[4]劉靖,夏文水焦碳酸二乙酯及碳二亞胺對纖維酶殼聚糖天然酶雙功能酶的修飾作用]食品科學,2008,29(8):4602.1[5]張裕卿,李濱縣修飾纖維素酶催化提取薯費皂素的方法:1.8中國GB1966712ALP]2006[6]張裕卿,李濱縣聚氧乙烯馬來酸酐聚合物改性纖維素酶催11.2化酸水解盾葉薯薯皂苷元的研究[]中草藥,2007,380.9(4):527-532.0.6 [7] Zhang Q. Modification of cellulase and its application to0369121518212427 extraction of diosgenin from Dioscorea xingiberensis C.H. Wright [] Biochemical Engineering Journal, 2009,47 80-86.6 mPEG-Cell與天然酶降解微晶纖維素對比[8]劉霞,丁志山,蔣福升秦乙二醇修飾小分子藥物的研究進 Fig.6 Contrast between MCCs degraded展)[]中國藥理學與毒理學雜志,2010,24(5)380-386. by mPEG-Cell and cellulase醇定點[9]王旭東,李曉暉蛋白藥物的聚乙二醇定點修飾策略與最佳的位點[中國生物工程雜志,2010,30(4):101-109由圖6可見,隨時間的增加在兩種酶催化下10]許培戎隆富乙二醇修飾天花粉蛋白的初步研究中國新藥雜志,2006,15(5):154-348.的微晶纖維素所得到的還原糖量都在逐漸增加,11]張永風,盧紅梅酸性纖維酶酶活力的測定釀酒科最初天然酶和mpE-Cell催化效果基本相當,但技,2007(12):99-101隨著降解時間的增加,mp-Cell的優(yōu)勢逐漸增[12]郭工程[M].北京:科學出版社29138-141強,24h后mpeg-Cell降解微晶纖維素得到的還(責任編輯林琳