第11卷第2期生物技術(shù)Vol 11 No. 22001年4月BIOOTECHNOLOGYApr 2001thus the increase of its stability. It is found that chymotrypsin remained up to 97% of initial catalytic ac-tivity when there have50%v/ ) glycerol and the moderate pressure of 50 MPa in reversed micellesKey words chymotrypsin preserved micelles catalytic and stability effect of pressure ,temperature glyc中圖分類號x814.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼文章編號:1004-311X2001m2-0023-03酶法測定甲醇酵母發(fā)酵液中甲醇濃度黃秀東楊紅2漲張高峽李樹剛于廷和3(1.重慶雨水生物醫(yī)藥研究所重慶400002.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院重慶400043.重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)超聲工程研究所重慶400016)摘要闈用醇氧化酶-過氧化氬酶聯(lián)合的酶促反應(yīng)法測定甲醇酵母發(fā)酵誘導(dǎo)階段變化的發(fā)酵液中甲醇濃度種能夠快速測定發(fā)酵液中甲醇濃度的方法。測定的最佳濃度范圍是0.5%~5%。關(guān)鍵詞發(fā)酵押醇酵母押醇醇氧化酶甲醇酵母 Pichia pastoris)發(fā)酵的誘導(dǎo)階10om0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解A℃段甲醇濃度的控制非常關(guān)鍵通常只有配備保存?zhèn)溆妹鸽姌O才能監(jiān)控發(fā)酵液中甲醇濃度的變化,1.1.2酚溶液:苯酗AR)OOmg, 100ml蒸餾但是酶電極價格昂貴使用壽命有限。而目水溶解。前用于測定酒類甲醇含量的國標(biāo)方法1.1.3工作液:臨使用前將上述1.1.1和〔GB5009.48-85),不論是氣相色譜法還是1.1.2試劑酶酚簷等體積混合。亞硫酸品紅比色法均需要昂貴或復(fù)雜的儀1.1.4甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液器并且還要對樣品進行預(yù)處理不適合對動態(tài)發(fā)酵過程監(jiān)測濃度棵的譯配制一系列不同們采用醇氧化酶一過氧化氫酶聯(lián)合的發(fā)酵液將甲釀(工業(yè)級加入未誘酶促反應(yīng)泫簡稱AOX-CR法)能對成分導(dǎo)階段的甲醇酵母發(fā)酵上清液中配制同復(fù)雜而又不斷變化的發(fā)酵液中甲醇濃度進彳醇水溶液相應(yīng)濃度梯度甲醇發(fā)酵液溶液跟蹤測定。無需對發(fā)酵液進行預(yù)處理在甲1.1.5儀器HP8453型分光光度計。醇濃度為0.5%~5%范圍內(nèi)可對其濃度進1.2方法行快速測定1.2.1原理甲醇等低級醇經(jīng)醇氧化(A-cohol Oxidase , AoX崖催化生成相應(yīng)的醛及過材料與方法氧化氫而后者在過氧化氫( Catalase CTR)作用下分解出原子態(tài)氧將無色還原型4氨基安替比林與苯酚偶聯(lián)氧化縮合成紅色1.1材料醌亞胺類化合物(最大吸收峰322m和s20進氧化氫海生里)2,內(nèi)號印醇濃度成正比可用分光先度法是4—氨基安替比林30mg,疊氮鈉100mg,用量圖1AOXR-CH -OH +o, +Ho+.R-CHO H,O2CH,C=C-NH2cH3C=C·N==02H,O, CH,-N C0+OHCTRCH,N C=o+ 4H.O中國煤化工CNMHG收稿日作者簡物技術(shù)物理裝數(shù)擼)男副研究員士從事生24生物技術(shù)第11卷第2期1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線:AOX-CR法分別測定蒸用1%(/)甲醇發(fā)酵液作標(biāo)準(zhǔn)溶液。取誘餾水及發(fā)酵液中甲醇濃度,研究本方法的可導(dǎo)階段的發(fā)酵液,離心收集上清。按1.2.2行性。按下表中步驟加樣混勻,37℃水方法中所述方法進行測定其相應(yīng)的Am值20min508mm波長測比色繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按如下公式計算:待測發(fā)酵液中甲醇濃度%(v/)=待測樣A/1%甲醇標(biāo)準(zhǔn)液A80.181.0%。0.153討論水溶液醇氧化AOX囑黃素氧化酶類俗稱發(fā)酵液乙醇氧化酶FAD是它的輔助因子。該酶能以一系列低級醇、不飽和醇為底物但對支鏈醇及多元醇不起作用。(1)中的R-CH2OH123456789101112可以是甲醇、乙醇、丙醇等但是以催化甲醇甲醇濃度(%,N的效率最高。(2)中的過氧化氫酶也可用過圖1水溶液和發(fā)醇液中甲醇濃度與醌亞胺類As吸收值關(guān)系性略有改變但對測定影響不明顯。在甲醇酵母發(fā)酵過程中使用的是工業(yè)級的甲醇發(fā)詩測甲醇酵中最關(guān)鍵的是甲醇等誘導(dǎo)物的濃度控制標(biāo)準(zhǔn)溶液即使含有雜醇這些雜醇大都可以起誘導(dǎo)作蒸餾水/未誘導(dǎo)時發(fā)醇上清液用所以測到的雖然不是甲醇的精確量但基甲醇標(biāo)準(zhǔn)液%M/v)本上可反映誘導(dǎo)物的實際濃度。從濃度-吸0.02光度曲線可知發(fā)酵液中的其他成分不對測定123甲醇濃度的實際測定取發(fā)酵液離結(jié)果產(chǎn)生顯著影發(fā)酵時誘導(dǎo)階段甲醇的最適濃度隨工程心收集上清用于測定按下表加樣方法同菌而異,一般在0.5%~3%之間,這正是1.2.2AOX-CR法測定的理想范圍。需說明的準(zhǔn)溶液加入物m)空白管(未號導(dǎo)發(fā)酵液待是AOX-CTR測得是以甲醇為主的低級醇甲醇至1%)發(fā)酵液濃度不是甲醇的濃度它不能取代目前測甲未誘導(dǎo)時的發(fā)酵上清液0.02醇濃度的氣相色譜法和亞硫酸品紅比色法醇標(biāo)準(zhǔn)液1%w/v)附醇氧化酶的制備及活力單位(I0.02定醇氧化酶是甲醇酵母等微生物在以甲醇待測發(fā)醇液0.02為唯一碳源時大量合成的一種酶, Pichia pas工作液tors酵母產(chǎn)生的醇氧化酶在該空間結(jié)構(gòu)上有2結(jié)果缺陷所以活力較低6U/mg-101/mg酶蛋白)它是以大量合成該酶來實現(xiàn)對甲醇的大量利用的。如果不能購買到商品化的該酶2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線可以嘗試從GS115Mut+型工程菌或宿主菌根據(jù)散點圖選擇甲醇濃度為0.5%誘導(dǎo)后的菌體中大量提取AOX這種自提取5%的范圍的6組數(shù)據(jù)進行線性回歸分析的AOX可用于本方法,同購買 Biozyme的甲醇水溶液組y=0.0195x+0.0036r=A0X沒有明顯差別。具體提取及活力標(biāo)定日薛發(fā)酶液組=03+09法時美5測列支利(專利號:4430427、09代表甲應(yīng)體積百分比濃度值(%,參考文獻(xiàn)檢u1北中國工業(yè)出社v)代表對應(yīng)的A值。從上面的吸收曲線上可見甲醇濃度在[2于海波劉慶河都波酒類、飲料食品及其原料分析0.5%~5%的范圍內(nèi)本法測定的線性關(guān)系良好由反應(yīng)終產(chǎn)物醌類的量可對樣品(水溶液或發(fā)酵液沖甲醇濃度進行準(zhǔn)確測定發(fā)酵TH輕T業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出版委員會,991,7中國煤化工M]成都四川科學(xué)技術(shù)出CNMHG液中的其他成分對該方法的測定不構(gòu)成顯著culmination of alcohol oxidase and影響。azide compound[ P ] United States Patent 4430427.19842.2誘導(dǎo)階段發(fā)酵液中甲醇濃度的測定及[5]pkis, Alcohol oxidase from pichia- pe yeast[ P]. United計算States patent:4540668.1985-09-10.用誘異煎的發(fā)酵液上清液作空白對照并422第11卷第2期生物技術(shù)Vol 11 No. 22001年4月BIOOTECHNOLOGYApr 2001thol oxidase[ P]. United States Patent #956290 1990-09Colorimetric assay of methanol in fermentation broth of Pichia pastorisHUANG Xiu- dong YANG Hong? HANG Gao-xia', LI Shu- gangYU Ting-he(I Chongqing Rain Biotech Institute Chongqing 400060 2. Bioengineering Institute ofChongqing University Chongqing 400044 3. Institute of Ultrasound Engineering inMedicine Chongqing Medical University Chongqing 400016)0.5%. isa i ry important to control methanol concentration in broth of Pichia pastoris which isAbstract It was vecomplicated andssant changed. A colorimetric assay was established in this study based upon com-bined catalyalcohol oxidase and catalase. The results showed linear relationship was excellent withinIt was an acceptable method and could determine methanol concentration rapidl圖分賓fermentation Pichia pastoris 'methanol alcohol oxidase文獻(xiàn)標(biāo)識碼文章編號1004-311X2001)2-0025-03維生素C二步發(fā)酵的新組合菌系仲崇斌ψ于海2呂主奎2馮樹1張忠澤1.中科院沈陽應(yīng)用生態(tài)所遼寧沈陽1100152.東北制藥總廠遼寧沈陽110026)以擲孢酵母作為伴生菌與氧化葡萄糖酸杄菌組成新混菌體系對其產(chǎn)酸性能和特點進行了研。實驗室搖瓶結(jié)果顯示新菌系混菌狀態(tài)不同產(chǎn)酸不同,以KGA含量為4.8小菌/擲孢酵母為31:l種液接種時最有利于產(chǎn)酸增加接種生物量可提高產(chǎn)酸速度縮短發(fā)酵周期但不影響最終產(chǎn)酸量。相同條件下新菌系產(chǎn)酸能力高于現(xiàn)有菌系酸量增加5mg/ml-7發(fā)酵周期縮短6h~8h酸轉(zhuǎn)化率提4%最高產(chǎn)酸點H值下降約0.5表現(xiàn)出較大的產(chǎn)酸潛力和可修飾性。關(guān)鍵詞vC二步發(fā)酵2-酮基-L-古龍酸孢酵母氤化葡萄糖酸桿菌維生素αvc)步發(fā)酵的第二步為混菌1.2培養(yǎng)基深采用擲孢酵母、氧化葡萄糖酸發(fā)酵使L-山梨糖合成V前體2-酮基-L桿菌及巨大芽孢桿菌適合培養(yǎng)基(3)古龍酸KGA最初篩選的混菌體系為氧1.3分析方法化葡萄糖酸杄菌與條紋假單孢桿菌的組合生長曲線的測定光密度法4前者為產(chǎn)酸菌俗稱小菌)后者不產(chǎn)酸但可3.22-酮基-L-古龍酸含量的測定:碘促進前者產(chǎn)酸也稱伴生菌寧文珠以巨大量法5芽孢桿菌代替條紋假單孢桿菌獲得成功后13.2殘?zhí)堑臏y定蔥酮試劑法6經(jīng)不斷改進目前生產(chǎn)上大多使用的混菌體系為巨大芽孢桿菌和小菌的組合使糖酸轉(zhuǎn)2結(jié)果與討論化率已由最初的39.7%(糖濃度7%6d)膿提高到79.5%(2。本文以擲孢酵母為伴生菌與小菌組成新菌系具有較強的抗酸能力酸2.1新組合菌系產(chǎn)酸性能和特點轉(zhuǎn)化率提高發(fā)酵周期縮短表現(xiàn)出較大的產(chǎn)將擲孢酵母與小菌按適當(dāng)比例混合接酸澘力和可修飾性。種28℃振荔(180/min)養(yǎng)每4h取樣測定菌濃、酸量、殘?zhí)呛蚿H值,得新菌系混菌生1材料與方法長代謝曲線圖1)由圖可見接種后二菌均有一個適應(yīng)期發(fā)酵前20h內(nèi)KGA合成較慢相應(yīng)的L-山梨糖下降速度也很慢這時1.1菌株菌均處于適應(yīng)期和指數(shù)前期發(fā)酵20h后1.1.1擲孢酵母( Sporobolomyces roseus),Y4由中科院生態(tài)研究所菌種室提供中國煤化工快KGA的積累速度指數(shù)期4h左右1.2.巨大芽孢桿菌( Bacillus megaterium)CNMH平KCA積累量達(dá)最和氧化葡萄酸桿菌 Gluconobacter oxydans),高以后合成速度變慢基本趨于停滯。發(fā)酵2980由東北制藥總廠提供。過程中pH值由開始的6.5升到7.8左右隨KGA的大量產(chǎn)生pH值又開始下降,直至收稿日期2000-08-05修回日期2001-035.4左右作者簡介抻崇-)女講師碩士現(xiàn)在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物事生物技術(shù)研究。將新組合菌系與現(xiàn)有菌系發(fā)酵特性進行