Vol. 24高等學?；瘜W學報No 82003年8月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES1495~1498合成分枝型聚乙二醇的簡便新方法何明磊,蘇志國(中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京100080)摘要以賴氨酸和mPEG500為起始物,利用多肽合成中常用的保護、縮合和脫保護等方法合成了在生物醫(yī)學領域中具有重要應用價值的分枝型聚乙二醇.用該方法形成的分枝型PEG在有機相中以縮合反應的方式一步完成,反應條件溫和,且有較高的產率(61%).各步產物的表征都與其結構一致.最終產物分枝型PEG的HNMR的表征結果與其結構吻合關鍵詞新方法;合成;分枝型聚乙二醇中圖分類號O633.1文獻標識碼A文章編號0251-0790(2003)08-1495-04隨著生物技術的飛速發(fā)展,越來越多的具有生物活性的多肽、蛋白質和酶被用于臨床治療.但是這些生物大分子在直接用于人體時還存在快速排除、被人體中的蛋白酶降解和免疫反應等缺陷.因此,蛋白質的化學修飾特別是醫(yī)用蛋白質的化學修飾仍然是一個熱門的研究領域.許多天然大分子及合成的高分子已經和正在被用于蛋白質的化學修飾.由于聚乙二醇(PEG)對人體無毒并且具有生物相容性,因此被廣泛應用于修飾蛋白質、多肽及酶甚至一些小分子藥物PEG是一種水溶性聚合物,當它與蛋白質分子(多肽,酶)以共價鍵結合后,能夠降低這些活性分子的上述缺陷,甚至加強其潛在用途.例如,PEG與腺苷脫氨酶的結合物(PEG- adenosine deaminase)已經獲得FDA(美國食品和藥物管理局)的批準,PEG修飾的細胞因子( PEG-modified Cytokines)已經制備出來,PEG修飾的巨噬細胞集落刺激因子(PEG- modified granulocyte- macrophage colonystimulating factor)甚至表現(xiàn)出了分化的兩種生物學性質.人們發(fā)現(xiàn),用PEG修飾生物活性分子,其修飾效果與所用的PEG的分子量及一定的修飾度有關般PEG的分子量越大,修飾度越高,結合物的抗原性越小,而結合物的體內排除時間越長,但結合物的生物活性也隨之減小.結合物生物活性的下降主要是由過度修飾引起的.為了解決這個問題,人們合成了分枝型聚乙二醇( BranchedPEG).用 Branched PEg修飾蛋白質等生物活性分子,可以在反應位點給定的情況下增加結合的PEG量.人們在研究中還發(fā)現(xiàn),由于分枝型聚乙二醇的特殊結構,當它結合在蛋白質分子的表面后,其較大的位阻大大降低了結合物的抗原性,更有效地阻止了體內蛋白酶的水解.因此在修飾度相同的情況下,分枝型聚乙二醇的修飾效果優(yōu)于線型聚乙二醇( Linear peg)現(xiàn)有的分枝型聚乙二醇的合成方法存在所用化學試劑昂貴,產率低,反應條件難于控制等缺點,限制了其研究和實際應用.本文開發(fā)了一種新的簡便的分枝型聚乙二醇的合成路線,取得了較好的結果1實驗部分1.I試劑與儀器單甲氧基聚乙二醇(mPEG50,M=5000),二環(huán)已基碳二亞胺(DCC),N-羥基琥珀酰亞胺NHS)購自瑞典 Fluka公司.其它化學試劑均為分析純. Bio gel P100(100-200mesh)購自美國BioRad公司.dMX300型核磁共振儀(300MHz, Bruker inc)公司, FTIR Vector22型紅外光譜儀( Bruker公司), Waters Series凝膠滲透色譜儀(Pump515, RI detector2410, Column ht3-5-6), BIFLEXⅢ型高等學?；瘜W學報VoL 24質譜儀( Bruker公司).1.2賴氨酸乙酯鹽酸鹽的制備向500mL三角瓶中加入300mL無水乙醇和30g賴氨酸.在攪拌下將干燥的氯化氣體通入上述懸濁液至飽和.賴氨酸逐漸溶解,加熱回流后溶液透明.將此溶液密閉靜置12h后,減壓蒸岀氯化氫和過量的乙醇.溶液經濃縮后加入冷的無水乙醚中,此時有黃色晶體析岀,洗滌并在真空下干燥,得42g產物1.反應式如下NH2(CH2),CH(COOH)-NH2 +C H,OH +HCl()HCINH2-(CH2)CH(COOC, H; )-NH, HCI(1)對產物1進行紅外光譜測定1.3羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇的制備根據(jù)文獻[6]的方法制備產物2.反應式如下:MnomPEG--OHmPEg--CHO→ mPEG COOH(2)產物2的IR光譜在 FTIR Vector22紅外光譜儀上測定(KBr壓片)1.4分枝型PEG的合成將254mg( I mmol)的賴氨酸乙酯鹽酸鹽加入到裝有25mL.二氯甲烷(干燥)的50mL.三角瓶中然后將4mmol的三乙胺(TEA)、2mmol(10g)的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇以及過量的DCC和NHS依次加入到溶液中.在磁力攪拌下于室溫反應24h,過濾除去反應中生成的二環(huán)己基脲(DCU),然后將溶液慢慢地傾λ強烈攪拌下的150mL冷乙醚中,此時有乳白色沉淀生成.將沉淀濾岀并真空干燥,得9.5g乳白色粉末狀物質,將其溶于50mL1mol/ L NaOH中,再加入10 g NaCl,于室溫下攪拌反應1h,用6mol/L鹽酸調節(jié)pH值為3.用二氯甲烷萃取(50mL×3),合并有機相,用硫酸鎂干燥后將溶液減壓濃縮至5σmL.將此濃縮液慢慢傾λ強烈攪拌下的3θ0m冷乙醚中,有乳白色沉淀析岀,濾出沉淀并真空干燥得9.0g產物3.反應式如下:mPEG-COOH+ HCINH2(CH,).CH(COOC H;)-NH2 HCIDCC. NHSmPEG-CONH-(CH2),CH(COOC, H, )-NHOC-mPEG OH.HmPEG CONH(CH2)小CH--COOH (4)mPEG CONH將產物3進行MALDⅠ-TOF質譜測定和GPC測定(產物3是產物2和4的混合物)1.5凝膠過濾( Biogel p100)純化分枝型PEG及其HNMR表征將0.4g產物3溶解在2mL蒸餾水中,在裝有 Biogel I100(100-200mesh)的色譜柱(5cm×50m)上,分2次上樣(毎次1nL),以水為洗脫液進行凝膠過濾分離,以毎管10mL進行分步收集.將相對于分枝型聚乙二醇旳組分(通過碘顯色反應鑒定)合并,用二氯甲烷萃取,乙醚沉淀,最后用乙醇結晶,得到0.24g乳白色產物4.在dMX300型核磁共振儀(300MHz, Bruker公司)上,以CDCl3為溶劑,TMS為內標測定產物4的HNMR譜2結果與討論產物1的紅外光譜如圖1(A)所示.在1740.9和1218.9cm處出現(xiàn)了較強的羰基吸收峰,這是典型的飽和羧酸烷基酯C-O的特征吸收;而3422.2cm-處的—N-H伸縮振動峰相對較弱,這是由于形成鹽酸鹽所致.紅外光譜說明產物1為賴氨酸乙酯鹽酸鹽.產物2的紅外光譜如圖1(B)所示.在1745.5cm-處出現(xiàn)較弱的羰基吸收峰,說明原料單甲氧基聚乙二醇中的羥甲基被氧化成為羧基分枝型PEG的合成實際上包括兩個反應步驟.首先在有機相(CH2Cl2中實現(xiàn)了羧甲基化mPEGNo 8何明磊等:合成分枝型聚乙二醇的簡便新方法14971.2}(A)1.604000300020002000p/cm-lFig. I IR Spectra of product I(A)and product 2(B)行了 MALDO-TOF質譜分析和GPC分析,結果見圖2. MALDI-TOF的結果表明,產物3包括兩種組分:一種組分是平均分子量為5089的聚合物,另一種組分是平均分子量為10263的聚合物.平均分子量為10263的聚合物為目的產物4.而平均分子量為5089的組分是未反應的原料羧甲基化mPEG.GPC結果顯示了連在一起的2個峰.一個峰的分子量最高值為12054,另一個峰的分子量最高值為7088.由于GPC測定使用PS(聚苯乙烯)為標準物,因此12054和峰7088分別相對與MALDⅠ-TOF質譜分析中的峰10263和峰5089.根據(jù)GPC測定中的峰面積積分計算,平均分子量為10263的組分占混合物總量的61%2500}(A(B)50891500l000060001000014000t/minFig 2 MALDI-TOF spectrum(A)and GPC spectrum(B) of product 3產物4的HNMR,δ:1.2~1.4(多重峰,6H,賴氨酸的_CH2-3,4,5);1.6(多重峰,2H,賴氨酸的_CH2-6);3.14(單峰,3H,mPEG的末端甲氧基);3.49(單峰,mPEG骨架_CH2-);4.05(三重峰,2H,與羰基相連的_CH2—);7.11(三重峰,1,賴氨酸的ε-NH-);7.37(雙峰,1H賴氨酸的αNH—).與已報道的該結構的HNMR的指紋圖譜相當吻合,特別是由于兩個不同的與羰基聯(lián)接的NH質子的存在,第一個與羰基聯(lián)接的—NH—質子由于還與CH,—相連而顯示出三重峰,第二個與羰基聯(lián)接的—NH—質子由于還與賴氨酸的α-CH相連而顯示岀雙峰.這一結果表明,平均分子量為10263的組分就是目的產物分枝型PEG現(xiàn)有的合成分枝型PEG的方法一般是通過賴氨酸與PEG反應.由于賴氨酸不溶于有機溶劑,因此現(xiàn)有的合成反應只能在水溶液中進行.在這種情況下必須精確控制反應溶液的pH值,而且產率較低.現(xiàn)有的方法都是通過活化氨基組分或者活化PEG組分來實現(xiàn)合成,在本文的方法中,我們首先通過酯化反應保護賴氨酸的羧基.這種方法不僅保護了羧基,由此形成的賴氨酸衍生物在有機溶劑中有良好的溶解性.因而使得合成分枝型PEG的反應能夠在有機相中進行.我們通過多肽合成中常用的縮合反應完成了分枝型PEG的合成.該反應在室溫下即可完成,而且不需要控制反應溶液的pH值,使個PEG分子在一步反應中都結合到賴氨酸分子上.此合成方法比現(xiàn)有方法簡便且有較高的產率論高等學?；瘜W學報VoL 24上迄今未見報道.與已有的合成方法相比,該方法簡便、經濟.參考文獻[1] ZHOU Wen-Xiao(周文孝), YUAN Qing-Hui(袁慶輝). 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In this paper, a kind ofbranched PEG was synthesized via conventional methods used in the synthesis of polypeptide(protection, condensation, and deprotection using lysine and mPEG5000 as starting materials. Inthis method, the most important reaction of forming branched PEG was fulfilled in one step byondensation reaction in organic phase. It makes this method remarkably different from otherThe reaction condition is mild and the yield of the product(61%) is higher. Thecharacterization of products in different steps is consistent with their structures. The H NMRspectrum of our end product branched PEG tallies with its structure.Keywords New method Synthesis; Branched PEG(Ed: w,Z)2002年進入《 SCICDE的中國期刊ACTA CHIMICA SINICA(化學學報)ACTA MECHANICA SINICA(力學學報ACTA PHARMACOLOGICA SINICA(中國藥理學報)CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES-CHINESI(高等學?；瘜W學報)CHINESE JOURNAL OF CHEMISTRY(中國化學)MEDICAL JOURNAI(中華醫(yī)學雜志)CHINESE PHYSICS LETTERS(中國物理快報)CHINESE SCIENCE BULLETIN(科學通報)COMMUNICATIONS IN THEORETICAL PHYSICS(理論物理通訊)SCIENCE IN CHINA SERIES A- MATHEMATICS PHYSICS ASTRONOMY(中國科學A-數(shù)學,物理,天文學)SCIENCE IN CHINA SERIES B-CHEMISTRY(中國科學B化學)SCIENCE IN CHINA SERIES C- LIFE SCIENCES(中國科學C-生命科學)SCIENCE IN CHINA SERIES D-EARTH SCIENCES(中國科學D-地球科學SCIENCE IN CHINA SERIES E- TECHNOLOGICAI. SCIENCES(中國科學E技術科學)轉載自《中國科技論文統(tǒng)計與分析》(中國科學技術信息研究所,2002年12月)第104頁