第25卷第4期大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2003年12月Journal of Dalian Medical University反義核酸技術(shù)及應(yīng)用曹長(zhǎng)姝,隋鴻錦大連醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室遼寧大連116027)關(guān)鍵詞扳義核酸技術(shù);反義寡核苷酸P2-2010中圖分類號(hào)夏52文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼文章編號(hào):1671-72932003)4-0300-03反義核酸技術(shù)是用人工合成的或生物合成的特定互補(bǔ)合成的反義寡核苷酸抑制真核細(xì)胞基因、癌基因、病毒基因的DNA或RNA片段阻斷從基因到蛋白的信息流,以達(dá)到及其他內(nèi)源基因的表達(dá)其已經(jīng)成為一種重要的抗腫瘤、抗抑制或阻斷基因表達(dá)的生物新技術(shù)。利用核酸分子雜交原病毒侯選藥物并進(jìn)行了大量的體外、體內(nèi)研究。理將反義寡核苷酸( antisense oligonucleotide ASON胙作為外源性基因表達(dá)抑制物結(jié)合到靶mRNA序列上阻止其翻譯成2反義核酸技術(shù)的作用機(jī)制蛋白1。具有雜交特異性和選擇性調(diào)節(jié)基因的表達(dá)的特在反義核酸技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程中由于多種化學(xué)修飾的反點(diǎn)21這一技術(shù)不僅已成為常用的實(shí)驗(yàn)室研究方法還廣泛義寡核苷酸的出現(xiàn)其作用機(jī)制已不僅僅是誘導(dǎo) RNaseh的的應(yīng)用于研究病毒、腫瘤、寄生蟲(chóng)和遺傳性疾病的預(yù)防和治切割機(jī)制RNεseH是一種廣泛存在旳酶在病毒和人體細(xì)胞療具有重要的應(yīng)用前景。中都有發(fā)現(xiàn)能降解 DNA/RNA復(fù)合物中的RNA鏈)還存對(duì)于人類基因的研究,人們采用分子克隆、分子雜交、在于非 RNaseh依賴的切割機(jī)制:如雙鏈 RNase、 RNasel、PCR技術(shù)等一系列研究手段。DNA重組技術(shù)的問(wèn)世推動(dòng) RAsp合成的切割物以及核( ribozyme)而且可以通過(guò)了一個(gè)新的研究領(lǐng)域的發(fā)展3。反義核酸技術(shù)從反向遺傳非切割機(jī)制阻礙mRNA的代謝如5′帽加工、調(diào)節(jié)剪接、抑學(xué)的角度為分子生物學(xué)增添了新的內(nèi)容。所謂反義核酸技制翻譯起始、抑制翻譯延長(zhǎng)破壞核酸的相互作用5。術(shù)是一種根據(jù)堿基互補(bǔ)原則用人工合成或生物合成的與特所以在設(shè)計(jì)ASON時(shí)不僅要考慮它的序列特異性還要定的基因互補(bǔ)的DNA或RNA片段或其化學(xué)修飾物)斷考慮它的作用機(jī)制而且對(duì)一個(gè)特定的ASON其反義活性可從基因到蛋白的信息流從而達(dá)到抑制或阻斷基因表達(dá)的技能涉及多種機(jī)偉術(shù)。反義寡核苷酸是一類人工合成或構(gòu)建的重組載體表達(dá)的寡核苷酸片段通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理干擾基因的解旋、復(fù)3反義核酸技術(shù)中寡核苷酸的序列設(shè)計(jì)、攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接加工、翻譯等各個(gè)環(huán)節(jié)從而調(diào)節(jié)細(xì)從目前的研究來(lái)看反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到其在胞的生長(zhǎng)、分化等。體內(nèi)的穩(wěn)定性、能容易地進(jìn)入細(xì)胞并與靶序列高親合性結(jié)合反義核酸技術(shù)的發(fā)生發(fā)展且不產(chǎn)毒性與靶序列結(jié)合后特異性抑制靶基因地表達(dá)。所以選擇反義DNA或反義RNA時(shí),為使之特異地結(jié)合mR1977年 Paterson發(fā)現(xiàn)外源性核苷酸可調(diào)節(jié)基因表達(dá),NA上,般至少15個(gè)核苷酸最長(zhǎng)不超過(guò)20~25個(gè)太長(zhǎng)1978年 zamecnik等證明特異互補(bǔ)的寡核苷酸在體外能有效的反義核苷酸很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),一般選用18個(gè)核苷酸左右的扣制Rous肉瘤病毒RSv增殖。80年代早期人們發(fā)現(xiàn)細(xì)為宜其中G-C質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)在60%-65%67所以長(zhǎng)的菌內(nèi)的一類基因組DNA自發(fā)轉(zhuǎn)錄的反義RNA4通過(guò)堿基反義RNA并不比短的反義RNA有效。在原核生物中針對(duì)互補(bǔ)原理與靶RNA主要是mRNA)配對(duì)結(jié)合抑制靶 RNA SI序列及其附近區(qū)域的反義RNA可能有效。真核生物中,的功能從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮對(duì)應(yīng)5′端非編碼區(qū)的反義RNA可能比針對(duì)編碼區(qū)反義其生物學(xué)作用。隨著深入的研究反義核酸技術(shù)迅速地發(fā)展R中國(guó)煤化工不應(yīng)有開(kāi)放讀框,否則該起來(lái)反義寡核苷酸其優(yōu)點(diǎn)在于高度靶特異性(堿基互補(bǔ))反義的配對(duì)結(jié)設(shè)計(jì)多樣、合成容易及高度的局部性和針對(duì)性是常規(guī)藥物合。N形成位點(diǎn)或者3端非翻的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和作用所不可比擬的?，F(xiàn)在人們廣泛應(yīng)用人工譯區(qū)、mRNA5’端非翻譯區(qū)、nRNA編碼區(qū)(主要是起始密收稿日期2002-10-17修回日期2002-12-24。作者簡(jiǎn)介曹長(zhǎng)姝1975-)女大連人碩士第4期曹長(zhǎng)姝等反義核酸技術(shù)及應(yīng)用碼)這些區(qū)域的AXON可產(chǎn)生明顯的抑制功能8但高效的作用這是S-oigs最顯著的特點(diǎn)。②甲基化寡核苷酸低毒的反義寡核苷序列設(shè)計(jì)尚無(wú)眀確的規(guī)律要證實(shí)反義寡(M-ogos)可對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)酶的水解對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用已核苷對(duì)靶mRNA的特異性抑制、排除非特異作用機(jī)制除檢用于培養(yǎng)細(xì)胞上抑制病毒基因或內(nèi)源性基因的表達(dá)。③聚測(cè)靶mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)外更重要的是要設(shè)立必要的對(duì)酰胺核酸ⅣNA)漢稱肽核酸其保留核酸結(jié)構(gòu)中最主要旳照。常用的對(duì)照有正義鏈( sense)錯(cuò)義鏈( missense)及反義堿基結(jié)構(gòu)其他兩種結(jié)構(gòu)〔戊糖和磷酸殘基變成線性酰胺tit( antisense 1結(jié)構(gòu)故PNA是一連串的酰胺基相連的長(zhǎng)鏈與一系列單個(gè)反義寡核苷酸旳穩(wěn)定性問(wèn)題用化學(xué)修飾的方法有可能堿基相連的新型物質(zhì)。近年來(lái)隨著ASN純化合成的硏究得到解決。目前認(rèn)為靶向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能解決反乂寡核苷酸技術(shù)進(jìn)展多種化學(xué)修飾的ASON問(wèn)世其中最具代表性的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)問(wèn)題。已研究的特異性靶向技術(shù)包括受體介導(dǎo)是第一代反義核酸藥物的硫代ASON但與天然結(jié)構(gòu)反義核的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫脂質(zhì)體靶向及毫微粒靶向、信號(hào)肽轉(zhuǎn)運(yùn)苷酸相比其與靶πNA特異結(jié)合能力減弱;與一些細(xì)胞因signal peptide sP)或HIⅤg4l蛋白融合序列的寡肽載體子、受體、蛋白結(jié)合能力增強(qiáng)可受到3’核酸酶降解等缺點(diǎn)。等而且后兩者不需要經(jīng)過(guò)內(nèi)吞過(guò)程可以有效地將反義核因此在應(yīng)用中提高ASON的穩(wěn)定性和保持其生物學(xué)活性酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。是選則ASON化學(xué)修飾物的關(guān)鍵因素。4反義寡核苷酸的劑量、給藥途徑和方式以及毒性6反義核酸技術(shù)的應(yīng)用4.1反義寡核苷酸的劑量用反義寡核苷酸選擇性抑制基因表達(dá)的功能對(duì)于生物在不同的臨床前藥效研究中寡核苷酸旳有效劑量不同,醫(yī)學(xué)硏究有著深遠(yuǎn)的意乂特別是對(duì)于一些功能性的基因。與下列因素有關(guān)(1所用動(dòng)物的種系及疾病的種類(2凜寡應(yīng)用這種技術(shù)可使許多疾病得到治療或緩解15作為一組核苷酸的化學(xué)性質(zhì)(3給藥方法和途徑。所以有效劑量尚復(fù)合物被發(fā)展為治療劑。例如有一種反義寡核苷酸應(yīng)用于有待于探索。巨細(xì)胞角膜炎的治療161因?yàn)槟壳霸S多眼部疾病沒(méi)有滿意4.2給藥途徑和方式的治療方案而這項(xiàng)技術(shù)為治療眼部疾病提供了廣闊的前在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可以全身給藥。為了避免多次給藥可景。腫瘤一直是醫(yī)療工作者要攻克的頑癥對(duì)于腫瘤的化學(xué)采用微滲透泵等裝置。優(yōu)點(diǎn)在于能持續(xù)釋放藥物維持治療在以往的化療藥物可對(duì)病人身體產(chǎn)生一定的副作用有效濃度缺點(diǎn)在于用藥結(jié)束后必須手術(shù)去除。對(duì)臨床應(yīng)用缺乏特異性腫瘤學(xué)家正在探索多種治療方法,以提高對(duì)腫來(lái)講生物體兼容的、生物學(xué)上可降解的持續(xù)釋放裝置更好瘤細(xì)胞的特異性?，F(xiàn)有大量的證據(jù)表明反義藥物是安全的些?，F(xiàn)有利用腺病毒在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的反義核苷酸以達(dá)而且在人體腫瘤的動(dòng)物模型中顯示其功效1。而且體內(nèi)外到治療目的1對(duì)較為局限的病灶可局部給藥采用局部實(shí)驗(yàn)證眀AS○N能特異性扣制腫瘤細(xì)胞增殖是治療腫瘤潛注射或局部微滲透泵?，F(xiàn)已研制岀來(lái)的EP-2010是一種在的新型藥物。反義核酸技術(shù)亦應(yīng)用于心臟、腎移植、延長(zhǎng)呼吸系統(tǒng)反義寡核苷酸作用于腺苷№2贗體G-蛋白偶同種移植的生存期等臨床治療。而且這項(xiàng)技術(shù)作為聯(lián)受體作為一種氣霧劑直接被輸送到肺12這樣全身不良種基因治療越來(lái)越有效地服務(wù)于藥物開(kāi)發(fā)人類的致病反應(yīng)輕給藥方便,而且肺吸附面積較大,帶有表面活性物菌金葡菌復(fù)雜的基因分析通過(guò)反義技術(shù)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)取質(zhì)冋促進(jìn)藥物在肺組織的分布在哮喘的治療發(fā)揮重要的得成功提供了一種分析葡萄球菌基因產(chǎn)物的方法這可應(yīng)作用用于抗生素的開(kāi)發(fā)20。在美國(guó)已有10種以上的反義寡核4.3反義寡核苷酸的毒性苷酸作為治療藥物進(jìn)入臨床前期實(shí)驗(yàn)階段。在基礎(chǔ)研究方反義寡核苷酸的毒性與動(dòng)物種類和用藥劑量有關(guān)。腹面已用于研究G-蛋白、磷脂酶((PLC)蛋白激酶C的作腔或皮下給藥與其在體內(nèi)的分布特點(diǎn)相符有可能分布除用以及與癌癥有關(guān)的功能腦以外的各種組織對(duì)腎臟、肝、脾、骨髓等系統(tǒng)器官產(chǎn)生反義核酸技術(shù)對(duì)于RNA表達(dá)調(diào)控有巨大的潛力。近年定的毒性作用大部分ASON最終在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的器官中來(lái)反義寡核苷酸的生物學(xué)特點(diǎn)、臨床前研究和臨床試驗(yàn)研積累。因此這些器官既是其發(fā)揮作用的場(chǎng)所同時(shí)有可能究取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展但這項(xiàng)技術(shù)的成功率不高反義寡核受到侵害。也有報(bào)道在小鼠和大鼠中寡核苷酸的毒性與苷酸其作用機(jī)制、作用的選擇性、特異的核苷酸序列設(shè)計(jì)、化序列相關(guān)13對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物猴的實(shí)驗(yàn)中寡核苷酸的毒性學(xué)修飾和劑型設(shè)計(jì)、靶組織的有效給藥方法、有效劑量及安與其化學(xué)修飾相關(guān)13全性等問(wèn)題尚需解決。表達(dá)的反義寡核苷酸能有效并長(zhǎng)期5常見(jiàn)的人工合成的反義寡核苷酸地降低一種基因的表達(dá)狙不能區(qū)分部分相似序列等一系列問(wèn)題中國(guó)煤化工基礎(chǔ)研究及臨床治療提供由于正常結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸片段易被細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)了廣CNMHG新的途徑大量存在的核酶降解很難達(dá)到預(yù)期效果通常采用其化學(xué)修飾產(chǎn)物硫代磷酸化反義核苷酸s- oligos)是在磷原參考文獻(xiàn)子上含有一個(gè)硫取代氧的結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)核酸酶抗性能激「1] Walton sp, Stephano∞usGN, Yarmush m,etal.活 Rnaseh從而引起靶降解等特性成為目前反義應(yīng)用研究Thermodynamic and kinetic中最多的一種修飾寡核苷酸在細(xì)胞中具有明顯的抗核酸酶oligodexynucleotide binding to a structured mRNA J ] J大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)第25卷Biophys20028x1)366-3(13)3038-3041[2 ]Tamm I, Dorken B Hartmann G. 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Curr Opin Mol Therpressing antisense insulin-like growth factor I receptor2000(3)304-31on human lung cancer cell line J ] Cancer Res 1996 56Antisense technology and applicationCAO Chang-shu SUI Hong-jinDepartment of Anatomy, Dalian Medical University, Dalian 116027 China)Abstract: Antisense technology is using specific complementary DNA or RNA frangments which are synthesizedbiologically or artificially to block the informational stream from gene to protein in order to inhibiting or blockinggene expression and is that antisense oligoneucleotide as extrinsic germRNA fragments to interrupts them translating protein. the hybridization specificity and selectively regulatinggene expression make antisense therapy be a scientific research method which attracts lots of researchers. Thehnique not only is a valuable experimental tool but also applies researching the precation and theapy of virtumour parasitic and hereditary diseases. It has importment realistic valuleKey words: antisense technology antisense oligoneucleotide EP2-2010H中國(guó)煤化工CNMHG