2013年第21卷合成化學(xué)第1期,099-102Chinese Journal of Synthetic ChemistryNo.1,099~102制藥技術(shù)比伐盧定的聚乙二醇化修飾何燕,鄧言波,王良友(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院江蘇蘇州2151232.蘇州中科天馬肽工程中心有限公司江蘇蘇州215101)摘要:將比伐盧定(BVLD)多肽鏈7甘氨酸(Cly)用半胱氨酸(Cys)取代,以聚乙二醇(PEG)定點(diǎn)修飾巰基,采用多肽固相合成法制得[Cy]BLD(2);2與 mPEG-MAL(3a~3c)偶聯(lián)合成了三個(gè)聚乙二醇化修飾的比伐盧定衍生物—[Cys( mPEG200MAL)]BvLD(1a),[Cys(mPG500MAL)]-BvLD(1b)和[Cys(mPEG000MAL)]BvLD(1c),其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS確證。PT和T評價(jià)結(jié)果表明,1a-1c均表現(xiàn)出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性優(yōu)于比伐盧定:比伐盧定;聚乙二醇化修飾;多肽合成;抗凝活性中圖分類號:062972;R914.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1005-1511(2013)01009904PEGylation of BivalirudinHE Yan. DENG Yan-Do WANG IInstitute of Radiological Medicine and Protection, Soochow University, Suzhou 215123, China2, Suzhou China Tech Peptide Co. Ltd., Suzhou 215101,ChinaAbstract: Three PEGylation bivalirudin( BVLD )derivatives, Cys( mPEG2000-MAL)]-BVLD(1a), [Cys( mPEG5000-MAL)]-BVLD(Ib)and Cys(mPEG10000-MAL)J-BVLD(1c),weresynthesized by addition reaction of mPEG-MAL(3a-3c)and cys] -BVLD(2)which was preparedby replacing the 7-glycine( Gly )of BVLD by cysteine( Cys)with the solid phase peptide synthesisThe structures were confirmed by Ms. The results of Pt and tt evaluation showed that la-Ic exhibited good anticoagulation activities, especially 1b was better than bivalirudinKeywords: bivalirudin; PEGylation; peptide synthesis; anticoagulation activity比伐盧定(BVLD)是由20個(gè)氨基酸(DPhe-250mg,價(jià)格昂貴。其在腎功能正常的患者體內(nèi)Po- Arg- Pro-Gly-Gly-Gly-Gly- Asn-Gly- Asp-Phe-Glu-的清除半衰期為25min,雖然比伐盧定于2000年Cu- Ile-Pro-Glu-Glu- Tyr-Leu)組成的水蛭素的衍被批準(zhǔn)用于經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)的抗凝生物是凝血酶的直接可逆的二價(jià)抑制劑,可治療在2005年被批準(zhǔn)用于接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介以與凝血酶的催化位點(diǎn)和陰離子結(jié)合位點(diǎn)(底物入治療的抗凝治療,但是昂貴的價(jià)格限制了其識別位點(diǎn))結(jié)合。BVLD于200年12月15日在臨床上的應(yīng)用。因此,開發(fā)長效、安全、經(jīng)濟(jì)的被美國FDA批準(zhǔn)上市。類似藥物十分必要。蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇化修飾BvLD是一種合成的多肽藥物,單次劑量為( PEGylation)后能顯著改善其特性,如增加蛋白收稿日期:20120705;修訂日期:201211基金項(xiàng)目:江蘇省“大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃”資助項(xiàng)目(5731504610)中國煤化工作者簡介:何燕(1990-),女,漢族新疆昌吉呼圖壁人,在讀本科生,主要從*YHCNMHG通信聯(lián)系人:王良友,副研究員,E-mal:jiangyang@gai.com100一合成化學(xué)vol.21,2013質(zhì)對酶的穩(wěn)定性延長蛋白質(zhì)在血漿中的半衰期、CH2Cl2(5mL)溶液,Et3N6mmol和對甲苯磺酰降低抗原性和免疫原性等4,已有多個(gè)PEG修飾氯6mml,攪拌下于室溫反應(yīng)20h(TC監(jiān)測)。的蛋白藥物上市。于40℃減壓旋蒸除去溶劑,加預(yù)冷無水乙醚沉本文將BVLD多肽鏈7甘氨酸(Cy)用半胱降,過濾,濾餅用二氯甲烷溶解,依次用0.1%檸氨酸(Cys)取代,以PEC定點(diǎn)修飾巰基,采用多肽檬酸鈉溶液(3×10mL),飽和NaCl溶液(3×足固相合成法制得[Cys]BvLD(2);2與mPEG-量)洗滌無水Na2SO4干燥12h,于40℃減壓旋MAL(3a~3c)偶聯(lián)合成了三個(gè)PEG修飾的BV-蒸除去溶劑,乙醚沉降抽濾濾餅干燥得白色粉LD衍生物——[cys(mPEG2000MAL)]BVLD末 mPEG-OTs(Ia-le)(1a),[ Cys(mPEG5000-MAL )]'-BVLD(1b)F在反應(yīng)瓶中依次加入Ia~lc1mmol的DMFCys(mPG00OMAL)]BVLD(1c),其結(jié)構(gòu)經(jīng)(10mL)溶液鄰苯二甲酰亞胺鹽(P6mmolMs確證。PT和TT評價(jià)結(jié)果表明,1a~1c均表N2保護(hù)下于120℃反應(yīng)4h。于90℃減壓旋蒸現(xiàn)出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性優(yōu)于除去溶劑,依次加入無水乙醇與水合肼,回流反BvLD。應(yīng)2h。于60℃減壓旋蒸除去溶劑,殘余物用氯甲烷溶解,過濾濾液依次用水(3×10mL),飽1實(shí)驗(yàn)部分和NaCl溶液(3×足量)洗滌,無水Na2SO4干燥1.1儀器與試劑12h,于40℃減壓旋蒸除去溶劑,乙醚沉降,抽創(chuàng)新通恒半制備高效液相色譜儀[ Phenome濾濾餅干燥得白色粉末 mPEG-NH2(Ⅱa~IenexC】8柱,250mm×30mm(100A,10μ),流動(dòng)在反應(yīng)瓶中加人Ⅱa~Ⅱe1mmol的二氧六相A:0.05%TFA水溶液,B:0.05%TFA(三氟乙環(huán)(40m)溶液,攪拌下于80℃加馬來酸酐4酸)70%CH2CN/H2O,流速20mL·min-1,檢測mmo,反應(yīng)30min。于55℃減壓旋蒸除去溶劑波長215m],戴安U00高效液相色譜儀乙醚沉降,抽濾,濾餅用醋酸酐溶解,加人無水醋[HPLC, Prosphere C18 #, 250 mm x4. 6 mm(100酸鈉,攪拌下于100℃反應(yīng)45min(反應(yīng)液由淡黃A,5μ),流動(dòng)相同前,流速1mL·min];Bmk.色逐漸變?yōu)楹稚后w)。加水(10倍體積),分液,er MtQ型質(zhì)譜儀水層用CH2Cl2(3×10mL)萃取,合成并有機(jī)層,固相合成載體cTC樹脂(原始替代度為13用飽和NaCl溶液(3×足量)洗滌,無水Na2SOmnlg2),Dc(M,N一二環(huán)己基碳二亞胺),千燥12b,40℃減壓旋秦除去溶劑,乙醚沉降,HoB(L羥基苯并三氮唑)以及10種Fm0c保護(hù)抽濾,濾餅干燥得淡黃固體3-3氨基酸,上海吉爾生化公司;TFA, Acros;EDT(乙Ia~3c的產(chǎn)量及產(chǎn)率見表1。二硫醇)和TMBS(三甲基溴硅烷), Fluka;聚乙二2)[Cys]BVLD(2)的制備醇的平均分子量為mPEG200OH,mPEC000-CTC樹脂15.00g,HOBt和HBTu為縮合劑,OH和mPEG00o,sgma;其余所用試劑為按照反應(yīng)的投料比稱取相應(yīng)量的Fmc.luOH,分析純。Fmoc-Tyr( Bu)-OH, Fmoc-Glu( OtBu)-OH, FmocPro-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp1.2合成(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn( Trt)-OH(1) mPEG-MAL(3a~3c)的合成通法Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-D-Phe-OH FA Fmoc-Arg在反應(yīng)瓶中依次加入 mPEG-OH1mmo的(Pbf)-OH,根據(jù)[Cys]BVD的氨基酸順序,按表1Ia-3c的產(chǎn)量及產(chǎn)率Table1 Output and yield of Ia-3emPEG2000(2 g)mPEG5000(5 g)mPEC1000010g)ⅡⅡb3c產(chǎn)量/g4.401.423.15產(chǎn)率/%72488.028.442.379.5ovL中國煤化工0.36CNMHG 58.4第1期何燕等:比伐盧定的聚乙二醇化修飾Fmoc-AA. HOBt, HBTU/HATU1誘%?！竫臨襲費(fèi)季)rDIPEA. DMF. CTC洗滌3x1min2-CTC6%茚三酮的乙醇溶液,80%苯酚的乙醇溶液2%KCN的吡啶溶液(1mmol·L-,樹脂有顏色為陰性)mIn圖1Fmc固相多肽合成2CTC的流程圖Figure 1 The flow chart of the Fmoc solid phase peptide synthesis of 2-CTov(六氫吡啶):VDMF)=1:3標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法(圖1)合成D1.95(2),Cu4.06(4),Pm2.92(3),Arg0.96Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Cys'( Trt)-Cly-Asn (1), Gly 4. 21(4), Tyr 1.06(1),Phe 1.92(2)(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu )-Clu( Ot- Ile 1. 01(1), Leu 0.97(1)Bu)-Ile-Pro-Glu( OtBu )-Glu( OtBu )-Tyr( tBuLeu-CTC(2CTC)。按照8叫L·g1樹脂用量配1.31的抗凝活性評價(jià)制并加入裂解液以混合溶劑[v(TFA):V(苯甲(1)1的凝血酶原時(shí)間(PT)測定硫醚):v(EDT):V(苯甲醚)=90:5:3:2]為裂將PT試劑和受檢血漿置37℃水浴中預(yù)溫5解液,于0℃反應(yīng)90mn。過濾濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除min。取試管1支加入受檢血漿01m,一定量去TFA,加冷凍無水乙醚(6倍體積)沉淀出白色的比伐盧定或1(用p74的 Tris-HCI緩沖液配固體3000mm離心5mn,濾集固體用水溶解,制成所需終濃度),置37℃水浴中預(yù)溫30s,再加冰凍干燥至恒重得白色于粉2粗品62mg。人預(yù)溫的P試劑0.2mL,混勻,立即啟動(dòng)秒表計(jì)2粗品經(jīng)HPC純化得2純度大于95%時(shí)。不斷地傾斜試管至液體流動(dòng)緩慢趨于停止(HPC),其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS和氨基酸組成分析確證。時(shí),記錄所需時(shí)間。重復(fù)三次取平均值空白對由MS分析可知,在11122處有主峰,與理論分照為 Tris-HCl緩沖液測試結(jié)果見表2子量2223.99分子帶兩個(gè)電荷一致。2經(jīng)酸性水表21的P評價(jià)數(shù)據(jù)解(6mo·L1鹽酸水溶液,于110℃反應(yīng)22hTable 2 Pt evaluation data of 1下同)的氨基酸組成實(shí)測值與理論值(括號內(nèi))相等質(zhì)量濃度等摩爾濃度符:Asp1.99(2),clu4.11(4),P3.9(3),Arg0.96(1),Gy4.21(4),Tyr1.07(1),Phe終濃度凝固時(shí)間/s終濃度凝固時(shí)間/s1.92(2),Ie0.99(1),Leu0.98(1)。空白對照11.92(0.40)11.92(0.40)(3)1a~1c的合成通法比伐盧定2.041.9(1.49)2.041.9(1.49)在反應(yīng)瓶中加入2的水(10mL)溶液,用5%2.026.5(0.85)2.026.5(0.85)碳酸氫鈉溶液調(diào)至pH7~8,加入3a~3c,于室溫2.015.0(0.15)4.040.3(2.08)反應(yīng)至終點(diǎn)(HPLC監(jiān)測)。HPLC分離提純得1b2.016.2(0.64)7.0514(0.71)la~1c,純度大于95%, MALDI-TOF-MS分析結(jié)2015.8(0.9)12.044.0(0.80)果表明,在4232附近有一系列峰,相鄰兩峰分子量相差約44,具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)終濃度/g·mL-1,凝固時(shí)間欄括號內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)差酸性水解的氨基酸組成實(shí)測值與理論值(括號由表2可見1a~1c不僅在等質(zhì)量濃度測定條件內(nèi))相符。1a:ABp1.99(2),Cu4.11(4),Po下仍保留了一定的抗凝活性;而且在等摩爾濃度309(3),Ag0.96(1),Cy4.21(4),Tyr1.07下也保持了良好的抗凝活性其中1b的抗凝活性(1),Phe1.92(2),le0.99(1),Leu0.98(1優(yōu)于比伐盧定1b:Asp200(2),chu4.31(4),Po3.18(3),(2)1的凝血酶時(shí)間(TT)測定Arg1.03(1),oy4.13(4),Tyr1.02(1),Phe取受檢血中國煤化工一定量的1.82(2),Ⅱel.06(1),Leu1.03(1)。1e:Ap比伐盧定或1CNMHG沖液配制102合成化學(xué)vol.21,2013成所需終濃度),置37℃水浴中,預(yù)溫5min,再加果見表4。由表4可見,1a~1c仍保持了良好的人0.1mL標(biāo)準(zhǔn)化“凝血酶”試劑,同時(shí)啟動(dòng)秒表抗凝活性,其中,1b的抗凝活性最佳。記錄血漿凝固時(shí)間。重復(fù)三次取平均值測試結(jié)果見表3。從表3可以看出,1a~1c均具有較好結(jié)果與討論的抗凝活性(正常對照平均值18.0s)。比伐盧定的構(gòu)效關(guān)系研究表明,其氨基端帶表31的T評價(jià)數(shù)據(jù)正電荷區(qū)域(DPhe-Pro- Arg-Pro)和羧基端帶負(fù)電Table 3 tt evaluation data of 1荷區(qū)域( Asn-Gly- Asp-Phe-Glu-Gu-le-Pro- Glu-Glu-Comp終濃度/嗎·mL凝固時(shí)間/s標(biāo)準(zhǔn)差/sTyr-Leu)是其與凝血酶結(jié)合的兩個(gè)關(guān)鍵區(qū)域,而0.055-位至8-位的4個(gè)Gy只起連接作用,因此選擇比伐盧定7位或8-位的甘氨酸進(jìn)行聚乙二醇修飾是理想的0.200.81位點(diǎn)。初步活性評價(jià)表明,本研究合成的三種不32.8同平均分子量的1a~lc能保持較好的體內(nèi)抗凝1b0.0532.51.33活性,在相同摩爾濃度下,1b的抗凝活性優(yōu)于比0.1026.6伐盧定,有望進(jìn)一步開發(fā)成具有比比伐盧定更長半衰期的抗凝藥物。表41的APT評價(jià)數(shù)據(jù)(等質(zhì)量濃度)Table 4 APtt evaluation data of 1參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)差/8[1] Reed M D, Bell D. Clinical pharmacology of bivaliru空白對照1.31[J]. Pharmacotherapy, 2002比伐盧定51.71.9[2] Maraganore J M, Bourdon P, Jablonski J, et al. De-sign and characterization of hirulog: A novel class of49.90.8272.71.11ry,1990,29(30):7095Ic59.2routine care of patients undergoing percutaneous coro終濃度004ug·mLnary intervention[J ] European Heart Joumal, 2010(3)1的活化部分凝血酶時(shí)間(APrT測定取APTT反應(yīng)液0.1mL和受檢血漿01mL[4]王良友,劉克良.多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾于塑料離心管中,并加入5μL的比伐盧定或1方法[J].有機(jī)化學(xué),2003,23(11):1320-1323[5] Ryan SM, Mantovani G, Wang X, et al. Advances(用pH74的 Tris-HC1緩沖液配制成終濃度0.04PEGylation of important biotech molecules: Deliveryμg·mL的溶液),置37℃水浴中預(yù)溫3minaspects[ J]. Expert Opinion Drug Delivery, 2008,5再加入預(yù)溫的APTT催化劑0.1mL,混勻,立即啟(4):3712383動(dòng)秒表計(jì)時(shí)。不斷地傾斜試管至有絮狀沉淀生成時(shí),記錄所需時(shí)間。重復(fù)三次,取平均值,測試結(jié)(上接第76頁)[10] Raposo MMM, Garcfa-Acosta B, Abalos T, et al(I)ion selective electrodes with PVC membranesSynthesis and study of the use of heterocyclic thiosem-based on two bis- thioureas as ionophores: 1, 3-Bisicarbazones as signaling scaffolding for the recogniti(N-benzoylthioureido benzene and 1, 3-bis(N-fuof anions[ J]. J Org Chem, 2010, 75: 2922-29331.【- of hazardous[11] Wilson D, Aradab M A, Alegrete S, et al. Lead中國煤化工CNMHG