中國食品添加劑試驗研究China Food Additives-酶法合成中合成酶的應(yīng)用研究陳華磊1.2，侯殿志12，于玥1.2，相萍萍1.2，朱延光1.2,藍尉冰1.2.3,謝政1.2,姚曉麥12，陳山1.2.*(1.廣西大學(xué)糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，南寧530004;2.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，南寧530004; 3. 欽州學(xué)院，欽州535011)摘要:酶法合成因其高效無污染、專- 性強、雜質(zhì)含量低、可連續(xù)化生產(chǎn)及產(chǎn)品分子量易控制等優(yōu)點，逐漸成為現(xiàn)在制備生物大分子化合物研究的熱點。尤其是合成酶的應(yīng)用，為生物大分子化合物的酶法合成提供了一種更加有效便捷的方式。但是，目前酶法合成的相關(guān)研究尚處于探索階段，合成酶的研究報道也較少。探索獲得高活性、高穩(wěn)定性的合成酶，是酶工程技術(shù)制備生物大分子的關(guān)鍵。該文就合成酶的種類及應(yīng)用、作用機制、以及催化性能提升等方面的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進行了綜述，對其應(yīng)用前景及未來的研究方向進行了探討。關(guān)鍵詞:酶法合成;合成酶;作用機制;催化性能中圖分類號: Q559文獻標識碼: A文章編號: 1006- 2513 (2016) 06- 0114-11Research on synthase application in enzymatic synthesisCHEN Hua1ei.”, HOU Dian-zhi!, YU Yue'.2, XIANG Ping ping' 7, ZHU Yan-guang'2,LAN Wei-bing' 2.3, XIE Zheng': 2, YAO Xiao-mai1.2, CHEN Shan!: 2.●(1. Engineering Center for Sugarcane and Cane sugar, Guangxi University, Nanning 530004;2. Engineering Center for Sugar and Comprehensive Utilzation, Ministry of Education, Nanning 500004;3. Qinzhou University, Qinzhou 535011)Abstract: Enzymatic synthesis has become a hot research topic in the synthesis of high molecular weight compoundsdue to the advantages of eficiency of the synthesis, pollution- free, high specificity, low impurity content,continuous producing and easily control of molecular weight.This study provides a more eficient and convenient wayfor the synthesis of biological macromolecules by enzymatic synthesis. The research of enzymatic synthesis is still inthe exploratory stage and the reportsare few. To explore high activity and high stability of the synapses is the key in theenzyme engineeringof preparation of biological macromolecules. In this paper, the types and aplicaion of enzymes,the mechanism of action, and the improvement of the catalytic performance, as well as other aspects of domestic andforeign research status are reviewed, and its application prospects and future research directions are discussed.Key words: enzymatic synthesis; synthase; mechanism; catalytic properties傳統(tǒng)生物法合成大分子化合物一-般 利用菌體應(yīng)體系比較復(fù)雜，存在諸多問題。首先，發(fā)酵工發(fā)酵法，但是菌體發(fā)酵法制備大分子化合物的反程菌種的篩選比較困難，菌種篩選周期較長，菌收稿日期: 2016-03-11*通訊作者中國煤化工基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(21264003) ; 2013 年廣西自然科學(xué)基金項目(2013作者簡介:陳華磊(1989 -), 男，碩士，研究方向:糖廠副產(chǎn)物綜合利用與糖類藥物開MYHCNMH GL 114“2016年第6期中國食品添加劑:試驗研究China Food Additives-活性。右旋糖酐蔗糖酶與蔗糖共價鍵聯(lián)結(jié)在一其中，以蔗糖為底物，在無其他受體情況起，并將蔗糖分解放出果糖，形成D- -glucosy1-下， 首先催化蔗糖分解生成與酶連接的D-葡萄Enzyme [45。在酶催化的情況下，反應(yīng)可向四個糖基和果糖，然后將D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移到右旋方向進行1461: (1)聚合產(chǎn)生右旋糖酐; (2)在糖酐殘基的C3/C6位置或水分子上，合成右旋H2O的參與下，分解生成葡萄糖; (3)在外界受糖酐糖鏈或水解蔗糖，催化合成機制如圖2-1體的參與下生成低聚糖; (4) 逆向反應(yīng)。所示(471。o的rx③②①rx ⑤Lxexo①x°D③-②-0的圖2-1右旋糖酐蔗糖酶催化合 成右旋糖酐的機制[47]1Fig.2 1 Mechanism for dextran biosynthesis by dextransucrase.(X,和Xz代表酶活性位點的親和團: O代表葡萄糖; <代表果糖; 0- -<代表蔗糖;0-0表示兩個由a- 1. 6糖苷鍵鏈接的葡萄糖基團.)右旋糖酐酶蔗糖酶除能合成右旋糖酐外，當(dāng)被移至-條右旋糖酐鏈中得到以右旋糖酐鏈作為有可識別外源受體(如麥芽糖)存在時，右旋糖分支部分的右旋糖酐(511 ; (3) D-葡萄糖基部分酐蔗糖酶可以將D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移到外源受體上被轉(zhuǎn)移至水中，蔗糖水解1521; (4) 右旋糖酐鏈合成各種糖基化產(chǎn)物，如功能性低聚糖等(48。受移至水中，或者與受體(D-葡萄糖、D-果糖、體反應(yīng)主要有以下四個方面: (1) D-葡萄糖基蔗糖、麥芽糖)結(jié)合，從活性位點處釋放右旋糖部分被移至受體單糖或低聚糖中149. s0|; (2) D-酐，聚合反應(yīng)終止(50, 52。葡萄糖基部分被移至右旋糖酐鏈中形成葡萄糖基2.2交替糖蔗糖酶的作用機制支鏈，或是D-葡萄糖基部分和右旋糖酐鏈一起2n times●f圖2- -2交 替糖蔗糖酶合成交替糖的作用機制(5]1Fig.2- 2 Reaction mechanism of alternan synthesis catalyzed hvalternaneurrace.中國煤化工(●-d;蔗糖，●:葡萄糖，<:果糖TYHCNMH G118I 2016年第6期.試驗研究中國食品添加劑.China FoodAdditives交替糖蔗糖酶的作用機制與右旋糖酐蔗糖酶淀粉蔗糖酶的催化反應(yīng)過程是將供體質(zhì)子注的作用機制較為相似153。交替蔗糖酶先斷開蔗糖人到糖苷鍵中，對部分葡萄糖的異頭碳進行親核的糖苷鍵，將葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移給受體分子，生成攻擊形，成共價連接的底物-酶中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)低聚糖或多糖，釋放果糖(54。酶活中心可以與葡.物可以和水分子發(fā)生水解反應(yīng)，也可以和糖分子萄糖殘基C3、C6位連接。當(dāng)只有蔗糖為反應(yīng)底發(fā)生轉(zhuǎn)糖基作用(21。只以蔗糖為底物時，淀粉.物時，其中一個位點上的葡糖基中間體C6.上的.蔗糖酶首先水解蔗糖為- -分子葡萄糖和- -分子果羥基親核攻擊另一個葡糖基-酶中間體C1上的糖。接著,水解得到的葡萄糖分子通過a-1, 4羥基，形成a-1, 6糖苷鍵;而另外一個位點上糖苷鍵連接， 聚合生成線性結(jié)構(gòu)的a-1, 4-葡聚的葡糖基中間體C3.上的羥基親核攻擊另一個葡糖聚合物， 使糖鏈伸長一定長度。在轉(zhuǎn)糖基作用糖基-酶中間體C1上的羥基，形成a-1, 3糖下，淀粉蔗糖酶可以將蔗糖水解產(chǎn)生的葡萄糖分苷鍵。以這樣的方式合成a-1, 6糖苷鍵和a-1，子和果糖分子又一次結(jié)合， 生成蔗糖的同分異構(gòu)3糖苷鍵交替連接的交替糖。其作用機制如圖體松二糖; 還可以生成蔗糖的另- -種同分異構(gòu)體2-2所示1531。當(dāng)?shù)孜餅檎崽呛涂梢耘c酶連接的單海藻糖。 此外，在只以蔗糖為底物時，還會生成糖或雙糖時，交替糖蔗糖酶發(fā)生受體反應(yīng)，形成麥芽糖、 麥芽三糖等其他副產(chǎn)物(231。 其作用機制a-l，3糖苷鍵或a-1, 6糖苷鍵，生成不存在2如圖2- -3所示156。當(dāng)有淀粉、糖原等為受體時，個連續(xù)的a-1, 3糖苷鍵(或2個連續(xù)的a-1, 6蔗糖水解產(chǎn)生的葡萄糖 分子為供體，依次連接到糖苷鍵)的小分子低聚糖19. s。淀粉或糖原上得到具有拓展結(jié)構(gòu)的物質(zhì)1571。2.3淀粉 蔗糖酶的作用機制CHOHCH.OHAmylosucraseHydrolysis! CHou)HOHoHSucroseGlucoseFructoseH_O! CHOHTransglycosylation Type I身Linear a-(1,4)-glucan+, CHOTransglycosylation TypeIl o1ouTuranose圖2- -3淀粉蔗糖酶的作用機制 [56)Fig.2-3 Reaction mechanism of Amylosucrase2.4脂肪酶的作用機制三聯(lián)體(Ser-His-Asp 或Ser-His- -Gly)，被埋脂肪酶在非水相體系中具有酯化、轉(zhuǎn)酯、胺在分子中。脂肪酶活性部位的Ser殘基被a-螺解和醇解等特性，這些特性使其在有機物合成中旋形成的中國煤化工“蓋子”覆MCHCNMHG'得以廣泛應(yīng)用(58)。 脂肪酶活性部位為親核催化蓋在活性中心..n.1s,時的與活性中心的1192016年第6期.中國食品添加劑試驗研究China Food Aditives結(jié)合被阻止，三聯(lián)體活性部位被保護。當(dāng)與界面物a與脂肪酶活性中心結(jié)合，接著與脂肪酶?；佑|時，由于親電子域作用，脂肪酶構(gòu)象發(fā)生了形成第一個過渡態(tài)四面體，此過渡態(tài)與兩個主鏈改變，a-螺旋形成的“蓋子”打開，暴露出活氮原子構(gòu)成的結(jié)構(gòu)內(nèi)的氨基酸碳架上-NH反應(yīng)性中心，與底物結(jié)合，催化反應(yīng)開始進行。界面生成?；钢虚g體，同時釋放出產(chǎn)物a;第二步,還可以使酶形成不完全水化層，使酶催化更易進底物b作為親核試劑，使?；钢虚g體脫?；涡衃59. 60。脂肪酶催化機理遵循Ping- Pong Bi-Bi成第二個過渡態(tài)，同時生成產(chǎn)物b,脂肪酶恢復(fù)反應(yīng)機理(61.621，反應(yīng)有兩個底物/酶過渡態(tài)和一-到自由酶狀態(tài)，如圖2- -4所示(591。個?；钢虚g態(tài)，分為兩步進行:第一步，底ROXRIHisSubstrate I公96Asp.N③N、°←RI8“HHO、H-ierFree enzymeTetrahedral intermediatein the acylating step0Ho^RI~)H2His R3 -OHAsn336-ACoA3延伸4環(huán)化圖2-5 I1 型PKS的催化作用機制163. 61Fig.2- 5 Catalytic mechanism of type II PKS性的高酶活力，即使第六批次反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率仍可3合成酶催化性能的優(yōu)化維持在40%左右，固定化酶比游離酶的熱穩(wěn)定合成酶是一種高效生物催化劑，具有底物專性好，但固定化酶的酶活比游離酶的低。尹春麗一性強、 催化效率高和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，但等1631 以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，對S-也存在對酸、堿、熱、有機溶劑穩(wěn)定性差等缺腺苷甲硫氨酸合成酶進行固定化，固定化酶活性點，限制了酶的相關(guān)應(yīng)用。此外，現(xiàn)有商品級的回收率為76%，酶的穩(wěn)定性都較好。Rastian 等合成酶種類不多，大多都是自己進行提取、分離1661采用介質(zhì)阻擋放電等離子體法在多壁碳納米管純化而得，其分離純化方法會對酶活力有很大影上引人羧基和氨基官能團，再將皺褶假絲酵母脂響。探索獲得高活性、高穩(wěn)定的合成酶,是酶法肪酶通過物理吸附固定在功能化的多壁碳納米管合成大分子化合物的關(guān)鍵。目前，提升合成酶催上，相比于游離酶，固定化酶的活性、熱穩(wěn)定性化性能常用的有效方法有:酶的固定化、酶的化和重復(fù)使用性都得到顯著提升。學(xué)修飾、突變菌得酶等。3.2酶化學(xué)修飾3.1酶的固定化酶化學(xué)修飾，就是在分子水平上對酶進行固定化可顯著增強酶的穩(wěn)定性。固定化酶技改造，包括:在已知酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)術(shù)是采用物理或化學(xué)方法將游離的酶固定于限定上，有目的地改變酶的某- -活性基團或氨基酸殘的空間區(qū)域，使其保持較高的活性，實現(xiàn)反復(fù)利基，從而使酶產(chǎn)生新的性狀:利用大分子或小分用的方法。張洪斌等171以4%海藻酸鈉和1%瓊子修飾劑對酶分子的側(cè)鏈進行改造。化學(xué)修飾是脂按1 : 1 (V/V)混合作為載體固定化右旋糖提高和改變酶代化媒能的右部士法利用化學(xué)修酐蔗糖酶生產(chǎn)右旋糖酐，該固定化酶表現(xiàn)出持續(xù)飾法可快速中國煤化工甚至合成出新的酶。THCNMHG'M元芬饃Bβ-D-呋喃12112016年第6期r