化學(xué)與生物工程2015,V,32№.07Www.hxyswgc.comChemistry Bioengineeringdoi:10.3969/j.issn.l672-5425.2015.07.018燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機酸的HPLC分析及應(yīng)用效果鄭偉,楊維旭,李冬梅,譚洪波,劉春景,孔令新(吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司,吉林吉林132101)摘要:在燃料乙醇生產(chǎn)過程中,采用高效液相色譜(HPLC)對低聚糖及有機酸進行監(jiān)測;探討了HPLC法的跟蹤效果,并對有問題的發(fā)酵結(jié)果進行了分析。結(jié)果衷明:對發(fā)酵液開展HPLC檢測,在生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及決策上效果理想,可滿足過程監(jiān)控的需求。關(guān)鍵詞:燃料乙醇;低聚糖;有機酸;發(fā)酵液;糖化酶;酵母;染菌中圖分類號:TQ9230657.72文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1672-5425(2015)07-0067-04在燃料乙醇的生產(chǎn)中,成熟的發(fā)酵技術(shù)就是嚴(yán)格菌對酵母產(chǎn)生的競爭性抑制上,效果較為理想,為生產(chǎn)的過程控制,體現(xiàn)的是從低聚糖到發(fā)酵產(chǎn)物并形成有工藝的優(yōu)化及決策提供了更為科學(xué)的數(shù)據(jù)依據(jù)。機酸的過程,而過程控制的實現(xiàn),需要對過程參數(shù)進行合理選取和有效監(jiān)測。其中低聚糖及有機酸的監(jiān)測是1實驗掌握生產(chǎn)中通過酵母的發(fā)酵將糖轉(zhuǎn)化為乙醇的必備手1.1試劑及儀器段;組分能夠被及時準(zhǔn)確的檢測,可充分表達發(fā)酵工麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸鋰、丙三醇、醋酸序運行狀態(tài),對避免染菌、使乙醇收率最大化起到指導(dǎo)鈉、無水硫酸鈉、乙醇,均為色譜純, Sigma Aldrich化性作用。學(xué)公司2。在燃料乙醇的生產(chǎn)上,國內(nèi)仍沿續(xù)著常規(guī)的化學(xué)Lexar LC10系統(tǒng), Perkin Elmer公司,軟件方法監(jiān)測工藝過程,對發(fā)酵工藝指標(biāo)還局限在還原糖、 Chromera Manager Ver4.1.0.6386, phenomenex揮發(fā)酸殘總糖的層面上,而國外(如美國 Corn Plus REZEXM ROA Organic Acid色譜柱(300mm×7.8及 Renew Energy燃料乙醇公司)已采用高效液相色mm,8gm),AJO4490預(yù)處理柱(50mm×7.8mm,譜(HPLC)法分析,是對發(fā)酵過程更為精細(xì)化和最為8m)。直接的分析方法;通過測定低聚糖[DP(低聚糖4-101.2方法糖)、麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖]、有機酸、醇(乳酸和丙1.2.1低聚糖及有機酸標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度三醇、醋酸)、發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物(乙醇)等含量,可非常直觀分別準(zhǔn)確稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品置于100mL容量瓶地表達工藝中各罐的發(fā)酵狀況,最終確定工藝參數(shù)。中,用流動相(0.0025mol·L-1H2SO4)溶解并定容,這些精細(xì)化指標(biāo)對工藝的運行條件更為具體實用,這配制成標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液;混合標(biāo)準(zhǔn)不僅僅是檢測儀器或分析方法的提升,更是對生產(chǎn)品溶液濃度見表1。藝管理的促進。1.2.2樣品預(yù)處理吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司質(zhì)檢中心自2004年為避免酶解及發(fā)酵的持續(xù)進行,需檢測發(fā)酵醪液起,參照 Cerestar、 Corn Plus及 Renew Energy公司的的初始pH值。用65%H2SO、將醪液pH值調(diào)至1.0檢測方法,對發(fā)酵醪液開展了HPLC的全程監(jiān)測,在1.5,4000r·min-1離心5min。取上清液50mL,合理控制糖化酶用量、發(fā)酵溫度,避免酵母抑制以及染定容到100mL,0.22pm水系濾頭過濾至色譜樣品瓶收稿日期:2015-0305作者簡介:鄭偉(1965-),女,吉林省吉林市人,碩士,高級工程師,主要從事燃料t H中國煤化工wjfa@cnpc.comcn;通訊作者:楊維旭,高級工程師,Emal:yangwx.jfa@cnpc.com.cnCNMHG鄭偉等:燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機酸的HPLC分析及應(yīng)用效果/2015正鼻7用表1低聚糖及有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.2.3色譜條件濃度/g·(100mL)-1]流動相為0.0025mol·LH2SO4,流速0.6mLTab. 1 Concentration of oligosaccharides and organic·min1,柱箱溫度65℃,RID溫度50C,進樣量20acid mixed standard solutionL,運行時間25min樣品名稱濃度樣品名稱濃度1.2.4低聚糖及有機酸定性、定量方法無水硫酸鈉乳酸鋰先以保留時間、樣品加標(biāo)來進行定性;再以峰面積麥芽三糖丙三醇外標(biāo)法定量。麥芽糖醋酸鈉葡萄糖乙醇2結(jié)果與討論注:定量時將無水硫酸鈉的量乘以0.8即為DP的量。2.1低聚糖及有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和線性范中,自動進樣,進行HPLC分析。圍(表2)表2混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回歸方程和線性范圍Tab 2Regression equation and linear range of mixed standard solution回歸方程相關(guān)系數(shù)線性范圍樣品名稱截距Y斜率Xg·(100mL)-11.88384e+0023.109764e+0030.9996162.732~16.620麥芽三糖3.20229e+0003.768599e+0030.9972520.476~0.953麥芽糖5.727923e+0012.85678le+0030.9997691.075~5.957葡萄糖1.097297e+0022.935999e+0030.9999303.35~10.93乳酸2.554407e+0012.073031e+0030.9958180.10~0.583.982963e+0012.277596e+0030.9996910.52~1.56醋酸4.502039e+0011.629429e+0030.996860乙醇3.001877e+00l1.225771e+0030.9999982.05~15.502.2燃料乙醇生產(chǎn)中發(fā)酵液的液相色譜(圖1)聯(lián)合作用下異構(gòu)生成。發(fā)酵液中重點關(guān)注的組分DP(低聚糖4-10糖,合峰)、麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸、丙三醇、醋酸、乙醇2.3HPLC對發(fā)酵過程的跟蹤應(yīng)用首先,在發(fā)酵早期監(jiān)控DP分布,可讓工藝人員0.75了解淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的程度,并確定投0.502MA八酵母的具體時間。其次,后面出峰的組分(乳酸、丙三醇、醋酸和乙醇)代表在發(fā)酵期間所產(chǎn)生的有機酸和乙0.02.55.07.510.012.515.017.520022.5醇。監(jiān)控這些組分,可便于工藝人員確認(rèn)發(fā)酵終點;并圖1發(fā)酵液的HPLC圖譜指導(dǎo)工藝人員添加嚴(yán)格控制的限量抗生素,來抑制細(xì)Fig. 1 HPLC Spectrum of fermentation liquid菌的污染,及防止其它可能導(dǎo)致抑制乙醇生產(chǎn)的情況由圖1、表2可知,發(fā)酵液中各組分分離度較好,發(fā)生含量線性范圍涵蓋合理,相關(guān)性較高滿足方法的適用2.3.1理想的發(fā)酵狀態(tài)性要求。利用HPLC監(jiān)測發(fā)酵過程,理想的發(fā)酵結(jié)果見表在對發(fā)酵液進行HPLC分析時,組分中會分離出其它的發(fā)酵產(chǎn)物;其中,阿拉伯糖、丁二酸、甲醇系發(fā)酵在進行HPLC分析的同時,將HPIC的分析結(jié)果過程中正常產(chǎn)物,對發(fā)酵影響不大;果糖系液化過程中同發(fā)酵溫度H中國煤化工奉相結(jié)合,對燃料淀粉鏈還原端的一些葡萄糖單元在高pH值和高溫的乙醇生產(chǎn)具CNMHG鄭偉等:燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機酸的HPLC分析及應(yīng)用效果/2015正■7睏表3理想的發(fā)酵結(jié)果Tab. 3Data of ideal fermentation發(fā)酵時間溫度濃度/g·(100mL)1乙醇體積分?jǐn)?shù)hC“胞數(shù)出芽率DP麥芽三糖麥芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇2080.8075.8760.0430.0141.863.42360.5748.4590.0720.0143.143.892233.52146.460.1801.196.1140.0761.280.0197.4833.42490.2493.7240.0921.330.03010.380.1320.450.0930.03212.9015.9933.30.740.0900.420.1110.0951.400.04313.4416.662.3.2有問題的發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)果見表4~7。利用HPLC對發(fā)酵過程進行跟蹤分析,有問題的1)糖化酶用量表4有問題的發(fā)酵結(jié)果1Tab 4Problem fermentation data 1發(fā)酵時間溫度濃度/[g·(100mL)-1乙醇體積分?jǐn)?shù)麥芽三糖麥芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇%5.8760.0430.01433.2152,850.0890.0251.912.372233.312.941.843.031.420.0950.0313.844.76分析表4結(jié)果可知,發(fā)酵過程存在的問題為較高是發(fā)酵過程中糖化酶添加量不足。因此,在發(fā)酵罐中的DP值、較高的葡萄糖值、乙醇產(chǎn)率低。原因可能應(yīng)再添加一些糖化酶。表5有問題的發(fā)酵結(jié)果2Tab. 5Problem fermentation data 2發(fā)酵時間出芽率濃度/[g·(100mL)1乙醇體積分?jǐn)?shù)活細(xì)胞數(shù)%DP麥芽三糖麥芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇937.720.8075.425.8760.0430.670.0141.862.300.71013.5700.0721.020.0144.480.3801.8910.8400.1901.410.0247.599.4132l85831.230.1900.806.8900.3401.500.0419.1011.28分析表5結(jié)果可知,發(fā)酵過程存在的問題為較快多,較高的葡萄糖濃度造成對酵母的滲透壓過高。因的DP水解速度、早期有較高的葡萄糖數(shù)值、較高的此,應(yīng)減少糖化酶的用量。丙三醇和有機酸數(shù)值。原因可能是添加的糖化酶過2)發(fā)酵溫度有問題的發(fā)酵結(jié)果Tab. 6Problem fermentation data 3發(fā)酵時間溫度C胞數(shù)出芽率濃度g·(100mL)-1乙醇體積分?jǐn)?shù)%DP麥芽三糖芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇32.22017.726.9120.043790.0141.121.768.940.5443.799.5600.0970.980.0202.643.2735.62140,1701.19H8.360中國煤化工7,18CNMHG鄭偉等:燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機酸的HPLC分析及應(yīng)用效果/2015年鼻7廂分析表6結(jié)果可知,發(fā)酵過程存在的問題為較高率和活細(xì)胞數(shù)。原因可能是發(fā)酵溫度過高造成酵母生的發(fā)酵溫度、較慢的酵母利用葡萄糖的速率、較高的丙長受抑制。因此,應(yīng)采用較低的發(fā)酵溫度32~33℃。三醇數(shù)值、低的乙醇產(chǎn)率、較高的有機酸、較低的出芽3)染菌表7有問題的發(fā)酵結(jié)果4Tab. 7Problem fermentation data 4發(fā)酵時間出芽率濃度/[g·(100mL)-1]乙醇體積分?jǐn)?shù)活細(xì)胞數(shù)h麥芽三糖麥芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇2087.720.8075.425.8760.2500.670.0291.862.300.5743.798.4590.1200.910.0192.842140.1801.196.9100.1701.440.0355.60199882.280.2490.434.9600.3901.550.0487.949.85分析表7結(jié)果可知,發(fā)酵過程存在的問題為較慢淀粉在整個乙醇生產(chǎn)工藝的水解程度和水解產(chǎn)物特的葡萄糖利用效率、較高的有機酸、較低的乙醇產(chǎn)率、性,能更直觀地表達發(fā)酵過程中各罐的發(fā)酵狀況;為掌較低的出芽率和活細(xì)胞數(shù)。原因可能是染菌造成對酵握酶作用底物效果,酵母的充分利用等生產(chǎn)運行狀態(tài),母的競爭性抑制。因此,在酵母培養(yǎng)和發(fā)酵罐中應(yīng)添確定合理工藝參數(shù),避免罐內(nèi)物料染菌,提高轉(zhuǎn)化率,加抑菌劑可以起到很好作用效果,是生產(chǎn)、工藝管理者及操作者3結(jié)語理想的控制資料和數(shù)據(jù),具有重要的指導(dǎo)價值和現(xiàn)實意義1)通過HPLC法對燃料乙醇生產(chǎn)中的發(fā)酵液進參考文獻:行低聚糖及有機酸的檢測分析,是過程控制的最為有1 MCGINLEY M,MOTT. Ethanol Production Monitoring Using效的手段,其多組分分離的方法直觀、簡便、快速、準(zhǔn)lon Exclusion hplc.2]楊毅,李崎,陳蘊,等.反相高效液相色譜法(RP·HPLC)測定啤酒確;為生產(chǎn)裝置平穩(wěn)運行提供了準(zhǔn)確數(shù)據(jù)信息,實現(xiàn)了中有機酸[門].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(8):6-12.過程質(zhì)量管理及控制的動態(tài)分析。[3]劉文信.HPLC在酒精發(fā)酵醪液檢測中的應(yīng)用[J].化學(xué)工程師2)依據(jù)HPLC檢測發(fā)酵不同時間段數(shù)據(jù)的累積013,(2):28-30可有效掌握液化糖化工序、酶作用底物的效果,了解HPLC Analysis and Application Effect of Oligosaccharides andOrganic Acid in the production of Fuel ethanoZHENG Wei, YANG Wei-xu, LI Dong-mei, TAN Hong-bo, LIU Chun-jing, KONG Ling-xin(ilin Fuel Alcohol Com pany Limited, Jilin 132101, China)Abstract: The content of oligosaccharide and organic acid in the production process of fuel ethanol was de-termined by high performance liquid chromatography(HPLC). The tracking effect of hPlc was discussed, andthe problem of fermentation data were analyzed. The results showed that, HPLC analysis of fermentation liquidwas ideal in the production process optimization and decision making, and met the requirements of process moniKeywords: fuel ethanol; oligosaccharides; organic acid; fermentation liquid; saccharifying enzyme; yeast: bac-terial contamination中國煤化工CNMHG