第38卷第3期水生生物學(xué)報(bào)Vol. 38. No. 32014年5月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAMay,2014doi:10.7541/2014.69乙醇消耗菌的分離鑒定及其對(duì)基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響葛平平2陳林張維!董慶喆劉天中呂雪峰(1.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島266101;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京100049)摘要:為研究產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻培養(yǎng)液中的乙醇消耗菌污染情況及其對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響,從污染的培養(yǎng)液中分離岀4株乙醇消耗菌,通過16SτDNA、26SτNA序列分析對(duì)分離岀的菌株進(jìn)行鑒定,并研究其乙醇消耗能力及對(duì)基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明,分離岀的4株菌分別為紅酵母( Rhodotorulasp)、季也蒙酵母( Meyerozγ na guilliermondii)、短波單胞菌( Brevundimonas sp.)、微桿菌( Microbacterium sp.)其中乙醇消耗能力最強(qiáng)的是紅酵母,乙醇比消耗速率達(dá)到391g(103scfu-d;其次為季也蒙酵母,乙醇比消耗速率為80.1g(103cfud);短波單胞菌和微桿菌的乙醇比消耗速率遠(yuǎn)低于紅酵母和季也蒙酵母。將分離出的菌株與產(chǎn)乙醇集胞藻共培養(yǎng)d后,污染紅酵母、季也蒙酵母、短波單胞菌、微杄菌的實(shí)驗(yàn)組乙醇產(chǎn)量分別下降了53.8%、23.6%、40.7%、27.3%。4株菌對(duì)基因工程集胞藻的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響,均通過直接消耗乙醇而降低集胞藻的乙醇產(chǎn)量關(guān)鍵詞:乙醇消耗菌;微生物污染;生物乙醇;基因工程集胞藻中圖分類號(hào):Q94922文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1000-3207(2014)03-0487-08生物乙醇是重要的生物液體燃料之一,可作為巴氏醋桿菌、門多薩假單胞菌等都可代謝乙醇611汽油替代品或可再生交通燃料添加劑。應(yīng)用基因其中巴氏醋杄菌的乙醇消耗速率達(dá)到2.3mLd。而工程藍(lán)藻直接利用太陽(yáng)能和CO2一步法生物合成乙在管囊酵母2、釀酒酵母中,乙醇的合成代謝和醇具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),因此成為各界關(guān)注的熱點(diǎn)2S。分解代謝同時(shí)存在。如果污染了這些微生物,也可目前,用于生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻主要有聚球藻能嚴(yán)重影響乙醇產(chǎn)量。目前,關(guān)于微生物污染對(duì)基( Synechococcus sp.PC7942)和集胞藻(Swne-因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響還未有報(bào)道。chocystis sp.PCC6803)3S等,最高乙醇產(chǎn)量達(dá)到本研究從污染的產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻的培養(yǎng)5.5g冮,顯示出太陽(yáng)能生物轉(zhuǎn)化直接合成乙醇的液中分離岀4株乙醇消耗菌,評(píng)價(jià)各菌的乙醇消耗巨大澘力。然而,有研究表明基因工程集胞藻的乙能力以及對(duì)基因工程集胞藻的生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量的影醇產(chǎn)量很不穩(wěn)定,在培養(yǎng)后期培養(yǎng)液中的乙醇濃度響,并采用形態(tài)觀察和基因序列分析手段鑒定污染急劇下降5,因此研究確定影響乙醇產(chǎn)量穩(wěn)定性菌的種類,以期能為藍(lán)藻乙醇的培養(yǎng)工藝及污染控的因素對(duì)生產(chǎn)工藝的建立有重要意義制提供理論參考。在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn),基因工程集胞藻在培養(yǎng)過程中易發(fā)生食藻生物和微生物污染,尤其是材料與方法在放大培養(yǎng)階段這種污染尤為嚴(yán)重。食藻生物會(huì)昋1.1藻種及培養(yǎng)方法食藻細(xì)胞,使生物量迅速下降,從而降低乙醇產(chǎn)量。產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻 Synechocystis sp.PCC自然界中存在著多種能利用乙醇的微生物,例如醋6803 Syn-ZG25,由中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過酸菌、面包酵母、嗜有機(jī)甲基桿菌、枯草芽孢桿菌、程研究所構(gòu)建。集胞藻在250nL三角搖瓶(裝液稿日期:2013-04-10;修訂日期:2013-1225基金項(xiàng)目:國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(863)(2012AA052103)資助作者簡(jiǎn)介:葛平平(1988—),女,河北保定人;碩士研究生;主要從事生物化工研究。E-mail: gepp(@qibebt通信作者:陳林,Tel:0532-80662737;E-mal:chenlin(@qibebtac.cn488水生生物學(xué)報(bào)38卷量100mL)或直徑30mm的氣泡柱式光反應(yīng)器(裝液提取的基因組DNA為模板,用高保真aq酶進(jìn)行量200mL)中培養(yǎng),通入含5%CO2的空氣混合氣,PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95℃5min;94℃30s,55℃通氣速率(10±2)Lh,光強(qiáng)100μmol(m2s,培養(yǎng)溫lmin,72℃lmin,34個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR產(chǎn)物度(30±2)℃。培養(yǎng)基為BGI!培養(yǎng)基,其中含用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。目的基因片段克20mgL壯觀霉素( Spectinomycin, Sigma)14隆:將PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒( Cycle-Pure Ki1.2乙醇消耗菌的分離純化美國(guó) Omega公司進(jìn)行純化,產(chǎn)物與pMDl8-TV培養(yǎng)基(1)初篩培養(yǎng)基:牛肉膏3gL,蛋白胨tor連接后轉(zhuǎn)化到E. coli dh5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布10g,NaCl5gL,乙醇2g/L,壯觀霉素20mg,到Amp抗性平板上培養(yǎng)9-16h挑取3個(gè)單克隆瓊脂15g/;(2)復(fù)篩培養(yǎng)基: BGll培養(yǎng)基中添加擴(kuò)繁后送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序,將測(cè)2g/L的乙醇,20mgL的壯觀霉素,15gL的瓊脂;序結(jié)果與 Gen Bank中已有序列進(jìn)行比對(duì)和同源性(3)純化培養(yǎng)基:牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/,NaCl分析5g冮L(zhǎng),乙醇2g,瓊脂15g/L;(4)發(fā)酵培養(yǎng)基:牛1.4乙醇消耗菌的生長(zhǎng)及乙醇消耗速率測(cè)定肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5gL,乙醇23g/L,乙醇消耗菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定挑取純化后的單壯觀霉素20mgL菌涪接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,取適量培養(yǎng)液乙醇消耗菌的分離及純化(1)初篩:集胞藻在在60m下測(cè)定其吸光度(A6),然后稀釋至A6o0°氣泡柱式反應(yīng)器中通氣培養(yǎng)12—14d后,經(jīng)無(wú)菌檢0.05,按10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30℃、測(cè)為陽(yáng)性,作為染菌藻液。取染菌的Syn-zG25藻液,180r/min搖床中培養(yǎng),定時(shí)取樣測(cè)定菌液A6。每經(jīng)梯度稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基平板上,置于30℃實(shí)驗(yàn)組設(shè)2個(gè)平行,對(duì)照組中接種等體積的無(wú)菌培生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待平板上有單菌落長(zhǎng)岀后,依養(yǎng)液。據(jù)菌落形態(tài)和顯微觀察結(jié)果,分別挑取多株菌落菌液細(xì)胞濃度的確定取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液形態(tài)和顯微形態(tài)相同的單菌落培養(yǎng)。(2)復(fù)篩:將初測(cè)定其A6。梯度稀釋后采用平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定篩得到的各菌株分別在復(fù)篩培養(yǎng)基平板上劃線或細(xì)胞濃度,計(jì)數(shù)時(shí)僅選取菌落數(shù)在20--200的平板,涂布,平板放置于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7—10d,每株菌每濃度做3個(gè)平行。用 Origin擬合出菌液A60長(zhǎng)出的菌株在純化培養(yǎng)基平板上經(jīng)多次傳代后作與細(xì)胞濃度D( Cell density, cfu/mL)的關(guān)系,結(jié)果列為復(fù)篩菌株入表11.3乙醇消耗菌的鑒定菌落及個(gè)體形態(tài)觀察在純化培養(yǎng)基平板上,表1各菌菌液A6與其細(xì)胞濃度D的關(guān)系Tab, I Relationship between A660 and cell density利用目測(cè)法觀察乙醇消耗菌的菌落形態(tài)。挑取純化菌株編號(hào)關(guān)系式擬合系數(shù)后的單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24h后取適 Strain numberEquationGRI30.994量菌液低速離心,收集菌體,依次使用2.5%戊二醛D=1.179×107·A6a+68.12GTID=2.327×100·A60+62.750.990溶液和1%鋨酸固定,經(jīng)乙醇梯度脫水后噴金處理,D=5.641×10·A6+16.67然后用冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800型,日本GY22D=2.036×10°A60+97540.994Hitachi公司)進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察。乙醇消耗菌的16 RdNA及26 S rDNA序列測(cè)定乙醇消耗速率的測(cè)定將培養(yǎng)1824h后的各根據(jù)各菌的菌落和個(gè)體形態(tài)分析,4種菌可能分屬細(xì)菌接種到裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中,根據(jù)菌和酵母兩大類,因此同時(shí)進(jìn)行了16SrNA及26S擬合得到的公式將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋,使其初始細(xì)胞rDNA序列測(cè)定。引物設(shè)計(jì):分別選用16 S TDNA通濃度維持在10 cfu/mL,將錐形瓶置于30℃、180rmin用引物對(duì)27F(5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3)搖床培養(yǎng)。以不接菌實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)21492R(5 TACCTTGTTACGACTT-3)以及26 S TDNA個(gè)平行。每6h取樣測(cè)定細(xì)胞濃度,并用生物傳感分通用引物對(duì)NL1(5' GCATATCAATAAGCGGAGGA析儀(SBA-40D,山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定培AAAG-3^)NL4(5′ GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)。養(yǎng)液中乙醇濃度4PCR反應(yīng)體系與條件:PCR反應(yīng)采用50μL體系,以乙醇的比消耗速率按公式(1)計(jì)箅葛平平等:乙醇消耗菌的分離鑒定及其對(duì)基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響和采用平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定菌的細(xì)胞密度=×10(1)(t2-1)·D16基因工程集胞藻生長(zhǎng)的測(cè)定其中,Q為比消耗速率,單位為g(cfud),C表示4考慮到乙醇消耗菌在730nm處也有光吸收,因此以葉綠素a的含量計(jì)量集胞藻的生物量。取1mL時(shí)刻的乙醇濃度,單位為gL;D為到t2時(shí)間段內(nèi)的平均細(xì)胞濃度,按照公式(2)計(jì)算:藻液,離心收集藻細(xì)胞,再加入ImL甲醇重懸浸泡60℃水浴避光提取30min,離心取上清液測(cè)定665nmD=2+D,(2)下的吸光度,計(jì)算葉綠素a含量1.7統(tǒng)計(jì)分析1.5乙醇消耗菌對(duì)基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析( One-Way ANOVA無(wú)菌藻種在三角瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,接方法,使用SPSs10軟件。種于氣泡柱式光生物反應(yīng)器(裝液量200m)中,每24取樣,測(cè)定藻液的葉綠素a含量及乙醇濃度。自2結(jié)果培養(yǎng)第4天始,向各實(shí)驗(yàn)組中分別接種稀釋至一定21乙醇消耗菌的分離及鑒定細(xì)胞濃度的菌液2mL,使各乙醇消耗菌細(xì)胞終濃度從污染的基因工程集胞藻培養(yǎng)液中,經(jīng)過初篩、為0° cfu/mL,對(duì)照組加入2mL無(wú)菌水;每組實(shí)驗(yàn)多次純化及復(fù)篩、得到4株具有乙醇消耗能力的菌,設(shè)2個(gè)平行。每24h取樣,測(cè)定藻液的葉綠素a含分別編號(hào)為GRl3、GWl3、GT17、GY22四株菌分量及乙醇濃度。對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組毎48h作無(wú)菌檢測(cè)別在30℃恒溫箱中培養(yǎng)5d后的菌落特征列入表2。表2四株乙醇消耗菌的菌落特征Tab 2 Colony characteristics of the four ethanol consuming microorganisms菌株編號(hào)菌落直徑菌落顏色菌落形狀邊緣表面正反面顏色差別Strain numDiameter of colony(mm) Colony color Colony shapeface Color difference of both sideGRI紅色圓形,帽子狀整齊無(wú)GW13純白色圓形整齊無(wú)乳白色圓形整齊光滑無(wú)GY223-4橘黃色圓形,帽子狀整齊無(wú)掃描電鏡觀察顯示(圖1),GR13菌的細(xì)胞為球形或橢球形細(xì)胞直徑約24m;GW13菌的細(xì)胞呈卵球形,長(zhǎng)度約1.53μum,GT17菌的細(xì)胞呈桿狀,直徑約為0.3gm,長(zhǎng)度約1-2umGY22菌的細(xì)胞呈短桿狀,直徑【R1約0.30.4μm,長(zhǎng)度約0.81.2μm。綜合考慮四株菌的菌落和個(gè)體形態(tài),初步認(rèn)為GRl3和GW13屬于酵母菌,GT17和GY22屬于細(xì)菌。隨后分別提取各菌的DNA,并進(jìn)行16 S rDNA及26SrDNA序列測(cè)定,將測(cè)得的序列在 Genbank blast進(jìn)行同源性圖1四株乙醇消耗菌的個(gè)體形態(tài)比對(duì)(表3)ig. I The morphology of the four ethane490水生生物學(xué)報(bào)38卷表3四株乙醇消耗菌的同源性比對(duì)結(jié)果Tab 3 BLAST results of the four ethanol consuming microorganisms菌株編號(hào)序列長(zhǎng)度生物名同源性覆蓋率StMicroorganismIdentity(%) Cover(%)Rhodotorula mucilaginosaGRI3Rhodotorula sp. M26Rhodotorula sp. MARY 160Meyerozyma guilliermondii strain KAML05GW13570Meyerozyma guilliermondii strain KAMLo3Brevundimonas diminuta atcc 11568GTI1385Brevundimonas terrae strain KSL-145Mycoplana bullata strain IAM 1315397.9100Microbacterium hominis strain DSM 12509l00GY221444Microbacterium trichothecenolvticum strain DSM 860Microbacterium testaceum strain DSM 2016698.1l00從比對(duì)結(jié)果可以看出,菌株GRI3、GT174株菌的初始接種濃度均為10°cfu/mL,在此GW13、GY22分別與黏質(zhì)紅酵母( Rhodotorula muci--條件下,發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇濃度變化見圖3。其中l(wèi)aginosa)、缺陷短波單胞菌( Brevundimonas diminuta對(duì)照組由于自然揮發(fā)的原因,乙醇濃度略有下降A(chǔ)TcC1568)季也蒙酵母( Meyer- ma guilliermondii在扣除因自然揮發(fā)而消耗的乙醇后,除了GY22外,strain Kaml05)人型微桿菌( Microbacterium homini其他三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的乙醇濃度均顯著下降(P